專利名稱：一種人載脂蛋白B₁₀₀單克隆抗體及其化學發(fā)光免疫分析測定試劑盒的制作方法
一種人載脂蛋白B1tw單克隆抗體及其化學發(fā)光免疫分析測定試劑盒
技術領域：
本發(fā)明涉及識別人載脂蛋白Β·(Αρ0 B100)的單克隆抗體，產(chǎn)生該單克隆抗體的雜交瘤，學發(fā)光免疫分析定量測定(CLIA)試劑盒及其制備方法，本發(fā)明屬于生物技術領域。
背景技術：
心腦血管疾病是一種嚴重威脅人類，特別是50歲以上中老年人健康的常見病，全世界每年死于心腦血管疾病的人數(shù)高達1500萬人，居各種死因首位。心腦血管疾病具有“發(fā)病率高、致殘率高、死亡率高、復發(fā)率高，并發(fā)癥多”即“四高一多”的特點，目前，我國心腦血管疾病患者已經(jīng)超過2. 7億人！每年死于心腦血管疾病近300萬人，占我國每年總死亡病因的51%。而幸存下來的患者75%不同程度喪失勞動能力，心腦血管疾病已成為人類 死亡病因最聞的頭號殺手！載脂蛋白B(Apolipoprotein B, Apo B)是血楽；脂蛋白中蛋白質(zhì)的一種，根據(jù)氨基酸組成和分布分為Β100、Β48、Β74、Β26和Β50五種亞型。載脂蛋白B100(Apo B100)是低密度脂蛋白(Low density lipoprotein, LDL)、中密度脂蛋白(Intermediated densitylipoprotein, IDL)和極低密度脂蛋白(Very low density lipoprotein, VLDL)顆粒上主要的載脂蛋白，由肝臟合成，含有4563個氨基酸殘基，分子量約為510KDa。ApoB作為動脈硬化、冠心病等的危險因子，其與動脈粥樣硬化型心血管疾病之間有著密切關系，其功能之一是攜帶膽固醇，因此ApoB在血液中的含量可作為膽固醇等脂類的指標?；加屑毙孕募」Ｋ馈⑿哪X疾病患者、動脈硬化癥、高脂血癥、糖尿病、慢性腎功能不全等疾病ApoB含量出現(xiàn)增高。Apo Biqq與載脂蛋白Al (Apolipoprotein Al)的比值(Apo B/ΑΙ)在臨床上是心腦血管疾病檢測的重要指標，與心肌梗塞、缺血性中風有緊密的聯(lián)系，是微蛋白尿、糖尿病和新陳代謝綜合癥的獨立風險因子。所以Apo B·水平的檢測對疾病的早期預測有一定的意義。目前在臨床實驗室檢測ApoB100的方法主要是放射免疫分析(RIA)、免疫比濁法和酶聯(lián)免疫吸附分析(ELISA)，其中RIA必須用放射性元素標記，檢測設備復雜昂貴，其放射性元素的半衰期短，不能長期保存，檢測結果不穩(wěn)定，同時存在放射性污染也給實驗操作人員帶來了傷害；酶免疫分析法靈敏度低，影響因素較多，易造成假陰性和假陽性。本發(fā)明是在酶聯(lián)免疫分析的基礎上應用酶催化發(fā)光底物，通過發(fā)光底物產(chǎn)生的光信號來代替酶聯(lián)免疫分析中的顯色底物，其靈敏度有很大的提高，本發(fā)明操作簡便，適用性強，可同時大批量的檢測，成本低，更易在臨床診斷和實驗室推廣使用。

發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目地是建立一種簡單且具高靈敏度的檢測ApoBicitl的方法。并將該方法應用于人類心腦血管疾病的檢測。本發(fā)明獲得了能夠產(chǎn)生特異性識別ApoBicitl的單克隆抗體(mAb)的雜交瘤細胞株4-3-2與雜交瘤細胞株4-6-3，該細胞株已于2012年3月6日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)，保藏地址是，中國.武漢.武漢大學，保藏編號為CCTCC C201209與CCTCC C201210。此外，經(jīng)過鑒定，兩珠單克隆抗體分別識別ApoBltltl的兩個不同表位，通過4-3-2與4-6-3的結合建立了夾心酶聯(lián)免疫反應方法，提供一種人載脂蛋白B·化學發(fā)光免疫分析測定試劑盒以及該試劑盒的制備方法。