專利名稱：同種異基因腫瘤治療劑的制作方法
同種異基因腫瘤治療劑本申請(qǐng)是申請(qǐng)日為2004年4月20日的第200480039664. 3號(hào)發(fā)明名稱為“同種異基因腫瘤治療劑”的中國(guó)專利申請(qǐng)的分案申請(qǐng)。本發(fā)明涉及一種用于治療腫瘤疾病的基于同種異基因腫瘤細(xì)胞的疫苗，以及一種制備這種疫苗的方法。此外，本發(fā)明還涉及轉(zhuǎn)染的人腫瘤細(xì)胞作為疫苗的用途。除了治療癌性疾病的傳統(tǒng)方法(如放療和化療,從20世紀(jì)50年代以來它們就構(gòu)成了治療進(jìn)展性和播散性腫瘤疾病的唯一選擇)之外，當(dāng)面對(duì)著轉(zhuǎn)移性腫瘤時(shí)，免疫治療似乎是一種很有如途的方法。免疫治療的目的是通過來源于基因技術(shù)領(lǐng)域的修飾技術(shù)來增強(qiáng)對(duì)抗腫瘤疾病的天然應(yīng)答，據(jù)此增加免疫系統(tǒng)對(duì)癌細(xì)胞的“警惕性”，并 提高肌體本身對(duì)抗腫瘤的防御反應(yīng)。一些惡性疾病例如進(jìn)展性腎細(xì)胞癌似乎對(duì)免疫治療的干預(yù)是相當(dāng)敏感的，但是利用細(xì)胞因子(例如IL-2和IFN-a )的全身治療有時(shí)伴有嚴(yán)重的副作用。因此，已經(jīng)發(fā)展出了其他的免疫治療方案。目前絕大多數(shù)的臨床研究都依賴于取出腫瘤、隨后用治療基因在離體轉(zhuǎn)染腫瘤細(xì)胞、照射腫瘤細(xì)胞群以及隨后重新植入經(jīng)修飾的腫瘤細(xì)胞。通過這樣的腫瘤疫苗接種，可以不同程度地增加抗腫瘤效應(yīng)，增加的程度依賴于所轉(zhuǎn)染的治療基因。根據(jù)這種方法以及試驗(yàn)動(dòng)物研究的結(jié)果，已經(jīng)批準(zhǔn)了多個(gè)I期和II期臨床研究(Finke et al. , 1997 ；Wittig et al.，2001)。但是，這些研究的初步結(jié)果表明除了對(duì)治療的較好的耐受性之外，僅僅在少數(shù)病例中觀察到了部分或完全反應(yīng)?；蜣D(zhuǎn)移⑶40L/⑶154能在結(jié)腸癌小鼠模型中誘導(dǎo)腫瘤的根除和免疫力(Sun等，2000)。本發(fā)明的申請(qǐng)者/受讓人發(fā)現(xiàn)，向腫瘤細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)移人白介素7 (IL-7)的表達(dá)質(zhì)粒導(dǎo)致了腫瘤細(xì)胞對(duì)免疫系統(tǒng)的效應(yīng)細(xì)胞的敏感性的增加，尤其是自體轉(zhuǎn)移(Finkeet al. , 1997, Cancer Gene Ther. 4:260-268)。相似地,本發(fā)明者證實(shí)，向自體腫瘤細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)移進(jìn)兩種治療基因(IL-7、GM-CSF)之后，可以在50%患者中觀察到顯著的臨床反應(yīng)(W002/060476)。從US 5，681，562的闡述中已知，給患有某些癌癥的患者體內(nèi)注射已經(jīng)以編碼細(xì)胞因子的DNA或RNA轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，可刺激患者的免疫系統(tǒng)對(duì)抗腫瘤抗原。在專利說明書中，描述了其中用編碼IL-2的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體轉(zhuǎn)染小鼠成纖維細(xì)胞的試驗(yàn)。也描述了一個(gè)體內(nèi)試驗(yàn)，其中在小鼠的結(jié)腸癌模型中測(cè)試了治療的療效。與對(duì)照組比較，經(jīng)皮下注射轉(zhuǎn)染的成纖維細(xì)胞的小鼠表現(xiàn)出明顯更慢的腫瘤生長(zhǎng)。