專利名稱：一種從粗老茶中提取活性蛋白的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種從粗老茶中提取活性蛋白的方法，屬于天然活性成分提取技術(shù)領(lǐng)域，可用于保健食品和功能食品的研制開發(fā)。
背景技術(shù)：
茶葉的藥用價值歷史悠久，據(jù)《神農(nóng)本草經(jīng)》中記載久服茶葉能“安心益氣，輕身耐老”。另據(jù)唐《本草拾遺》中所述“諸藥為各病之藥，茶為萬病之藥”。大量的研究表明，茶葉中含有多種可被利用的生物活性成分和營養(yǎng)物質(zhì)，如茶多酚、茶多糖、茶蛋白等。但是，由于粗老茶經(jīng)沖泡后大多口感苦澀，結(jié)果導(dǎo)致其明顯滯銷，而經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)其內(nèi)的多種成分，如茶多糖、茶蛋白等具有非常明顯的保健作用。
其中，茶蛋白質(zhì)約占茶葉干物質(zhì)總量的20% _30%，而且絕大多數(shù)是非水溶性蛋白質(zhì)，只有1% -2%的蛋白質(zhì)是水溶性的，非水溶性蛋白質(zhì)主要是谷蛋白，約占蛋白總量的80%，其具有不溶于水，只溶于稀酸、稀堿溶液的特點(diǎn)，所以常利用堿法對茶葉中的蛋白質(zhì)進(jìn)行提取。超聲波提取技術(shù)常常用于植物有效成分的浸出提取，利用超聲波的空化作用和次級效應(yīng)，如機(jī)械振動、乳化、擴(kuò)散、擊碎、化學(xué)效應(yīng)等加速欲提取成分的擴(kuò)散釋放，并充分與溶劑混合，以提高提取的效率，目前超聲提取技術(shù)已應(yīng)用于茶多糖的提取。研究表明，茶蛋白也具有茶多酚所具有的保健功能非水溶性茶蛋白具有明顯的降血脂效果，對動脈粥樣硬化及冠心病可能有一定的預(yù)防作用；茶蛋白對預(yù)防放射治療時引起的致突變效有保護(hù)作用；另外，茶蛋白還具有抗氧化、抗衰老等作用。目前通常采用熱堿浸提方法進(jìn)行茶蛋白的分離提取，但其缺點(diǎn)是所消耗的能源較大，而且蛋白的得率及活性均不十分理想。

發(fā)明內(nèi)容
為了解決上述問題，本發(fā)明的目的在于提供一種得率高，且活性增強(qiáng)的從粗老茶中提取活性蛋白的方法。為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明提供的從粗老茶中提取活性蛋白的方法包括按順序進(jìn)行的下列步驟I)復(fù)合酶法預(yù)處理將粗老茶加入到適量蒸餾水中至其全部浸沒在蒸餾水中，用稀鹽酸調(diào)節(jié)PH至4，然后加入占粗老茶總量O. 5% I. 5%重量的由纖維素酶和果膠酶組成的復(fù)合酶，在40°C的溫度下反應(yīng)I 3小時，反應(yīng)結(jié)束后在100°C的溫度下滅活5min ；2)超聲堿法提取在上述反應(yīng)液中加入堿液，所述粗老綠茶與堿液的重量比為I : 20 I : 40，堿選自氫氧化鈉或氫氧化鉀中的一種，堿液濃度為O. IM O. 2M，然后在超聲清洗儀中攪拌提取I 2小時，之后減壓過濾，收集濾液而得到含有茶蛋白的茶葉供試液；3)等電點(diǎn)沉淀向上述茶葉供試液中加入濃鹽酸，以將溶液pH調(diào)至4. 5，然后在4°C的溫度下靜置24 48小時；4)離心分離利用離心分離機(jī)將上述沉淀液離心分離15 20分鐘，收集沉淀物；5)冷凍干燥將上述沉淀物重新溶解于蒸餾水中，然后置于_18°C的溫度下進(jìn)行冷凍，凍實之后置于_50°C的真空冷凍干燥機(jī)中進(jìn)行干燥而得到茶蛋白樣品；6)木瓜蛋白酶酶解將上述冷凍干燥后的茶蛋白樣品加入到pH為6 7的PBS緩沖溶液中，之后加入木瓜蛋白酶，其中木瓜蛋白酶的用量占茶蛋白樣品重量O. 