專利名稱：一種產(chǎn)酯酶腸桿菌、其酯酶和基因及其在制備紫杉醇手性前體中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明具體涉及一種產(chǎn)立體選擇性酯酶的腸桿菌，該酯酶蛋白質(zhì)，編碼該酯酶的基因，含有該基因的重組載體和重組表達(dá)轉(zhuǎn)化體，所述酯酶及其重組酯酶的制備方法，以及所述腸桿菌整細(xì)胞，或所述酯酶，或其重組酯酶作為催化劑在制備紫杉醇手性前體(2S，3R)-苯基縮水甘油酸甲酯中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
光學(xué)活性的苯基縮水甘油酸甲酯是一種重要的手性砌塊，(2S，3R)_苯基縮水甘油酸甲酯可以用于合成抗癌藥物紫杉醇的側(cè)鏈，也可以作為手性藥物黃皮酰胺的起始材料。紫杉醇具有良好的抗腫瘤活性，對(duì)于卵巢癌、乳腺癌、肺癌、白血病、腸胃癌等多種癌癥具有良好的治療作用，而黃皮酰胺具有促智作用，是一種抗老年癡呆藥物。如何獲得單一構(gòu)型的光學(xué)純苯基縮水甘油酸甲酯已成為人們所關(guān)注和研究的重要課題。目前光學(xué)純紫杉醇手性前體苯基縮水甘油酸甲酯的制備方法主要分為化學(xué)不對(duì)稱合成法和酶促拆分法。化學(xué)不對(duì)稱合成法主要是α，β_不飽和酮或酯的不對(duì)稱環(huán)氧化(Journal of Organic Chemistry, 2004, 69:4216-4226;Chemistry-An AsianJournal, 2007, 2:257-264 和 Advanced Synthesis&Catalysis, 2009, 351:1685-1691)。然而這種方法合成的是(2R，3S)_構(gòu)型的苯基縮水甘油酸甲酯。酶促拆分法包括苯基縮水甘油酸甲酯的轉(zhuǎn)酯化拆分以及水解拆分兩種(Advanced Synthesis&Catalysis, 2001, 343:721-725和WO Patent2004087932)，苯基縮水甘油酸甲酯的轉(zhuǎn)酯化拆分法選擇性低，產(chǎn)物分離困難。Zheng等用惡臭假單胞菌(Peseudomonas putida)整細(xì)胞為催化劑,催化苯基縮水甘油酸甲酯的水解拆分，30°C反應(yīng)12h得到了對(duì)映體過量值(ee)為99%的(2S，3R)-苯基縮水甘油酸甲酯(Journal of Molecular Catalysis B:Enzymatic, 2006，43:133-136)。盡管如此，該方法底物濃度較低，僅為50 60mM左右、催化劑活性差，反應(yīng)時(shí)間較長，不適宜于工業(yè)化應(yīng)用。

發(fā)明內(nèi)容
因此，本發(fā)明要解決的技術(shù)問題就是針對(duì)現(xiàn)有的酯酶催化紫杉醇手性前體苯基縮水甘油酸甲酯水解拆分反應(yīng)時(shí)酶催化活性偏低、底物耐受性差、反應(yīng)時(shí)間長等問題，提供一種催化活性高、對(duì)映選擇性好、底物耐受性好、反應(yīng)時(shí)間短的腸桿菌菌株(Enterobactersp. ) ECU 1107以及該酯酶蛋白質(zhì)，編碼該酯酶蛋白質(zhì)的基因，含有該基因的重組表達(dá)載體，含有該載體的重組表達(dá)轉(zhuǎn)化體以及該重組酯酶的制備方法。本發(fā)明還公開了利用上述腸桿菌菌株、酯酶和重組表達(dá)轉(zhuǎn)化體作為催化劑，催化拆分水解反應(yīng)制備紫杉醇手性前體(2S, 3R)-苯基縮水甘油酸甲酯的方法。為解決上述技術(shù)問題,本發(fā)明采取的技術(shù)方案之一是一種腸桿菌(Enterobactersp. )ECU 1107，其保藏編號(hào)為 CGMCC No. 5981。
本發(fā)明人從中國上海、江蘇、浙江、山東、黑龍江、海南等省市以及越南順化等地采集土樣，從土壤微生物中經(jīng)過初篩、復(fù)篩和分離純化，得到一種能夠選擇性催化苯基縮水甘油酸甲酯對(duì)映選擇性水解制備(2S，3R)_苯基縮水甘油酸甲酯的腸桿菌，將其命名為腸桿菌(Enterobacter sp. ) EQJ 1107。該菌株已于2012年4月10日保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(CGMCC)，保藏號(hào)為CGMCC No. 5981。本發(fā)明所述的腸桿菌具有如下微生物學(xué)特征(I)形態(tài)特征短桿菌，革蘭氏染色陰性，具有周身鞭毛幫助運(yùn)動(dòng)，大小約為長I. 2 3. O μ m、寬O. 6 I. O μ m。(2)固體平板培養(yǎng)基上的菌落特征(30°C培養(yǎng)48h)該菌株呈粘液狀，濕潤、光滑，乳白色?！?3)生長環(huán)境該菌株可在溫度15 40°C范圍內(nèi)生長，在pH5 9，NaCl濃度O 7%(w/v)的環(huán)境中生存。