利用人轉(zhuǎn)染成纖維細(xì)胞的體外試驗(yàn)顯示其顯著增加了 IL-2的表達(dá)水平。除了缺乏小鼠模型以外的臨床數(shù)據(jù)外，在這些試驗(yàn)中被采用作為表達(dá)載體的病毒載體也被認(rèn)為是不利的載體。減毒疫苗株的不穩(wěn)定性不能確保其不被逆轉(zhuǎn)成為有毒株，以及病毒組分本身可以是免疫原性的，這將使得患者的免疫系統(tǒng)減弱它們的療效。在此所列的這些缺點(diǎn)僅僅是病毒系統(tǒng)的缺點(diǎn)的一部分，這明顯削弱了該系統(tǒng)作為基因治療載體的用途。
一些文章顯示用細(xì)胞因子基因聯(lián)合生長(zhǎng)因子GM-CSF獲得了最佳的治療效果(Paillard，1998，Hum. Gene Ther.9:2457-2458 ；Schadendorf et al.，1995，J. Mo1.Med. 73:473-477)。GM-CSF在腫瘤抗原接種中的重要性也體現(xiàn)在其增強(qiáng)針對(duì)肽疫苗接種的臨床及免疫學(xué)的抗腫瘤應(yīng)答(Jager et al.，i996)。呈遞抗原的樹突狀細(xì)胞的活化以及對(duì)效應(yīng)細(xì)胞群的刺激似乎在這個(gè)方面起到了關(guān)鍵作用。但是，至今還不清楚哪個(gè)細(xì)胞因子基因聯(lián)合免疫原性制劑和GM-CSF能觸發(fā)最有效的抗腫瘤應(yīng)答。在小鼠試驗(yàn)中，顯示用編碼IL-7的表達(dá)構(gòu)建體的接種生成了抗腫瘤效應(yīng)(Miller et al., 1993,Blood 18:3686-3694 ；Murphy et al., 1993,J.Clin.1nvest. 92:1918-1924)。也顯示細(xì)胞毒淋巴細(xì)胞(CTL)與IL-7或IL-7轉(zhuǎn)染的細(xì)胞進(jìn)行孵·育導(dǎo)致了小鼠體內(nèi)的腫瘤消退(Jicha et al. , 1991 ；Hock et al.，1993)，以及用IL-7和B7. 1/CD80的轉(zhuǎn)染導(dǎo)致了 CD28+CD25+T細(xì)胞的浸潤(rùn)及免疫力(Cayeux et al.，1995)。至今還沒有實(shí)現(xiàn)治療的成功，甚至在小鼠模型中也沒有成功。此外，在涉及通過利用質(zhì)粒DNA或寡核苷酸序列的基因治療而刺激免疫應(yīng)答的試驗(yàn)中，觀察到某些包括CpG基序(CpG=未甲基化的胞嘧啶-鳥嘌呤二核苷酸)的核酸序列具有巨大的免疫刺激作用(Schmidt-Wolf et al. , 1989, J.1mmunol. Methods 125:185-189)?；谶@個(gè)原因，在非常早的時(shí)候，免疫刺激序列(ISS)就已經(jīng)在基于DNA的抗感染性病原體的免疫接種方案中被用作佐劑。在小鼠試驗(yàn)中，證實(shí)了注射富含CpG的DNA序列導(dǎo)致了對(duì)B細(xì)胞的強(qiáng)烈激活并刺激了某些細(xì)胞因子(例如IL-6和GM-CSF)的表達(dá)。在小鼠模型中也顯示，在腫瘤接種前3天，用CpG寡脫氧核苷酸(0DN)與融合蛋白的共同免疫接種可以阻止小鼠體內(nèi)的腫瘤生長(zhǎng)(Liu et al.，1998)。在WO 98/18810中詳細(xì)地解釋了對(duì)含有免疫刺激性CpG的ISS的用途及合成的闡述。WO 00/04918顯示了用編碼例如干擾素、和GM-CSF的基因轉(zhuǎn)染腫瘤細(xì)胞。質(zhì)?？梢员挥米鳛楸磉_(dá)載體。該申請(qǐng)闡述了一種用免疫治療方法治療腫瘤疾病的概念。沒有顯示相關(guān)的證明要求保護(hù)的疫苗的療效的體內(nèi)或體外數(shù)據(jù)或臨床結(jié)果。需附加說明的是這些沒有限定其應(yīng)用的基于質(zhì)粒的載體在人體基因治療中是沒有用的，因?yàn)槌酥委熜蛄型?