利用該試劑盒分析檢測靈敏度高、特異性強。其是一種高靈敏度及高通量的檢測系統(tǒng)。為達到上述目的，本發(fā)明采用如下技術方案I.單克隆抗體的制備方法，具體包括以下步驟(I)用蛋白量為50ug的人ApoBltltl與弗氏完全佐劑混合；經(jīng)15天后進行第二次相同劑量與弗氏不完全佐劑混合免疫；再15天后進行第三次相同劑量與弗氏完全佐劑混合免疫；10天后尾部取血用間接ELISA方法測血清滴度，用相同劑量的純抗原不加佐劑加強免疫；3天后取脾細胞進行融合； (2)將免疫小白鼠脾細胞與小白鼠骨髓瘤細胞(SP2/0)按5-10 I的比例，用50% PEG作為融合劑融合；(3)用含HAT(次黃嘌呤、氨基蝶呤、胸腺嘧啶)的無血清培養(yǎng)基，在37°C，5% CO2的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)10天，常規(guī)間接ELISA方法篩選陽性孔。(4)篩選出的特異性強陽性孔用常規(guī)的有限稀釋法克隆，獲得單抗細胞株進一步擴大培養(yǎng)；(5)收集培養(yǎng)上清液。親和層析法純化單克隆抗體，即為可專一識別人ApoBicici的抗體；(6)檢測單克隆抗體的滴度，選取較好的一株進行標記(例如HRP)，并對標記好的單克隆抗體進行滴度測定；(7)標記好的單克隆抗體與其他未標記的單克隆抗體進行競爭ELISA反應，選取沒有競爭的一株進行夾心ELISA反應，確定最佳條件。2.人載脂蛋白B·化學發(fā)光免疫分析測定試劑盒的建立本發(fā)明的人載脂蛋白B·化學發(fā)光免疫分析測定試劑盒包括人載脂蛋白B·單克隆抗體包被的不透明聚苯乙烯板；人載脂蛋白B·系列標準品；酶標記的人載脂蛋白Bltltl另一株單克隆抗體；酶作用的發(fā)光底物A液和B液；洗滌液等。本發(fā)明提供了一種制備上述試劑盒的方法，包括以下步驟(I)標準品的配制和濃度的校正將人載脂蛋白B·純品，加入標準品稀釋液，配制一高濃度標準品濃液，采用逐低稀釋的方法稀釋到各濃度，配制成O、IO、40、100、300、600ng/ml的系列標準品，標準品用國家標準校正。(2)包被采用O. 5mol/L，pH值為9. 5的碳酸鹽緩沖液與適當濃度的人載脂蛋白B·單抗混合成抗體濃度是I μ g/mL包被液，以100 μ L/孔包被在不透明的聚苯乙烯板上，4°C孵育過夜；(3)洗板用PBS-T洗液洗板孔2次；
(4)封閉封閉液包含NaCl 8g，KCl O. 2g，Na2HPO4 · 12H20 2. 9g，KH2PO4 0. 2g，蔗糖 20. 00g，proclin300 1.00ml, BSA 20. 00g，封閉液的 PH 值為 7. 3-7. 5，150 μ L/孔封閉，濕盒孵育2h ；(5)干燥去除封閉液，過夜干燥。(6)組裝為成品 將聚苯乙烯板子放入鋁箔袋中并放入干燥劑，密封保存。本發(fā)明的單克隆抗體可直接用于檢測樣品中的人ApoBicitl含量，通過大量培養(yǎng)單抗 細胞株，即可獲得大量的單克隆抗體，與多克隆抗體相比，具有純度高，專一性強、重復性好等優(yōu)點。本發(fā)明針對臨床實驗室建立了一種既可以手工操作，又可以用于標準全自動檢測儀器的檢測手段，建立了檢測人血清ApoBicitl的定量檢測方法。本發(fā)明的人載脂蛋白Bltltl定量檢測試劑盒(CLIA)可以專一的檢測出人血清中的ApoBicitl的含量，具有簡便、快速、靈敏、穩(wěn)定的優(yōu)點。本發(fā)明的試劑盒，包被的抗體與酶標記的抗體及被測樣品中的人載脂蛋白Bltltl形成“包被抗體-抗原-抗體-酶”的夾心復合物結構，所以本發(fā)明采用的是“雙抗夾心法”的反應模式。應用酶催化發(fā)光底物，通過檢測發(fā)光底物產(chǎn)生的光信號代替酶聯(lián)免疫分析中的顯色底物，因而具有與酶聯(lián)免疫分析同等的特異性，而靈敏度大大提高，比現(xiàn)今的酶聯(lián)免疫吸附分析靈敏度提高約10倍，可為疾病的診斷提供更為特異、快速、可靠的依據(jù)。本發(fā)明的試劑盒檢測方法，具有靈敏度高，檢測范圍寬，操作方便、對實驗人員無傷害，同時生產(chǎn)成本低，減輕了醫(yī)患雙方的負擔，因此更有利于臨床診斷的推廣使用。下文將就本發(fā)明通過下述實施方案給出更為具體的說明。