其中所述腸桿菌(Enterobacter sp. ) ECU 1107的培養(yǎng)基成分包括葡萄糖含量較佳地為I 20g/L，優(yōu)選地為10g/L，蛋白胨含量較佳地為I 20g/L，優(yōu)選地為5g/L，酵母膏含量較佳地為I 20g/L，優(yōu)選地為5g/L，KH2PO4含量較佳地為O. I 3g/L，優(yōu)選地為lg/L，MgSO4含量較佳地為O. I 3g/L，優(yōu)選地為O. 5g/L，NaCl含量較佳地為O. I 3g/L，優(yōu)選地為lg/L，pH較佳地為5 8，優(yōu)選地為7，115°C滅菌30分鐘。所述腸桿菌(Enterobacter sp. ) ECU 1107的培養(yǎng)方法較佳地包括搖瓶培養(yǎng)其中，所述搖瓶裝液量較佳地為10 30%，優(yōu)選地為20% (v/v)，接種量較佳地為I 10%，優(yōu)選地為1%(ν/ν)，培養(yǎng)溫度較佳地為20 40°C，優(yōu)選地為25 35°C，搖床轉(zhuǎn)速100 200rpm，優(yōu)選地為180rpm，培養(yǎng)時(shí)間較佳地為I 3天,優(yōu)選地為24小時(shí),培養(yǎng)液離心、洗滌之后得到菌體。所述腸桿菌(Enterobacter sp. )EOJ 1107的培養(yǎng)方法較佳地還包括發(fā)酵罐培養(yǎng)培養(yǎng)基與搖瓶培養(yǎng)相同。發(fā)酵罐裝液量較佳地為40 60%(v/v)，115°C滅菌30分鐘，接入5 10% (v/v)種子培養(yǎng)液，培養(yǎng)溫度較佳地為25 35°C，pH較佳地為6. O 8. 0，通氣量較佳地為2. O 4. OL/min,攪拌轉(zhuǎn)速較佳地為200 400轉(zhuǎn)/分，發(fā)酵的時(shí)間較佳地為12 36小時(shí)，發(fā)酵液離心收集菌體。為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采取的技術(shù)方案之二是一種分離的蛋白質(zhì)，其是如下(a)或(b)的蛋白質(zhì)(a)其氨基酸序列如序列表中SEQ ID No:2所示的蛋白質(zhì)；(b)在(a)中的氨基酸序列中經(jīng)過取代、缺失或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基且具有酯酶活性的由(a)衍生的蛋白質(zhì)。其中所述的其氨基酸序列如序列表中SEQ ID No:2所示的蛋白質(zhì)可以從腸桿菌(Enterobacter sp. )E⑶1107中分離獲得,也可以從重組表達(dá)該蛋白質(zhì)的表達(dá)轉(zhuǎn)化體中分離獲得，也可以人工合成獲得。蛋白質(zhì)(b)是在(a)的氨基酸序列中經(jīng)過取代、缺失或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸且具有酯酶活性的由(a)衍生的蛋白質(zhì)。其中所述的“幾個(gè)”是指二個(gè)至小于100個(gè)，更佳的小于30個(gè)。較佳地包括添加一個(gè)外分泌信號(hào)肽的融合蛋白，本發(fā)明發(fā)現(xiàn)這樣的融合蛋白同樣具有酯酶活性。也就是說，只要由(a)衍生的蛋白質(zhì)具有酯酶活性，且衍生方式如上所述，都可以達(dá)到本發(fā)明的發(fā)明目的。為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采取的技術(shù)方案之三是一種分離的核酸，其是如下(I)或⑵的核酸(I)其核苷酸序列如序列表中SEQ ID No: I所示的核酸；(2)編碼如下蛋白質(zhì)(a)或(b)的基因(a)其氨基酸序列如序列表中SEQ ID No:2所示的蛋白質(zhì)；
(b)在(a)中的氨基酸序列經(jīng)過取代、缺失或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸且具有酯酶活性的由(a)衍生的蛋白質(zhì)。本發(fā)明所述核苷酸序列如SEQ ID No: I所示的核酸較佳地包括從腸桿菌(Enterobacter sp. )EOJ 1107基因組中分離獲得,從含有該SEQ ID No:l所示核苷酸序列的重組表達(dá)載體中或重組轉(zhuǎn)化體中分離獲得，也可以全基因人工合成獲得。本發(fā)明所述核酸的來源較佳地為根據(jù)Genbank中收錄的Enterobacter cloacaesubsp. cloacae ATCC 13047的全基因組序列中預(yù)測(cè)為酯酶基因(GeneID :9126831)的序列設(shè)計(jì)合成引物，以腸桿菌(Enterobacter sp) ECU1107基因組DNA為模板，通過PCR方法獲得所述核苷酸序列。