，它們還包括其復(fù)制所必需的遺傳學(xué)功能單位。它們也包括其選擇所需的抗生素耐藥基因。結(jié)果是非治療所需的哺乳動(dòng)物或細(xì)菌的蛋白質(zhì)的持續(xù)表達(dá)。盡管研究了多年以及有著有前途的方法，但是通過施用免疫原性物質(zhì)發(fā)展出一種基于對(duì)抗腫瘤疾病的免疫功能的有效治療仍是不可能的。本發(fā)明的目的是提供一種用于治療與細(xì)胞因子有關(guān)的疾病(例如癌性疾病)的藥物組合物形式的疫苗，它是特異性的和有效的，并特異性地誘導(dǎo)了腫瘤特異性的免疫應(yīng)答。此外，也將提供了一種制備這種疫苗的方法。通過獨(dú)立權(quán)利要求的要素實(shí)現(xiàn)該目的。在本發(fā)明中，將采用下面的含義同種異基因起源于同一物種的遺傳學(xué)不一致的個(gè)體，與“自體”(來自同一個(gè)體的細(xì)胞)相反APC 抗原呈遞細(xì)胞B7. 1/CD80 分化抗原簇 80
CD40L/CD154分化抗原簇40配體DC樹突狀細(xì)胞dSLIM雙萃環(huán)免疫調(diào)節(jié)寡脫氧核苷酸GM-CSF粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子IL-7白介素-7ISS免疫刺激核酸序列
MIDGE最小免疫學(xué)定義的基因表汰載體IM丨DCiR &是Mologen AG的注冊(cè)商標(biāo))ODN寡脫氧核苷酸TAA腫瘤相關(guān)抗原在下面所述的內(nèi)容中，應(yīng)當(dāng)如下理解許多常用的術(shù)語轉(zhuǎn)染的細(xì)胞在本發(fā)明中的含義是經(jīng)本發(fā)明的編碼表達(dá)載體在離體處理過的人同種異基因腫瘤細(xì)胞，因此，作為這種處理的結(jié)果，所述細(xì)胞表達(dá)所編碼的細(xì)胞因子和共刺激因子序列，并能用作腫瘤疾病的一種免疫治療工具。在本發(fā)明中，術(shù)語“共刺激因子”和/或細(xì)胞因子代表天然存在的共刺激因子和/或細(xì)胞因子、共刺激因子和/或細(xì)胞因子的所有修飾體、突變體和衍生物、以及用重組技術(shù)制備的含有如倒轉(zhuǎn)、缺失、插入、附著等氨基酸修飾的共刺激因子和/或細(xì)胞因子，條件是它們保留了至少一部分野生型共刺激因子和/或細(xì)胞因子的基本功能。這些共刺激因子和/或細(xì)胞因子可以含有罕見的氨基酸和/或修飾例如烷基化、氧化、巰基修飾、變性和寡聚化等。在本發(fā)明中，共刺激因子和/或細(xì)胞因子可以是蛋白、肽和/或含有共刺激因子和/或細(xì)胞因子的全部或一部分，并與其他蛋白、肽或其一部分結(jié)合的融合肽。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方式中，共刺激因子和/或細(xì)胞因子是天然存在的共刺激因子和/或細(xì)胞因子的截?cái)嘈问?。上述提及的所有的適用于調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)的反應(yīng)的共刺激因子都是如在本發(fā)明中所定義的免疫原性物質(zhì)。因此，本發(fā)明的疫苗是一種免疫原性組合物，因?yàn)樗忻庖咴晕镔|(zhì)的組合。在很多性質(zhì)上，腫瘤細(xì)胞都不同于正常細(xì)胞，如細(xì)胞表面蛋白的不同表達(dá)。特別的，腫瘤相關(guān)抗原(TAA)的表達(dá)理論上容許免疫系統(tǒng)識(shí)別并破壞這些細(xì)胞。但是，在許多情況中，患者的免疫系統(tǒng)被嚴(yán)重地抑制，以致其不能識(shí)別這些突變細(xì)胞。通過提供一種用于治療患有確定的腫瘤疾病的患者的疫苗解決了這個(gè)問題，其中該疫苗包括另一個(gè)患者的腫瘤細(xì)胞(同種異基因細(xì)胞)，并且在此之前已經(jīng)用編碼白介素-7(IL-7)、粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子GM-CSF和共刺激因子CD40L/CD154和B7. 