5 I. 5%,在55 65°C的溫度下反應(yīng)I 3小時，反應(yīng)結(jié)束后在100°C的溫度下滅活5min ；7)等電點(diǎn)重新沉淀向上述酶解后的反應(yīng)液中加入濃鹽酸，以將溶液pH調(diào)至4. 5，然后在4°C的溫度下靜置24 48小時；8)離心或過濾分離利用離心分離機(jī)將上述沉淀液離心分離15 20分鐘，收集沉淀物； 9)冷凍干燥將上述沉淀物重新溶解于蒸餾水中，然后置于_18°C的溫度下進(jìn)行冷凍，凍實之后置于_50°C的真空冷凍干燥機(jī)中進(jìn)行干燥而得到所述的茶蛋白。所述的步驟I)中纖維素酶與果膠酶的重量比為I : I。所述的步驟2)中超聲功率設(shè)定為24 40KHz。所述的步驟4)和步驟8)中離心分離機(jī)的轉(zhuǎn)速為3000 4000轉(zhuǎn)/分。本發(fā)明提供的從粗老茶中提取活性蛋白的方法是利用超聲輔助提取并輔以纖維素酶和果膠酶的處理來破壞茶葉細(xì)胞的細(xì)胞壁，使活性物質(zhì)更大限度地溶出，并采用堿法提取以得到茶葉中的酸性蛋白，再用等電點(diǎn)沉淀的方法分離出茶蛋白；再對提取得到的茶蛋白進(jìn)行酶解，從而再次提高了茶蛋白的性能。由于超聲技術(shù)和復(fù)合酶處理破壞了細(xì)胞的細(xì)胞壁，對其內(nèi)的活性物質(zhì)的結(jié)構(gòu)也有一定程度的影響，所以本方法得到的茶蛋白樣品得率較高；再經(jīng)酶解處理之后，蛋白的溶解性、抗氧化活性又有了明顯的提高，因此本方法具有資源利用率高、節(jié)約能源、活性增強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)。


圖I為利用本發(fā)明提供的從粗老茶中提取活性蛋白的方法及現(xiàn)有的熱堿浸提方法得到的茶蛋白清除DPPH自由基能力對比圖。圖2為利用本發(fā)明提供的從粗老茶中提取活性蛋白的方法及現(xiàn)有的熱堿浸提方法得到的茶蛋白總還原力對比圖。圖3為利用本發(fā)明提供的從粗老茶中提取活性蛋白的方法及現(xiàn)有的熱堿浸提方法得到的茶蛋白溶解度對比圖。
具體實施例方式下面結(jié)合附圖和具體實施例對本發(fā)明提供的從粗老茶中提取活性蛋白的方法進(jìn)行詳細(xì)說明。實施例I :I)復(fù)合酶法預(yù)處理將30g粗老茶加入到適量蒸餾水中至其全部浸沒在蒸餾水中，用稀鹽酸調(diào)節(jié)PH至4，然后加入O. 45g由纖維素酶和果膠酶組成的復(fù)合酶(纖維素酶與果膠酶的重量比為I : 1)，在40°C的溫度下反應(yīng)I小時，反應(yīng)結(jié)束后在100°C的溫度下滅活5min ；2)超聲堿法提取在上述反應(yīng)液中加入1200g濃度為O. 2M的氫氧化鈉液，然后在超聲清洗儀中攪拌提取I小時，超聲功率設(shè)定為24KHz，之后減壓過濾，收集濾液而得到含有茶蛋白的茶葉供試液；3)等電點(diǎn)沉淀向上述茶葉供試液中加入濃鹽酸，以將溶液pH調(diào)至4. 5，然后在4 °C的溫度下靜置48小時；4)離心分離利用離心分離機(jī)在3000轉(zhuǎn)/分的轉(zhuǎn)速下將上述沉淀液離心分離20分鐘，收集沉淀物；5)冷凍干燥將上述沉淀物重新溶解于蒸餾水中，然后置于_18°C的溫度下進(jìn)行冷凍，凍實之后置于_50°C的真空冷凍干燥機(jī)中進(jìn)行干燥而得到茶蛋白樣品；