本發(fā)明所述核酸的來源優(yōu)選地為設(shè)計(jì)PCR引物如下上游引物5’-CGCGGATCCATGTCTACGCTCCTCTACCTGCAT-3’ ；下游引物5，-CCCAAGCTTTCAGAGGCTGTGCAGTCCAA-3>；其中，上游引物(其序列如序列表中SEQ ID NO:3所示)下劃線部分為BamH I酶切位點(diǎn)，下游引物(其序列如序列表中SEQ ID N0:4所示)下劃線部分為HindIII酶切位點(diǎn)。然后以腸桿菌(Enterobacter sp. ) ECU 1107的基因組DNA為模板，利用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)進(jìn)行DNA擴(kuò)增，獲得完整的酯酶基因全長DNA序列。本發(fā)明中，其核苷酸序列如序列表中SEQ ID No: I所示的酯酶基因，命名為EnEstOI，全長582bp。其中，其編碼序列(OTS)從第I個(gè)堿基起至第579個(gè)堿基止，起始密碼子為ATG，終止密碼子為TGA。該序列不包含內(nèi)含子，其編碼的蛋白質(zhì)的氨基酸序列如序列表中SEQ ID No:2所示。如本領(lǐng)域技術(shù)人員所知，由于密碼子的簡(jiǎn)并性，編碼SEQ ID No:2的氨基酸序列的核苷酸序列不僅僅局限于序列表中SEQ ID No: I所示的核苷酸序列。本發(fā)明的酯酶基因的核苷酸序列也可以是編碼具有序列表中SEQ IDNo:2所示氨基酸序列的蛋白質(zhì)的其他任何核苷酸序列。所述核苷酸序列還包括通過適當(dāng)引入替換、缺失或插入形成的多聚核苷酸的同系物。所述多聚核苷酸的同系物可以通過對(duì)核酸序列SEQ ID No: I的一個(gè)或多個(gè)堿基在保持酯酶活性范圍內(nèi)進(jìn)行替換、缺失或增加來制得。SEQ ID No: I的同系物也指啟動(dòng)子變體。在所述的核酸序列之前的啟動(dòng)子或信號(hào)序列可通過一個(gè)或多個(gè)核酸的替換、插入或缺失而改變，但這些改變對(duì)啟動(dòng)子的功能沒有負(fù)面影響。而且通過改變啟動(dòng)子的序列或甚至用來自不同種生物體的更有效的啟動(dòng)子完全替換，可提高目標(biāo)蛋白的表達(dá)水平。SEQ ID No: I的同系物還包括一類具有在標(biāo)準(zhǔn)條件下能夠與SEQ ID No: I所示序列的多聚核酸進(jìn)行雜交的堿基序列的多聚核酸，所述標(biāo)準(zhǔn)條件下進(jìn)行的雜交可根據(jù)《分子克隆》(Cold Spring Harbor Laboratory Press)記載的分子生物學(xué)中的通用方案(Current Protocols in Molecular Biology)所述的方式進(jìn)行。為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采取的技術(shù)方案之四是一種包含如上所述的核酸的重組表達(dá)載體。其中所述重組表達(dá)載體可通過本領(lǐng)域常規(guī)方法將本發(fā)明的所述的酯酶基因或其突變體的核苷酸分子連接于各種表達(dá)載體上構(gòu)建而成。所述的表達(dá)載體包括本領(lǐng)域常規(guī)的各種載體。所述載體較佳地包括各種質(zhì)粒、粘粒、噬菌體或病毒載體等，所述載體優(yōu)選地為質(zhì)粒 pET28a。所述重組表達(dá)載體的構(gòu)建方法為本領(lǐng)域常規(guī)質(zhì)?？寺》椒āＫ隹寺》椒ㄝ^佳地為將前述通過PCR擴(kuò)增所得的核酸產(chǎn)物與表達(dá)載體pET28a分別用限制性內(nèi)切酶BamH I和HindIII雙酶切，形成互補(bǔ)的粘性末端，經(jīng)T4 DNA連接酶連接，形成含有本發(fā)明所述的酯 酶基因的重組表達(dá)質(zhì)粒，將其命名為pET-EnEstOl。為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采取的技術(shù)方案之五是一種包含如上所述的重組表達(dá)載體的重組表達(dá)轉(zhuǎn)化體。其中所述重組表達(dá)轉(zhuǎn)化體的制備方法較佳地為將如上所述的重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化至宿主微生物中制得。所述的宿主微生物較佳地為本領(lǐng)域常規(guī)的各種宿主微生物，只要能滿足使上述重組表達(dá)載體穩(wěn)定地自行復(fù)制，且所攜帶的酯酶基因可被有效表達(dá)即可。其中所述宿主微生物較佳地為大腸埃希氏菌(E. coli)，更佳地為大腸埃希氏菌BL21(DE3)或大腸埃希氏菌DH5a。將前述重組表達(dá)質(zhì)粒pET-EnEstOl轉(zhuǎn)化至大腸埃希氏BL21(DE3)中，即可得本發(fā)明優(yōu)選的基因工程菌株，即大腸埃希氏菌BL21 (DE3) /pET-EnEstO I。