1/CD80的表達(dá)構(gòu)建體離體轉(zhuǎn)染了這些腫瘤細(xì)胞。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方式中，獲得了一種相應(yīng)的疫苗，其中在此之前用編碼白介素-7(IL-7)、粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子GM-CSF和共刺激因子⑶40L/⑶154的表達(dá)構(gòu)建體轉(zhuǎn)染了腫瘤細(xì)胞。所采用的腫瘤細(xì)胞可以來源于具有與所治療的患者相似的病癥的患者，或來源于具有不同于所治療的患者的病癥的患者。疫苗的組分(免疫原性化合物)的組合將保證生成所有信號(hào)級(jí)聯(lián)的三個(gè)步驟，它們對(duì)于誘導(dǎo)特異性的免疫應(yīng)答是必需的。這三個(gè)步驟包括抗原呈遞、共刺激以及提供合適的局部環(huán)境。
GM-CSF和⑶40L/⑶154的表達(dá)將確保局部募集并激活抗原呈遞細(xì)胞(APC)和樹突狀細(xì)胞(DC)。因此，觀察到對(duì)TAA呈遞的增強(qiáng)。B7.1/⑶80的表達(dá)造成了共刺激活性的增加。這反過來增加了 TAA組分的抗原性以及增加了被活化的抗TAA的T淋巴細(xì)胞的數(shù)目。IL-7的表達(dá)另外還誘導(dǎo)了腫瘤特異性T淋巴細(xì)胞的增殖。因此，本發(fā)明的疫苗結(jié)合腫瘤細(xì)胞表面的TAA誘導(dǎo)了高濃度的可溶性的刺激增殖的細(xì)胞因子和共刺激分子，這導(dǎo)致了在施用部位的腫瘤特異性T細(xì)胞的增殖。也誘使APC和DC遷移到施用部位。表達(dá)構(gòu)建體可以以質(zhì)粒的形式存在，優(yōu)選的也可以是最小化免疫學(xué)定義的基因表達(dá)構(gòu)建體。有著僅僅由CMV啟動(dòng)子、內(nèi)含子、編碼基因序列和聚腺苷酸化序列構(gòu)成的線性雙鏈共價(jià)閉合表達(dá)盒。表達(dá)盒的兩個(gè)末端均通過單鏈核苷酸殘基短環(huán)而共價(jià)閉合。這些共價(jià)閉合的最小DNA構(gòu)建體在下文中稱為MIDGE載體(MIDGE :最小免疫學(xué)定義的基因表達(dá)載 體)；見EP 0 941 318 BI。MIDGE構(gòu)建體所表現(xiàn)出的優(yōu)點(diǎn)是應(yīng)用該構(gòu)建體可以避免非治療療效所必需的結(jié)構(gòu)，因此避免了普通基因轉(zhuǎn)移載體的缺點(diǎn)。通過施用免疫刺激核酸序列(ISS)形式的佐劑提供了容許誘導(dǎo)特異性免疫應(yīng)答的局部環(huán)境。為了實(shí)現(xiàn)這個(gè)目的，本發(fā)明提供了含有附加的免疫調(diào)節(jié)寡脫氧核苷酸的疫苗作為佐劑。優(yōu)選地，疫苗包括免疫調(diào)節(jié)寡脫氧核苷酸，其包括a)包括堿基序列N1N2CGN3N4的序列，其中N1N2是選自包括GT、GG、GA、AT或AA的組的元件，N3N4是選自包括CT或TT的組的元件，C是脫氧胞苷，G是脫氧鳥苷，A是脫氧腺苷，以及T是脫氧胸苷，b)和具有部分互補(bǔ)的反向平行堿基序列的環(huán)狀鏈脫氧核糖核酸，并且它具有啞鈴狀的形狀。ISS的CpG基序(見圖2a)增加了 NK細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的活性并強(qiáng)烈刺激了 THl型細(xì)胞免疫應(yīng)答。因此，它們可作為免疫調(diào)節(jié)劑，容許并增強(qiáng)了腫瘤特異性的免疫應(yīng)答。