6)木瓜蛋白酶酶解將上述冷凍干燥后的茶蛋白樣品加入到pH為7的PBS緩沖溶液中，之后加入木瓜蛋白酶，其中木瓜蛋白酶的用量占茶蛋白樣品重量I. 5%，在65°C的溫度下反應(yīng)I小時，反應(yīng)結(jié)束后在100°C的溫度下滅活5min ；7)等電點(diǎn)重新沉淀向上述酶解后的反應(yīng)液中加入濃鹽酸，以將溶液pH調(diào)至4. 5，然后在4°C的溫度下靜置48小時；8)離心或過濾分離利用離心分離機(jī)在3000轉(zhuǎn)/分的轉(zhuǎn)速下將上述沉淀液離心分離20分鐘，收集沉淀物；9)冷凍干燥將上述沉淀物重新溶解于蒸餾水中，然后置于_18°C的溫度下進(jìn)行冷凍，凍實之后置于-50°C的真空冷凍干燥機(jī)中進(jìn)行干燥而得到茶蛋白，茶蛋白提取率為88. 04%。實施例2 I)復(fù)合酶法預(yù)處理將30g粗老茶加入到適量蒸餾水中至其全部浸沒在蒸餾水中，用稀鹽酸調(diào)節(jié)PH至4，然后加入O. 15g由纖維素酶和果膠酶組成的復(fù)合酶(纖維素酶與果膠酶的重量比為I : 1)，在40°C的溫度下反應(yīng)3小時，反應(yīng)結(jié)束后在100°C的溫度下滅活5min ；2)超聲堿法提取在上述反應(yīng)液中加入600g濃度為O. IM的氫氧化鈉液，然后在超聲清洗儀中攪拌提取I小時，超聲功率設(shè)定為40KHz，之后減壓過濾，收集濾液而得到含有茶蛋白的茶葉供試液；3)等電點(diǎn)沉淀向上述茶葉供試液中加入濃鹽酸，以將溶液pH調(diào)至4. 5，然后在4 °C的溫度下靜置24小時；4)離心分離利用離心分離機(jī)在4000轉(zhuǎn)/分的轉(zhuǎn)速下將上述沉淀液離心分離15分鐘，收集沉淀物；5)冷凍干燥將上述沉淀物重新溶解于蒸餾水中，然后置于_18°C的溫度下進(jìn)行冷凍，凍實之后置于_50°C的真空冷凍干燥機(jī)中進(jìn)行干燥而得到茶蛋白樣品；6)木瓜蛋白酶酶解將上述冷凍干燥后的茶蛋白樣品加入到pH為6的PBS緩沖溶液中，之后加入木瓜蛋白酶，其中木瓜蛋白酶的用量占茶蛋白樣品重量O. 5%，在55°C的溫度下反應(yīng)3小時,反應(yīng)結(jié)束后在100°C的溫度下滅活5min ；7)等電點(diǎn)重新沉淀向上述酶解后的反應(yīng)液中加入濃鹽酸，以將溶液pH調(diào)至4. 5，然后在4°C的溫度下靜置24小時；
8)離心或過濾分離利用離心分離機(jī)在4000轉(zhuǎn)/分的轉(zhuǎn)速下將上述沉淀液離心分離15分鐘，收集沉淀物；9)冷凍干燥將上述沉淀物重新溶解于蒸餾水中，然后置于_18°C的溫度下進(jìn)行冷凍，凍實之后置于-50°C的真空冷凍干燥機(jī)中進(jìn)行干燥而得到茶蛋白，茶蛋白提取率為88. 10%。實施例3 I)復(fù)合酶法預(yù)處理將30g粗老茶加入到適量蒸餾水中至其全部浸沒在蒸餾水中，用稀鹽酸調(diào)節(jié)PH至4，然后加入O. 3g由纖維素酶和果膠酶組成的復(fù)合酶(纖維素酶與果膠酶的重量比為I : 1)，在40°C的溫度下反應(yīng)2小時，反應(yīng)結(jié)束后在100°C的溫度下滅活5min ；2)超聲堿法提取在上述反應(yīng)液中加入900g濃度為O. 15M的氫氧化鉀液，然后在 超聲清洗儀中攪拌提取2小時，超聲功率設(shè)定為32KHz，之后減壓過濾，收集濾液而得到含有茶蛋白的茶葉供試液；3)等電點(diǎn)沉淀向上述茶葉供試液中加入濃鹽酸，以將溶液pH調(diào)至4. 