所述轉(zhuǎn)化方法為本領(lǐng)域常規(guī)轉(zhuǎn)化方法，其較佳地包括化學(xué)轉(zhuǎn)化法，熱激法或電轉(zhuǎn)法。為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采取的技術(shù)方案之六是一種重組酯酶的制備方法，其包括如下步驟培養(yǎng)如上所述的重組表達(dá)轉(zhuǎn)化體，從培養(yǎng)物中獲得重組表達(dá)的酯酶。其中，所述的重組表達(dá)轉(zhuǎn)化體的制備方法同前述介紹，可通過將本發(fā)明的重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化至宿主細(xì)胞得到。所述的培養(yǎng)重組表達(dá)轉(zhuǎn)化體中所用的培養(yǎng)基可以是本領(lǐng)域常規(guī)的任何可使轉(zhuǎn)化體生長并產(chǎn)生本發(fā)明的酯酶的培養(yǎng)基，對(duì)于大腸桿菌菌株，優(yōu)選LB培養(yǎng)基(其配方為蛋白胨10g/L，酵母膏5g/L，NaCl 10g/L, pH 7.0)。培養(yǎng)方法和培養(yǎng)條件沒有特殊的限制，可以根據(jù)宿主類型和培養(yǎng)方法等因素的不同按本領(lǐng)域普通知識(shí)進(jìn)行適當(dāng)?shù)倪x擇，只要能使轉(zhuǎn)化體生長并產(chǎn)生本發(fā)明的酯酶即可。對(duì)于本發(fā)明所述菌株大腸埃希氏菌BL21 (DE3)/pET-EnEst01，培養(yǎng)方法優(yōu)選地包括將本發(fā)明所述的重組大腸埃希氏菌接種至含有卡那霉素的LB培養(yǎng)基中30 40°C，150 200rpm培養(yǎng)，培養(yǎng)液的吸光密度OD6tltl較佳地為0. 5^0. 7，優(yōu)選地為0. 6時(shí)，加入異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)進(jìn)行誘導(dǎo)，培養(yǎng)基中IPTG的終濃度較佳地為0. ΟΓ . OmmoI/L,優(yōu)選地為0. lmmol/L,誘導(dǎo)時(shí)間較佳地為10 24小時(shí)，優(yōu)選地為12 16小時(shí)。所述重組酯酶的制備方法還包括誘導(dǎo)表達(dá)結(jié)束后，培養(yǎng)液離心，得到靜息細(xì)胞，將細(xì)胞重懸于緩沖液中，在冰浴狀態(tài)下超聲破碎，離心收集上清液，即得重組酯酶的粗酶液，所述緩沖液較佳地為磷酸鹽緩沖液。將所得粗酶液放入-80°C冰箱預(yù)凍過夜，真空條件下冷凍干燥，即得重組酯酶粗酶粉。所述真空條件較佳地為真空度0. I 0. 2mbar，冷凍干燥的溫度較佳地為-50 _80°C，冷凍干燥的時(shí)間較佳地為24 48h。所述重組酯酶活力的測(cè)定方法較佳地包括如下步驟移取300 μ I適量稀釋的制備的粗酶液，加入2. 67ml磷酸鉀緩沖液(KPB，100mmol/L,pH7. O)中，在30°C預(yù)保溫3分鐘后，加入30 μ I對(duì)硝基苯酚丁酸酯(ρΝΡΒ)的DMSO溶液(lOOmmol/L)，使pNPB的終濃度為lmmol/L,于30°C、405nm測(cè)定對(duì)硝基苯酚吸光度的增長速率。在上述反應(yīng)條件下，每分鐘生成I. O μ mol對(duì)硝基苯酚所需要的酶量，定義為一個(gè)酶活力單位(U)，制備所得的重組酯酶命名為EnEstOl重組酯酶。為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采取的技術(shù)方案之七是一種酯酶的制備方法，其方法包括以下步驟(I)培養(yǎng)如前所述的腸桿菌，將其培養(yǎng)混合物離心后獲得腸桿菌整細(xì)胞；或

(3)將步驟(2)所得酯酶粗酶液冷凍干燥后制備成酯酶粗酶粉。其中步驟(I)中所述發(fā)酵培養(yǎng)腸桿菌的方法如上文所述，其中所述離心的速度較佳地為800(Tl0000rpm，離心的時(shí)間較佳地為15 30min。其中步驟(2)所述腸桿菌整細(xì)胞破碎的方法為本領(lǐng)域常規(guī)的細(xì)胞破碎方法。所述腸桿菌整細(xì)胞的破碎方法較佳地包括將收獲的腸桿菌濕菌體用50(Tl000ml磷酸鹽緩沖液(10mM，pH 7.0)重新懸浮，冰浴狀態(tài)下超聲破碎，離心收集上清液即得所述腸桿菌酯酶。其中所述離心的速度較佳地為800(Tl0000rpm，優(yōu)選地為9000rpm，離心時(shí)間較佳地為2(T30min，優(yōu)選為20分鐘。其中步驟(3)所述的粗酶液冷凍干燥的方法為本領(lǐng)域常規(guī)的冷凍干燥方法。本發(fā)明所述粗酶液的冷凍干燥方法較佳地為將步驟(2)所得腸桿菌酯酶粗酶液放入_80°C冰箱預(yù)凍過夜，真空條件下冷凍干燥，真空度較佳地為0. I 0. 