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，使用了如在W001/07055中所述的長(zhǎng)度為30個(gè)堿基對(duì)的共價(jià)閉合的ISS0這些構(gòu)建體在下面被稱作為dSLIM (雙莖環(huán)免疫調(diào)節(jié)寡脫氧核苷酸)。具有堿基序列N1N2CGN3N4的序列位于寡脫氧核苷酸的單鏈區(qū)，并包括40到200個(gè)核苷酸(見圖2b)。本發(fā)明的主題還涉及一種制備如上所述的用于治療患有腫瘤疾病的患者的疫苗的方法，其中用編碼a)白介素-7 (IL-7)、粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)、CD40L/CD154和B7. 1/CD80，或b)白介素-7 (IL-7)、粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)和CD40L/CD154的核酸分子離體轉(zhuǎn)染同一物種的遺傳學(xué)不一致的供體(同種異基因)的腫瘤細(xì)胞，隨后將腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移到適用的藥物組合物中。上面已經(jīng)所述的免疫調(diào)節(jié)寡脫氧核苷酸包括具有部分互補(bǔ)的反向平行堿基序列的環(huán)狀鏈脫氧核酸，并具有啞鈴狀的形狀。作為佐劑，它們也是本發(fā)明的方法的一部分。因此本發(fā)明提供了一種同種異基因腫瘤細(xì)胞，其含有至少3種(優(yōu)選的4種)核酸分子，所述核酸分子編碼共刺激因子B7. 1/CD80和CD40L/CD154以及細(xì)胞因子白介素_7和GM-CSF。因此，本發(fā)明的主題也是同種異基因人腫瘤細(xì)胞，其相應(yīng)地被編碼a)白介素-7 (IL-7)、粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)、CD40L/CD154和B7. 1/CD80，或b)白介素-7 (IL-7)、粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)和CD40L/CD154的核酸構(gòu)建體進(jìn)行離體轉(zhuǎn)染，并且所述腫瘤細(xì)胞包括相應(yīng)的表達(dá)構(gòu)建體。腫瘤細(xì)胞包括質(zhì)粒形式的表達(dá)構(gòu)建體，或在雙鏈的兩個(gè)末端均經(jīng)單鏈核苷酸殘基短環(huán)共價(jià)閉合的僅僅由CMV啟動(dòng)子、內(nèi)含子、編碼基因序列和聚腺苷酸化序列構(gòu)成的線性雙鏈共價(jià)閉合表達(dá)盒形式的表達(dá)構(gòu)建體。優(yōu)選地，使用的是腎細(xì)胞癌細(xì)胞系的同種異基因腫瘤細(xì)胞。對(duì)于疫苗，本發(fā)明的方法提供了作為一或多種表達(dá)構(gòu)建體形式的核酸分子。因此，可以提供用于多基因表達(dá)的DNA表達(dá)構(gòu)建體，其-由含有線性表達(dá)盒的雙鏈區(qū)構(gòu)成，所述線性表達(dá)盒至少包括啟動(dòng)子序列和編碼序列，-且這些雙鏈區(qū)通過DNA單鏈或非編碼性DNA雙鏈而連接，-且那些末端未與其他表達(dá)盒通過DNA單鏈或非編碼性DNA雙鏈相連接的表達(dá)盒被保護(hù)而免于外切核酸酶的降解。PCT/DE03/02478已經(jīng)描述了這種用于多基因表達(dá)的DNA表達(dá)構(gòu)建體。因此，多個(gè)作為本發(fā)明的疫苗的對(duì)象的核酸可以包括在單獨(dú)一種表達(dá)構(gòu)建體中。