圖I是實施例二所制備的試劑盒的標準品線形圖；圖2顯示的是本發(fā)明中的雜交瘤所產(chǎn)生的抗-ApoBicitl單克隆抗體在ELISA方法中滴度測量結果；圖3顯示的是標記HRP的抗ApoBltltl單克隆抗體滴度測量結果；圖4顯示的是法夾心ELISA(S-ELISA)系統(tǒng)的檢測靈敏度。
具體實施方式實施例I :雜交瘤的制備I.小鼠的免疫免疫動物為8周齡大小的雄性Balb/C小白鼠，用蛋白量為50ug的人Ap0BlOO與弗氏完全佐劑混合完全乳化后，采取背部多點，及腋下、腹股溝免疫；經(jīng)15天后進行第二次相同劑量與弗氏不完全佐劑混合免疫；再15天后進行第三次相同劑量與弗氏完全佐劑混合免疫；10天后尾部取血用間接ELISA方法測血清滴度，用相同劑量的純抗原不加佐劑加強免疫；3天后取脾細胞進行融合；2.細胞融合取處于對數(shù)生長期的Sp2/0細胞與脾細胞I : 10混和，通過聚乙二醇(PEG)法以獲得雜交瘤細胞，命名為4-3-2和4-6-3。所獲得的雜交瘤細胞懸浮在含有飼養(yǎng)細胞的HAT培養(yǎng)基中，然后加入到96孔板中，在37°C，5% CO2的培養(yǎng)箱中封閉培養(yǎng)12天;實施例2 :單克隆抗體的篩選從培養(yǎng)實施例I中所獲得的雜交瘤細胞的孔格中回收培養(yǎng)基的上清液，選取在ELISA方法中與抗原多肽反應的單克隆抗體。首先，將IOOuL濃度為O. 2ug/ml的人ApoBltltl到96孔板的每個孔格中，于4°C過夜后使其固定于固相，然后用150uL濃度為1%的牛血清白蛋白進行封閉2小時。將IOOuL雜交瘤細胞的培養(yǎng)基上清液加入到每個孔格中，于37°C反應2小時，然后加入稀釋10000倍的辣根過氧化物酶偶聯(lián)的抗-小鼠抗體于37°C反應I小時。使用四甲基聯(lián)苯胺微孔過氧化物酶底物(TMB)作為底物進行顯色。添加50uL濃度為O. 2N的硫酸終止反應后，測量450的吸光度，選出吸光度大約為3的2C6及3E8，并通過有限稀釋法進行亞克隆。
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將亞克隆后的細胞用細胞培養(yǎng)轉瓶進行擴大培養(yǎng)，約20天后，收集上清，用葡萄球菌A蛋白(Protein A)進行親和層析純化。所選的兩種mAb的滴度通過ELISA方法來測定。加入4-3-2或者4-6-3(10ug/mL)，在反應后，使用辣根過氧化物酶偶聯(lián)的抗-小鼠抗體與TMB進行顯色。結果如圖I所示兩種mAbs效價達到10_9以上。實施例3 :單克隆抗體的標記取單克隆抗體4-6-3按常規(guī)方法進行HRP標記。標記好的單克隆抗體的滴度通過下面的方法測定。將濃度為O. 2ug/ml的人ApoBltltl固定在96孔微板上(IOOuL/孔)。使用1%的牛血清白蛋白進行封閉2小時，加標記的單克隆抗(第一孔稀釋100倍)，從第二孔開始做4倍稀釋，于室溫下反應2小時。添加TMB后，反應在室溫下進行20分鐘，用O. 2N的硫酸中止反應。測量在450nm的吸光度，按實施例2中的方式獲得針對固定在固相中的抗原的滴度。結果表明具有有效的滴度(圖2)。實施例4 :夾心ELISA系統(tǒng)的建立使用實施例2和3中的單克隆抗體構建了一個ELISA系統(tǒng)。O. 5ug/ml的單克隆抗體4-3-2以IOOuL/孔的量加到微孔板土，于4°C孵育24小時固定于固相?？赘袷褂煤?O. 1% Tween 20 的 pH 值為 7. 4 的 20mM PBS (PBST)以 200uL/ 孔的量洗 3 次。以 150uL/孔的量加入1%牛血清白蛋白進行封閉2小時。