2mbar,冷凍溫度較佳地為-50 _80°C，冷凍干燥的時(shí)間較佳地為24 48h，即得腸桿菌酯酶粗酶粉。為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采取的技術(shù)方案之八是如上所述的腸桿菌，或如上所述的蛋白質(zhì)，或如上所述的重組表達(dá)轉(zhuǎn)化體在制備(2S，3R)-苯基縮水甘油酸甲酯中的用途。其中所述的用途較佳地為，如上所述的腸桿菌，或如上所述的蛋白質(zhì)，或如上所述的重組表達(dá)轉(zhuǎn)化體表達(dá)的重組酯酶作為催化劑，在酶促拆分制備手性藥物紫杉醇合成前體(2S，3R)_苯基縮水甘油酸甲酯中的用途。為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采取的技術(shù)方案之九是一種(2S，3R)-苯基縮水甘油酸甲酯的制備方法，所述的制備方法包括在有機(jī)溶劑和水相緩沖液構(gòu)成的兩相體系中，在如上所述的腸桿菌，或蛋白質(zhì)的催化下，消旋底物(±)_苯基縮水甘油酸甲酯進(jìn)行水解拆分反應(yīng)，形成(2S，3R)-苯基縮水甘油酸甲酯。其中所述(2S，3R)-苯基縮水甘油酸甲酯的制備方法較佳地包括將上述培養(yǎng)得到的腸桿菌(Enterobacter sp. ) E⑶1107濕細(xì)胞或上述重組酯酶蛋白質(zhì)作為催化劑，以(±)_苯基縮水甘油酸甲酯為底物，在有機(jī)溶劑和水相緩沖液構(gòu)成的兩相體系中進(jìn)行水解拆分反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后收集有機(jī)相，即得(2S，3R)-苯基縮水甘油酸甲酯。其中所述(±)_苯基縮水甘油酸甲酯底物的濃度較佳地為10 600禮，所述催化劑為前述腸桿菌(Enterobacter sp. ) ECU 1107的濕細(xì)胞時(shí)，其用量較佳地為20 250g濕細(xì)胞/L，所述催化劑為前述重組酯酶的蛋白質(zhì)時(shí)，其用量較佳地為O. 2 4kU重組酯酶/L(反應(yīng)液總體積)。所述水相緩沖液優(yōu)選地為磷酸鹽緩沖液，所述有不溶于水的機(jī)溶劑較佳地為異丙醚、正己烷、環(huán)己烷或異辛烷，其優(yōu)選地為異辛烷。所述不溶于水的有機(jī)溶劑-水兩相的體積比較佳地為I : 9 9 : I，其優(yōu)選地為I : 4 2 : I (v/v)。所述反應(yīng)的反應(yīng)溫度較佳地為20 50°C，優(yōu)選地為30 40°C。所述反應(yīng)的pH值較佳地為pH5 8，優(yōu)選地為pH 6 7，所述反應(yīng)的時(shí)間較佳地為2 48小時(shí)。所述(2S，3R)_苯基縮水甘油酸甲酯的制備方法更佳地還包括純化步驟。所述純化步驟較佳地包括反應(yīng)結(jié)束后，離心取得有機(jī)相，水相用乙酸乙酯萃取，合并有機(jī)相，用飽和食鹽水洗滌，再加無水 硫酸鈉干燥后，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)去除有機(jī)溶劑，再經(jīng)過硅膠柱層析分離純化，即得(2S，3R)-苯基縮水甘油酸甲酯，所述(2S，3R)-苯基縮水甘油酸甲酯即為手性藥物紫杉醇合成前體。在符合本領(lǐng)域常識(shí)的基礎(chǔ)上，上述各優(yōu)選條件，可任意組合，即得本發(fā)明各較佳實(shí)例。本發(fā)明所用試劑和原料均市售可得。本發(fā)明的積極進(jìn)步效果在于利用本發(fā)明所提供的腸桿菌整細(xì)胞和重組酯酶催化制備(2S，3R)-苯基縮水甘油酸甲酯，其反應(yīng)工藝簡(jiǎn)單，反應(yīng)條件溫和，催化效率高，產(chǎn)物光學(xué)純度好，對(duì)映體過量值(ee) >99%，收率接近50%的理論最大收率，具有較好的工業(yè)應(yīng)用前
旦
-5^ O牛物材料保藏信息本發(fā)明提供的腸桿菌(Enterobacter sp. )ECU 1107菌株，已于2012年4月10日保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(CGMCC)，保藏地址北京市朝陽區(qū)北辰西路I號(hào)院3號(hào)，郵編:100101。該菌株的保藏編號(hào)為=CGMCC No. 5981。