在本發(fā)明的一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方式中，核酸分子是DNA，特別是cDNA或基因組DNA。顯而易見，可以優(yōu)選的是核酸分子為RNA分子。同種異基因腫瘤細(xì)胞來源于患有結(jié)直腸癌、小細(xì)胞和非細(xì)胞肺癌、前列腺癌、乳腺癌、卵巢癌和腎細(xì)胞癌、以及惡性黑色素瘤的患者。在本發(fā)明的描述過程中，具體采用了腎細(xì)胞癌細(xì)胞系，它特別適合于制備本發(fā)明的疫苗。一個(gè)優(yōu)選的腎細(xì)胞癌細(xì)胞系是作為活培養(yǎng)物保藏于DSMZ(Deutsche Sammlung vonMikroorganismen und Zellkulturen GmbH (德國(guó)微生物菌種保藏中心))的保藏號(hào)為DSMACC 2635的細(xì)胞系。通過經(jīng)生物的、化學(xué)的和/或物理的方法的轉(zhuǎn)染方式將DNA表達(dá)構(gòu)建體轉(zhuǎn)移到該細(xì)胞系的細(xì)胞內(nèi)，這導(dǎo)致細(xì)胞表達(dá)所需的基因。將一種佐劑(優(yōu)選的是ISS，最優(yōu)選的是dSUM (見上))加入到轉(zhuǎn)染的同種異基因細(xì)胞內(nèi)。在用伽馬射線放射性照射轉(zhuǎn)染的同種異基因腫瘤細(xì)胞之后，將本發(fā)明的疫苗施用給患有腫瘤疾病的患者。與自體細(xì)胞不同的是，細(xì)胞所來源的肌體并非藥物組合物所治療的肌體。一方面，使用同種異基因細(xì)胞的優(yōu)點(diǎn)是細(xì)胞可被表征一次并可重復(fù)地增殖。另一方面，同種異基因的作用被認(rèn)作為是附加的佐劑刺激。被修飾的細(xì)胞可以來源于單個(gè)(不同個(gè)體)肌體或可以收集于數(shù)個(gè)具有相同病癥的肌體。因此，本發(fā)明的對(duì)象是可被表達(dá)的并編碼兩種細(xì)胞因子和一種或兩種共刺激因子的三種或四種核酸的組合。ISS，優(yōu)選地是dSUM，可被用作為附加的免疫調(diào)節(jié)劑。在原代人細(xì)胞系的細(xì)胞培養(yǎng)試驗(yàn)中可以驗(yàn)證在轉(zhuǎn)染后為三重或四重陽性的細(xì)胞(見

圖1)?！叭亍被颉八闹亍痹诒疚闹幸馑际歉甙俜直鹊谋凰械娜N或四種編碼GM-CSF、IL-7、⑶40L/⑶154和B7.1/⑶80的基因所成功轉(zhuǎn)染的細(xì)胞以及這些細(xì)胞表達(dá)這三種或四種基因。對(duì)于在本試驗(yàn)中所采用的結(jié)腸癌細(xì)胞系，用FACS (熒光激活細(xì)胞分類術(shù))分析確定出所有細(xì)胞中的14. 4%是四重陽性的細(xì)胞。此外，不論基因的種類，確定出所有細(xì)胞中的20. 3%被一種基因所成功轉(zhuǎn)染，19. 9%的細(xì)胞被三種不同的基因所成功轉(zhuǎn)染。確定出在用編碼CD40L/CD154、GM-CSF、B7. 1/CD80和IL-7的表達(dá)構(gòu)建體四重轉(zhuǎn)染之后被成功轉(zhuǎn)染的結(jié)腸癌細(xì)胞的百分比是14. 4%的細(xì)胞。因此，14. 4%的細(xì)胞被四種不同的基因所轉(zhuǎn)染并能成功地表達(dá)這些基因?？傊?，69. 4%的所有細(xì)胞被至少一種或多種基因所轉(zhuǎn)染。利用數(shù)個(gè)基因的轉(zhuǎn)染是有利的，因?yàn)橥ㄟ^這種方式，所表達(dá)的細(xì)胞因子和共刺激因子以緊密的空間接近性的方式被表達(dá)在免疫系統(tǒng)的效應(yīng)器官內(nèi)。這種空間接近性是重要的，因?yàn)楣泊碳ひ蜃又挥行У卦鰪?qiáng)抗原的免疫接種。對(duì)于轉(zhuǎn)染，可以采用基本已知的生物的、化學(xué)的和/或物理的方法，例如經(jīng)彈道轉(zhuǎn) 移(ballistischem transfer)的轉(zhuǎn)染(EP 0686697)、聚陽離子轉(zhuǎn)染、磷酸I丐沉淀、微注射、原生質(zhì)融合、脂質(zhì)體融合、病毒轉(zhuǎn)染系統(tǒng)、脂染和/或電穿孔。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，用電穿孔實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)染。