5，然后在4 °C的溫度下靜置36小時；4)離心分離利用離心分離機(jī)在3500轉(zhuǎn)/分的轉(zhuǎn)速下將上述沉淀液離心分離15分鐘，收集沉淀物；5)冷凍干燥將上述沉淀物重新溶解于蒸餾水中，然后置于_18°C的溫度下進(jìn)行冷凍，凍實之后置于_50°C的真空冷凍干燥機(jī)中進(jìn)行干燥而得到茶蛋白樣品；6)木瓜蛋白酶酶解將上述冷凍干燥后的茶蛋白樣品加入到pH為6的PBS緩沖溶液中，之后加入木瓜蛋白酶，其中木瓜蛋白酶的用量占茶蛋白樣品重量1.0%，在60°C的溫度下反應(yīng)2小時,反應(yīng)結(jié)束后在100°C的溫度下滅活5min ；7)等電點(diǎn)重新沉淀向上述酶解后的反應(yīng)液中加入濃鹽酸，以將溶液pH調(diào)至4. 5，然后在4°C的溫度下靜置36小時；8)離心或過濾分離利用離心分離機(jī)在3500轉(zhuǎn)/分的轉(zhuǎn)速下將上述沉淀液離心分離15分鐘，收集沉淀物；9)冷凍干燥將上述沉淀物重新溶解于蒸餾水中，然后置于_18°C的溫度下進(jìn)行冷凍，凍實之后置于-50°C的真空冷凍干燥機(jī)中進(jìn)行干燥而得到茶蛋白，茶蛋白提取率為88. 08%。實施例4 I)復(fù)合酶法預(yù)處理將30g粗老茶加入到適量蒸餾水中至其全部浸沒在蒸餾水中，用稀鹽酸調(diào)節(jié)PH至4，然后加入O. 45g由纖維素酶和果膠酶組成的復(fù)合酶(纖維素酶與果膠酶的重量比為I : 1)，在40°C的溫度下反應(yīng)3小時，反應(yīng)結(jié)束后在100°C的溫度下滅活5min ；2)超聲堿法提取在上述反應(yīng)液中加入1200g濃度為O. 2M的氫氧化鉀液，然后在超聲清洗儀中攪拌提取2小時，超聲功率設(shè)定為40KHz，之后減壓過濾，收集濾液而得到含有茶蛋白的茶葉供試液；3)等電點(diǎn)沉淀向上述茶葉供試液中加入濃鹽酸，以將溶液pH調(diào)至4. 5，然后在4°C的溫度下靜置48小時；
4)離心分離利用離心分離機(jī)在4000轉(zhuǎn)/分的轉(zhuǎn)速下將上述沉淀液離心分離20分鐘，收集沉淀物；5)冷凍干燥將上述沉淀物重新溶解于蒸餾水中，然后置于_18°C的溫度下進(jìn)行冷凍，凍實之后置于_50°C的真空冷凍干燥機(jī)中進(jìn)行干燥而得到茶蛋白樣品；6)木瓜蛋白酶酶解將上述冷凍干燥后的茶蛋白樣品加入到pH為6的PBS緩沖溶液中，之后加入木瓜蛋白酶，其中木瓜蛋白酶的用量占茶蛋白樣品重量1.5%，在60°C的溫度下反應(yīng)3小時,反應(yīng)結(jié)束后在100°C的溫度下滅活5min ；7)等電點(diǎn)重新沉淀向上述酶解后的反應(yīng)液中加入濃鹽酸，以將溶液pH調(diào)至4. 5，然后在4°C的溫度下靜置48小時；8)離心或過濾分離利用離心分離機(jī)在4000轉(zhuǎn)/分的轉(zhuǎn)速下將上述沉淀液離心分離20分鐘，收集沉淀物；9)冷凍干燥將上述沉淀物重新溶解于蒸餾水中，然后置于_18°C的溫度下進(jìn)行冷凍，凍實之后置于-50°C的真空冷凍干燥機(jī)中進(jìn)行干燥而得到茶蛋白，茶蛋白提取率為88. 03%。本發(fā)明人將上述利用本發(fā)明提供的方法及現(xiàn)有的熱堿浸提方法獲得的蛋白提取率和蛋白含量進(jìn)行了對比，結(jié)果見表I。表I本發(fā)明方法與現(xiàn)有的熱堿浸提方法的茶蛋白提取結(jié)果對比
權(quán)利要求