圖I為EnEstOl基因的PCR擴(kuò)增DNA片段電泳圖譜，其中I. DNAMarker (MarkerIV，北京天根生化科技有限公司);2. EnEstOl基因的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。圖2為重組大腸埃希氏菌(E. coli)DH5 a /pET-EnEstOI的菌液PCR擴(kuò)增電泳圖，其中1. DNA Marker (Marker IV,北京天根生化科技有限公司)；2 3.重組大腸埃希氏菌(E. coli)DH5 a /pET-EnEstOI 的菌液 PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物。圖3為重組大腸埃希氏菌(E. coli)BL21 (DE3)/pET-EnEstOI的菌液PCR擴(kuò)增電泳圖。其中1. DNA Marker (Marker IV,北京天根生化科技有限公司)；2 3.重組大腸埃希氏菌(E. Co I i) BL21 (DE3) /pET-EnEstO I 的菌液 PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物。圖4為重組表達(dá)質(zhì)粒pET-EnEstOl的構(gòu)建示意圖。圖5為EnEstOl重組酯酶的SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳圖。
具體實(shí)施例方式下面通過實(shí)施例的方式進(jìn)一步說明本發(fā)明，但并不因此將本發(fā)明限制在所述的實(shí)施例范圍之中。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，按照常規(guī)方法和條件，或按照商品說明書選擇。
實(shí)施例I腸桿菌(Enterobacter sp. ) CGMCC 5981的搖瓶培養(yǎng)在250ml搖瓶中裝入50ml培養(yǎng)基,其培養(yǎng)基組成如下葡萄糖IOg,蛋白胨5g,酵母膏 5g，KH2P04 I. OgjMgSO4 O. 5g,NaCl I. 0g，自來水 1000ml，pH 自然。將菌株 CGMCC 5981接種到搖瓶中，在30°C，180rpm條件下預(yù)培養(yǎng)12小時(shí)作為種子液，將種子液以1%(ν/ν)的接種量轉(zhuǎn)入裝有IOOml相同培養(yǎng)基的500ml搖瓶中，在30°C，180rpm條件下培養(yǎng)24小時(shí)，酶產(chǎn)量為123U/L。培養(yǎng)結(jié)束后，于9，OOOrpm離心得到含酯酶濕菌體。實(shí)施例2腸桿菌(Enterobacter sp. ) CGMCC 5981的發(fā)酵罐培養(yǎng)種子培養(yǎng)與實(shí)施例I相同。在5L發(fā)酵罐中裝入3L培養(yǎng)基，其組成如下葡萄糖60g，蛋白胨 30g，酵母膏 30g，KH2PO4 3. 0g, MgSO4 I. 5g, NaCl 3. 0g，自來水 3L，pH 7. 0o 培養(yǎng)基滅菌后，接入預(yù)培養(yǎng)12小時(shí)的種子液200ml,在30°C、400rpm和Ivvm條件下通氣發(fā)酵，其間在4 12小時(shí)勻速流加甘油(8ml/h)，若產(chǎn)生泡沫則滴加泡敵(1%水溶液，w/v，購自上海飛達(dá)貿(mào)易有限公司)，進(jìn)行消泡。發(fā)酵12小時(shí)后放罐。培養(yǎng)結(jié)束后，于9，OOOrpm離心得 到含酯酶濕菌體，產(chǎn)酶量達(dá)830U/L。實(shí)施例3EnEst01酯酶基因的克隆根據(jù)Genbank 收錄的預(yù)測(cè)為 Enterobacter cloacae subsp. cloacac ATCC13047酯酶的基因序列(GeneID :9126831)為依據(jù)，設(shè)計(jì)PCR引物如下上游引物為5’-CGCGGATCCATGTCTACGCTCCTCTACCTGCAT-3’ ；下游引物為5’-CCCAAGCTTTCAGAGGCTGTGCAGTCCAA-3，。其中，上游引物(其序列如序列表中SEQ ID NO:3所示)下劃線部分為BamH I酶切位點(diǎn)，下游引物(其序列如序列表中SEQ ID N0:4所示)下劃線部分為HindIII酶切位點(diǎn)。以腸桿菌(Enterobacter sp. ) ECU 1107的基因組DNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR體系為2XTaq PCR MasterMix 15 μ 1，上游引物和下游引物各 I μ I (0. 6 μ mol/L)，DNA模板 2 μ I (0· I μ g)和 ddH2011 μ I。PCR 擴(kuò)增程序?yàn)?I) 95°C，預(yù)變性 8min ； (2) 94°C，變性Imin ; (3)59°C，退火 Imin ; (4) 72°C，延伸 I. 5min ;步驟(2) (4)重復(fù) 30 次；(5) 72°C，繼續(xù)延伸lOmin，冷卻至4V。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳純化，利用瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒回收500 700bp區(qū)間的目標(biāo)條帶，其電泳圖譜如圖I所示。