另外，有利的方法是生物學(xué)轉(zhuǎn)染方法，例如受體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移。在此，在一個(gè)實(shí)例中，編碼至少一種(優(yōu)選的是兩種)共刺激因子和兩種細(xì)胞因子的DNA表達(dá)構(gòu)建體與寡肽共價(jià)連接，寡肽優(yōu)選地是猴病毒SV-40的核定位信號(hào)(NLS)。通過使用其他的肽(可以是人工合成的肽)進(jìn)一步地增加轉(zhuǎn)染效率是有可能的。本方法特別適用于在靜脈內(nèi)應(yīng)用之后的細(xì)胞特異性的體內(nèi)基因轉(zhuǎn)移。本發(fā)明的疫苗以及根據(jù)本發(fā)明的方法從同種異基因腫瘤細(xì)胞中制備的疫苗顯示出令人驚訝的作用。其可以糾正腫瘤患者的免疫系統(tǒng)的缺陷并且可以增強(qiáng)針對(duì)腫瘤特異性抗原的內(nèi)在的免疫應(yīng)答，兩者都是在同一時(shí)間以及都是以有利的方式進(jìn)行。此外，可以采用疫苗作為用于增強(qiáng)和重建針對(duì)殘余腫瘤細(xì)胞或消除已經(jīng)去除了腫瘤的患者體內(nèi)的殘余腫瘤塊的免疫應(yīng)答的佐劑治療。因此,預(yù)測(cè)經(jīng)外科手術(shù)去除了原發(fā)腫瘤且沒有可見的轉(zhuǎn)移灶的患者將從可能降低復(fù)發(fā)率的附加的腫瘤特異性治療中獲益。本發(fā)明的其他有利的實(shí)施方式可以來源于獨(dú)立的權(quán)利要求書和說明書。下面在附圖和實(shí)施例中更詳細(xì)地描述了本發(fā)明(包括本發(fā)明的治療方法如疫苗用于癌癥治療劑的令人驚訝的作用)以及本發(fā)明的方法。如附圖所示圖1 :四重轉(zhuǎn)染的人結(jié)腸癌細(xì)胞的FACS強(qiáng)度。通過編碼⑶40L/⑶154、GM-CSF,B7.1/⑶80和IL-7的表達(dá)載體的電穿孔實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)染。圖2a和b :免疫調(diào)節(jié)劑(dSUM)的圖解描述具有三個(gè)CG基序的啞鈴結(jié)構(gòu)，每個(gè)CG基序都是圖解所不的發(fā)夾環(huán)結(jié)構(gòu)；1是環(huán)和II是莖。為了證實(shí)基因產(chǎn)物，采用了與四種不同的熒光染料相連接的抗體。在圖1中，它們被稱作為CD80-FITChGMCSF-PEIL7-PerCPCD154-APC熒光激活細(xì)胞分類術(shù)(FACS)在四個(gè)不同的通道中檢測(cè)這些顏色，在x坐標(biāo)系中分別被稱作為FL1-H、FL2-H、FL3-H和FL4-H。x軸上的指數(shù)表示相對(duì)熒光強(qiáng)度。y軸顯示近似代表所檢測(cè)的細(xì)胞的數(shù)目的計(jì)數(shù)。用“設(shè)門”操作進(jìn)行分析，其中僅僅計(jì)數(shù)適合通過某一能量門的細(xì)胞。在下面的表I中，給出了在用編碼⑶40L/⑶154、GM-CSF和IL_7的表達(dá)構(gòu)建體三重轉(zhuǎn)染或用編碼CD40L/CD154、GM-CSF、B7. 1/CD80和IL-7的表達(dá)構(gòu)建體四重轉(zhuǎn)染之后被成功轉(zhuǎn)染的同種異基因腎細(xì)胞癌細(xì)胞的百分比。表1:
權(quán)利要求
1.核酸分子，其編碼白介素-7(IL-7)、粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)、CD40L/CD154 和 B7. 1/CD80。