孔格用PBST以200uL/孔的量洗3次，力口入由起始濃度10ug/ml連續(xù)4倍稀釋的人ApoBicitl,于室溫溫育2小時，然后加入標記HRP的4-6-3 (I 3K ；100uL/孔)并于室溫溫育2小時。添加TMB后，反應在室溫下進行20分鐘，加入O. 2N的硫酸來中止反應并測量450nm的吸光度。結果表明檢測的靈敏度很高(O. 2 100ng/ml)(圖 3)實施例5 :制備本發(fā)明的人載脂蛋白Biqq定量測定試劑盒(化學發(fā)光法)(一 )酶標抗體工作液的配制(I)酶標稀釋液的配制
權利要求
1.一種能產(chǎn)生特異性識別人Ap0Bioo的單克隆抗體的雜交瘤，其保藏號分別為CCTCCC201209 和 CCTCC C201210，分別命名為 4-3-2 和 4-6-3。
2.一種單克隆抗體，它可以識別由權利要求I所述的雜交瘤細胞產(chǎn)生的單克隆抗體所識別的表位，并特異性地識別ΑροΒΙΟΟ。
3.—種體外特異性檢測樣品中Ap0BlOO的方法，其特征在于使用權利要求2所述的單克隆抗體。
4.一種人載脂蛋白B·化學發(fā)光免疫分析測定試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括 1)人載脂蛋白B·校準品； 2)包被有人載脂蛋白Bltltl單克隆抗體的固相載體； 3)辣根過氧化物酶標記的人載脂蛋白Bltltl單克隆抗體； 4)上述酶所作用的化學發(fā)光底物。
5.如權利要求4所述的試劑盒，其特征在于，所述固相載體為不透明的聚苯乙烯板。
6.如權利要求4所述的試劑盒其特征在于，所述化學發(fā)光底物為魯米諾或魯米諾的衍生物。
7.一種制備權利要求4所述試劑盒的方法，其特征在于包括以下步驟 1)以人載脂蛋白Bltltl純品配制人載脂蛋白B·校準品； 2)以人載脂蛋白Bltltl單克隆抗體包被固相載體； 3)以辣根過氧化物酶標記人載脂蛋白Bltltl單克隆抗體； 4)配制化學發(fā)光底物； 5)分裝上述人載脂蛋白B·校準品、辣根過氧化物酶標記的人載脂蛋白B·單克隆抗體和該酶所作用的化學發(fā)光底物； 6)組裝為成品。
8.如權利要求7所述的方法，其特征在于，所述包被固相載體的步驟采用以下方法 1)包被 采用O. 5mol/L，pH值為9. 5的碳酸鹽緩沖液與適當濃度的人載脂蛋白Bltltl單抗混合成抗體濃度是I μ g/mL包被液，以100 μ L/孔包被在不透明的聚苯乙烯板上； 2)用PBS-T洗液洗板； 3)封閉封閉液包含 NaCl 8g，KCl O. 2g，Na2HPO4 · Iffi2O 2. 9g，KH2PO4 O. 2g，蔗糖 20. 00g，proclin300 I. 00ml，BSA 20. 00g，封閉液的PH值為 7. 3-7. 5，150 μ L/孔封閉，濕盒孵育 2h。
9.如權利要求7或8所述的方法，其特征在于，所述固相栽體為不透明的聚苯乙烯板。
10.如權利要求4-9所述的方法，其特征在于，所述化學發(fā)光底物為魯米諾或魯米諾的衍生物。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種人載脂蛋白B100(ApoBl00)化學發(fā)光免疫分析測定試劑盒及其制備方法。特別地，本發(fā)明提供了一種特異性識別人ApoB100的單克隆抗體，產(chǎn)生該單克隆抗體的雜交瘤，以及使用該單克隆抗體檢測人ApoB100的高靈敏度的方法。本發(fā)明的試劑盒具有靈敏度高，檢測范圍寬，操作方便，同時生產(chǎn)成本低等特點。
文檔編號C12N5/20GK102943066SQ20121031037
公開日2013年2月27日 申請日期2012年8月23日 優(yōu)先權日2012年3月13日 公開號201210310372.發(fā)明者藍興國, 李玉花, 張曉磊, 李春雷, 馮玥 申請人:大慶麥伯康生物技術有限公司, 東北林業(yè)大學大慶生物技術研究院, 李玉花