獲得一條完整的腸桿菌(Enterobacter sp. ) EQJ 1107酯酶全長基因序列DNA片段,經(jīng)DNA測(cè)序,全長582bp,將該基因命名為EnEstOl，其喊基序列如序列表中SEQ IDNo: I所不。實(shí)施例4EnEst01酯酶重組表達(dá)載體和重組表達(dá)轉(zhuǎn)化體的制備將實(shí)施例3所得的酯酶基因DNA片段在37°C用限制性內(nèi)切酶BamH I和HindIII雙酶切20h，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳純化，利用瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒(北京天根生化科技有限公司)回收目標(biāo)片段。將目標(biāo)片段在T4 DNA連接酶的作用下，與同樣經(jīng)BamH I和HindIII酶切后的質(zhì)粒pET28a (上海Novagen公司),在4°C下連接過夜得到重組表達(dá)質(zhì)粒pET-EnEstOI ο將上述重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸埃希氏菌(E. coli)DH5a感受態(tài)細(xì)胞中，在含有卡那霉素的抗性平板上對(duì)陽性重組體進(jìn)行篩選，挑取單克隆，菌落PCR驗(yàn)證陽性克隆，PCR條件如實(shí)施例3所述，其結(jié)果如圖2所示。培養(yǎng)重組菌，待質(zhì)粒擴(kuò)增后提取質(zhì)粒，重新轉(zhuǎn)化至大腸埃希氏菌(E. coli)BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞中，轉(zhuǎn)化液涂布到卡那霉素的LB平板上，37°C倒置培養(yǎng)過夜，即獲得陽性重組轉(zhuǎn)化體大腸埃希氏菌(E. coli)BL21(DE3)/pET-EnEstOl，菌落PCR驗(yàn)證陽性克隆，其結(jié)果如圖3所示。所述pET-EnEstOl質(zhì)粒的構(gòu)建策略如圖4所示。實(shí)施例5EnEst01重組酯酶的表達(dá)將實(shí)施例4所得的重組大腸桿菌，接種至含卡那霉素的LB培養(yǎng)基(蛋白胨10g，酵母膏5g，NaCl 10g，去離子水1000ml，pH 7.0)中，37°C振蕩培養(yǎng)過夜，按1%(ν/ν)的接種量接入裝有100ml LB培養(yǎng)基的500ml搖瓶中，置于37°C、180rpm的搖床中振蕩培養(yǎng)，當(dāng)培養(yǎng)液的OD6tltl達(dá)到O. 6時(shí)，加入終濃度為O. lmmol/L的IPTG作為誘導(dǎo)劑，25°C誘導(dǎo)12h后，將培養(yǎng)液離心，收集細(xì)胞，并用生理鹽水洗滌兩次，得靜息細(xì)胞。將所得的靜息細(xì)胞懸浮于15ml pH 7.0的緩沖液中，在冰浴中超聲破碎，離心收集上清液，即為重組酯酶的粗酶液。所述重組酯酶活力的測(cè)定方法移取300μ I適量稀釋的制備的粗酶液，加入 2.67ml磷酸鉀緩沖液(KPB, IOOmmoI/L, ρΗ7· 0)中，在30°C預(yù)保溫3分鐘后，加入30 μ I對(duì)硝基苯酚丁酸酯(ρΝΡΒ)的DMSO溶液(100mmol/L)，使pNPB的終濃度為lmmol/L，于30°C、405nm測(cè)定對(duì)硝基苯酚吸光度的增長速率。在上述反應(yīng)條件下，每分鐘生成I. O μ mol對(duì)硝基苯酚所需要的酶量，定義為一個(gè)酶活力單位(U)。經(jīng)檢測(cè),所得重組酯酶的活力為52. 5U/ml,將其命名為EnEstOl重組酯酶。所得粗酶液經(jīng)SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳圖分析，其結(jié)果如圖5所示。實(shí)施例6不同重組酯酶催化苯基縮水甘油酸甲酯的水解按照實(shí)施例3 5所述的方法以不同的酯酶基因序列設(shè)計(jì)引物，以腸桿菌(Enterobacter sp. )ECU 1107的基因組DNA為模板，通過PCR方法得到七條酯酶基因的完整序列，將其克隆到pET28a質(zhì)粒后，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞，獲得到一系列重組酯酶靜息細(xì)胞。將一定的濕菌體量加入到2ml pH為6. O的磷酸鹽緩沖液中，加入同等體積的底物苯基縮水甘油酸甲酯濃度為lOmmol/L的異辛烷中，30°C，180rpm，反應(yīng)一段時(shí)間。收集有機(jī)相，經(jīng)無水硫酸鎂干燥處理后，進(jìn)行色譜分析。反應(yīng)轉(zhuǎn)化率和剩余底物的對(duì)映體過量值(ees)采用液相色譜分析，分析方法為手性[hira丨Cef3AD-H柱(04.6 min><250 mm,日本Daicel公司);流動(dòng)相正己烷/異丙醇(80:20, v/v)，流速為0. 8ml/min;紫外檢測(cè)，波長254nm;柱溫25° C。出峰時(shí)間(2S，3R)_苯基縮水甘油酸甲酯，8. 2min ;(2R，3S)_苯基縮水甘油酸甲酯，9. lmin。以液相色譜儀檢測(cè)反應(yīng)的轉(zhuǎn)化率和剩余底物的光學(xué)純度，其結(jié)果如表I所示。表I重組酯酶的催化性能比較