1.一種從粗老茶中提取活性蛋白的方法，其特征在于所述的從粗老茶中提取活性蛋白的方法包括按順序進(jìn)行的下列步驟 1)復(fù)合酶法預(yù)處理將粗老茶加入到適量蒸餾水中至其全部浸沒在蒸餾水中，用稀鹽酸調(diào)節(jié)PH至4，然后加入占粗老茶總量O. 5% I. 5%重量的由纖維素酶和果膠酶組成的復(fù)合酶，在40°C的溫度下反應(yīng)I 3小時，反應(yīng)結(jié)束后在100°C的溫度下滅活5min ； 2)超聲堿法提取在上述反應(yīng)液中加入堿液，所述粗老綠茶與堿液的重量比為I 20 I : 40，堿選自氫氧化鈉或氫氧化鉀中的一種，堿液濃度為O. IM O. 2M，然后在超聲清洗儀中攪拌提取I 2小時，之后減壓過濾，收集濾液而得到含有茶蛋白的茶葉供試液； 3)等電點(diǎn)沉淀向上述茶葉供試液中加入濃鹽酸，以將溶液PH調(diào)至4.5，然后在4°C的溫度下靜置24 48小時； 4)離心分離利用離心分離機(jī)將上述沉淀液離心分離15 20分鐘，收集沉淀物； 5)冷凍干燥將上述沉淀物重新溶解于蒸餾水中，然后置于_18°C的溫度下進(jìn)行冷凍，凍實之后置于_50°C的真空冷凍干燥機(jī)中進(jìn)行干燥而得到茶蛋白樣品； 6)木瓜蛋白酶酶解將上述冷凍干燥后的茶蛋白樣品加入到pH為6 7的PBS緩沖溶液中，之后加入木瓜蛋白酶，其中木瓜蛋白酶的用量占茶蛋白樣品重量O. 5 I. 5%，在55 65°C的溫度下反應(yīng)I 3小時，反應(yīng)結(jié)束后在100°C的溫度下滅活5min ； 7)等電點(diǎn)重新沉淀向上述酶解后的反應(yīng)液中加入濃鹽酸，以將溶液pH調(diào)至4.5，然后在4°C的溫度下靜置24 48小時； 8)離心或過濾分離利用離心分離機(jī)將上述沉淀液離心分離15 20分鐘，收集沉淀物； 9)冷凍干燥將上述沉淀物重新溶解于蒸餾水中，然后置于_18°C的溫度下進(jìn)行冷凍，凍實之后置于_50°C的真空冷凍干燥機(jī)中進(jìn)行干燥而得到所述的茶蛋白。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的從粗老茶中提取活性蛋白的方法，其特征在于所述的步驟1)中纖維素酶與果膠酶的重量比為I: I。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的從粗老茶中提取活性蛋白的方法，其特征在于所述的步驟2)中超聲功率設(shè)定為24 40KHz。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的從粗老茶中提取活性蛋白的方法，其特征在于所述的步驟4)和步驟8)中離心分離機(jī)的轉(zhuǎn)速為3000 4000轉(zhuǎn)/分。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種從粗老茶中提取活性蛋白的方法。該方法是利用超聲輔助提取并輔以纖維素酶和果膠酶的處理來破壞茶葉細(xì)胞的細(xì)胞壁，使活性物質(zhì)更大限度地溶出，并采用堿法提取以得到茶葉中的酸性蛋白，再用等電點(diǎn)沉淀的方法分離出茶蛋白；再對提取得到的茶蛋白進(jìn)行酶解，從而再次提高了茶蛋白的性能。由于超聲技術(shù)和復(fù)合酶處理破壞了細(xì)胞的細(xì)胞壁，對其內(nèi)的活性物質(zhì)的結(jié)構(gòu)也有一定程度的影響，所以本方法得到的茶蛋白樣品得率較高；再經(jīng)酶解處理之后，蛋白的溶解性、抗氧化活性又有了明顯的提高，因此本方法具有資源利用率高、節(jié)約能源、活性增強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)。
文檔編號A23J1/00GK102805198SQ201210316329
公開日2012年12月5日 申請日期2012年8月31日 優(yōu)先權(quán)日2012年8月31日
發(fā)明者陳海霞, 章鈺, 張寧, 馬利帥 申請人:天津大學(xué)