2.編碼白介素-7(IL-7)、粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)、CD40L/CD154和B7. 1/CD80的核酸分子的組合，其中每個(gè)所述核酸分子編碼選自以下組中的至少一種共刺激因子白介素-7 (IL-7)、粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)、⑶40L/⑶154和B7.1/CD80。
3.權(quán)利要求1的核酸分子或權(quán)利要求2的組合，其中所述核酸分子包括 a)質(zhì)粒；或 b)線性雙鏈共價(jià)閉合表達(dá)盒，其僅由CMV啟動(dòng)子、內(nèi)含子、編碼基因序列和聚腺苷酸化序列構(gòu)成，雙鏈的兩個(gè)末端均通過單鏈核苷酸殘基短環(huán)而閉合。
4.權(quán)利要求1的核酸分子或權(quán)利要求2的組合與免疫調(diào)節(jié)寡脫氧核苷酸的組合。
5.權(quán)利要求4的組合，其中所述免疫調(diào)節(jié)寡脫氧核苷酸包括 a)具有堿基序列N1N2CGN3N4的序列，其中N1N2是選自包括GT、GG、GA、AT或AA的組的元件，N3N4是選自包括CT或TT的組的元件，以及C是脫氧胞苷，G是脫氧鳥苷，A是脫氧腺苷和T是脫氧胸苷，和 b)具有部分互補(bǔ)的反向平行堿基序列的環(huán)狀鏈脫氧核糖核酸并具有啞鈴狀的形狀。
6.權(quán)利要求5的組合，其中所述具有堿基序列N1N2CGN3N4的免疫調(diào)節(jié)寡脫氧核苷酸的序列位于所述寡脫氧核苷酸的單鏈區(qū)，并包括40到200個(gè)核苷酸。
7.離體轉(zhuǎn)染了權(quán)利要求1-6之一的核酸分子的人腫瘤細(xì)胞。
8.權(quán)利要求7的人腫瘤細(xì)胞，其中所述腫瘤細(xì)胞選自以下組中結(jié)直腸癌、小細(xì)胞或非小細(xì)胞肺癌、前列腺癌、乳腺癌、卵巢癌、腎細(xì)胞癌和惡性黑色素瘤。
9.權(quán)利要求7的人腫瘤細(xì)胞，其中所述腫瘤細(xì)胞對(duì)應(yīng)于保藏在DSMZ的保藏號(hào)為DSMACC 2635的腎細(xì)胞癌細(xì)胞系。
10.權(quán)利要求1的核酸分子或權(quán)利要求2的組合在轉(zhuǎn)染人腫瘤細(xì)胞中的用途。
11.權(quán)利要求10的用途，其中所述核酸分子包括 a)質(zhì)粒；或 b)線性雙鏈共價(jià)閉合表達(dá)盒，其僅由CMV啟動(dòng)子、內(nèi)含子、編碼基因序列和聚腺苷酸化序列構(gòu)成，雙鏈的兩個(gè)末端均通過單鏈核苷酸殘基短環(huán)而閉合。
12.權(quán)利要求1的核酸分子或權(quán)利要求2的組合與免疫調(diào)節(jié)寡脫氧核苷酸的組合在轉(zhuǎn)染人腫瘤細(xì)胞中的用途。
13.權(quán)利要求12中的用途，其中所述免疫調(diào)節(jié)寡脫氧核苷酸包括 a)具有堿基序列N1N2CGN3N4的序列，其中N1N2是選自包括GT、GG、GA、AT或AA的組的元件，N3N4是選自包括CT或TT的組的元件，以及C是脫氧胞苷，G是脫氧鳥苷，A是脫氧腺苷和T是脫氧胸苷，和 b)具有部分互補(bǔ)的反向平行堿基序列的環(huán)狀鏈脫氧核糖核酸并具有啞鈴狀的形狀。
14.權(quán)利要求13的用途，其中所述具有堿基序列N1N2CGN3N4的免疫調(diào)節(jié)寡脫氧核苷酸的序列位于所述寡脫氧核苷酸的單鏈區(qū)，并包括40到200個(gè)核苷酸。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種用于治療腫瘤疾病的基于同種異基因腫瘤細(xì)胞的疫苗，以及一種用于制備這種疫苗的方法，此外還涉及用作疫苗的轉(zhuǎn)染的人腫瘤細(xì)胞。
文檔編號(hào)C12N5/071GK102994515SQ201210316500
公開日2013年3月27日 申請(qǐng)日期2004年4月20日 優(yōu)先權(quán)日2003年12月30日
發(fā)明者托米斯拉夫·多布里克, 布格哈特·維蒂希, 曼努埃爾·施密特 申請(qǐng)人:莫洛根股份公司