權(quán)利要求
1.一種腸桿菌(Enterobacter sp. ) ECU 1107，其保藏編號(hào)為 CGMCC No. 5981。
2.一種分離的蛋白質(zhì)，其特征在于其是如下(a)或(b)的蛋白質(zhì) (a)其氨基酸序列如序列表中SEQID No:2所示的蛋白質(zhì)； (b)在(a)中的氨基酸序列中經(jīng)過取代、缺失或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基且具有酯酶活性的由(a)衍生的蛋白質(zhì)。
3.一種分離的核酸，其特征在于，其是如下(I)或(2)的核酸 (1)其核苷酸序列如序列表中SEQID No: I所示的核酸； (2)編碼如下蛋白質(zhì)(a)或(b)的基因 (a)其氨基酸序列如序列表中SEQID No:2所示的蛋白質(zhì)； (b)在(a)中的氨基酸序列經(jīng)過取代、缺失或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸且具有酯酶活性的由(a)衍生的蛋白質(zhì)。
4.一種包含如權(quán)利要求3所述的核酸的重組表達(dá)載體。
5.一種包含如權(quán)利要求4所述的重組表達(dá)載體的重組表達(dá)轉(zhuǎn)化體。
6.一種重組酯酶的制備方法，其特征在于，該制備方法包括培養(yǎng)如權(quán)利要求5所述的重組表達(dá)轉(zhuǎn)化體，從培養(yǎng)物中獲得重組表達(dá)的酯酶。
7.一種酯酶的制備方法，其特征在于，其方法包括以下步驟 (1)培養(yǎng)權(quán)利如要求I所述的腸桿菌，將其培養(yǎng)混合物離心后獲得腸桿菌整細(xì)胞；或 (2)將步驟(I)所得腸桿菌整細(xì)胞破碎后制備成酯酶粗酶液；或 (3)將步驟(2)所得酯酶粗酶液冷凍干燥后制備成酯酶粗酶粉。
8.如權(quán)利要求I所述的腸桿菌，或如權(quán)利要求2所述的蛋白質(zhì)，或如權(quán)利要求5所述的重組表達(dá)轉(zhuǎn)化體在制備(2S，3R)-苯基縮水甘油酸甲酯中的用途。
9.一種(2S，3R)_苯基縮水甘油酸甲酯的制備方法，其特征在于，所述的制備方法包括在不溶于水的有機(jī)溶劑和水相緩沖液構(gòu)成的兩相體系中，在權(quán)利要求I所述的腸桿菌，或權(quán)利要求2所述的蛋白質(zhì)，或如權(quán)利要求5所述的重組表達(dá)轉(zhuǎn)化體的催化下，消旋底物(±)_苯基縮水甘油酸甲酯進(jìn)行水解拆分反應(yīng)，形成(2S，3R)-苯基縮水甘油酸甲酯。
10.如權(quán)利要求9所述的制備方法，其特征在于，所述不溶于水的有機(jī)溶劑和水相緩沖液構(gòu)成的兩相體系中，不溶于水的有機(jī)溶劑為甲苯、異丙醚、正己烷、環(huán)己烷或異辛烷，不溶于水的有機(jī)溶劑-水兩相的體積比為I : 9 2 1，所述水解拆分反應(yīng)在20 50°C進(jìn)行2 48小時(shí)，反應(yīng)體系pH 5 8。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種產(chǎn)酯酶的腸桿菌，所述腸桿菌產(chǎn)生的酯酶的蛋白質(zhì)序列，該酯酶的基因，含有該基因的重組表達(dá)子和重組表達(dá)轉(zhuǎn)化體，以及重組酯酶及其制備方法。本發(fā)明還公開了利用該腸桿菌整細(xì)胞，其酯酶或其重組酯酶催化消旋(±)-苯基縮水甘油酸甲酯對(duì)映選擇性水解，制備生產(chǎn)手性紫杉醇前體(2S，3R)-苯基縮水甘油酸甲酯的用途。所述腸桿菌(Enterobacter sp.)ECU 1107的保藏編號(hào)為CGMCC No.5981。采用本發(fā)明提供的腸桿菌整細(xì)胞，其酯酶或重組酯酶催化制備紫杉醇前體，工藝簡(jiǎn)單，反應(yīng)條件溫和，催化效率高，產(chǎn)物光學(xué)純度好，對(duì)映體過量值(ee)&gt;99%，具有很好的工業(yè)應(yīng)用前景。
文檔編號(hào)C12N15/63GK102839141SQ20121033985
公開日2012年12月26日 申請(qǐng)日期2012年9月13日 優(yōu)先權(quán)日2012年9月13日
發(fā)明者許建和, 周冬杰, 潘江, 李春秀, 郁惠蕾, 鄭高偉 申請(qǐng)人:華東理工大學(xué)