專利名稱：一種雜合肽囊素佐劑及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于分子免疫學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種雜合肽囊素佐劑及其制備方法和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
Lys-His-Gly-NH2三肽是一種可以誘導(dǎo)B淋巴細(xì)胞分化的激素樣物質(zhì)，它不僅可以通過誘導(dǎo)干細(xì)胞的分化和作用于B淋巴細(xì)胞對(duì)機(jī)體免疫球蛋白的多樣化性產(chǎn)生影響，而且還可以促進(jìn)機(jī)體的IgM向IgG的方向發(fā)生變轉(zhuǎn)，因其最早是從雞法氏囊中提取的，所以稱之為囊素三肽。1991年，Aydhya等發(fā)現(xiàn)囊素不僅僅存在于禽類法氏囊中，還存在于哺乳動(dòng) 物的骨髓和膽管上皮細(xì)胞中。在哺乳動(dòng)物中分離的囊素是以前囊素狀態(tài)出現(xiàn)的，它是一種序列為 Phe-Phe-Trp-Lys-Thr-Lys-Pro-Arg-Lys-His-Gly-Gly-Arg-Arg 的 14 妝結(jié)構(gòu)。從序列上我們可以看出其第9位、第10位和第11位這三個(gè)連續(xù)的氨基酸正好是囊素三肽的序列。Aydhya的研究還證實(shí)了此14肽的前囊素與囊素三肽有著相似的生物學(xué)活性。因此，我們可以推斷融合狀態(tài)的前囊素并不影響三肽生物活性的發(fā)揮。近年來國(guó)外對(duì)有免疫活性的多肽的序列和結(jié)構(gòu)有詳細(xì)的研究，其中有一種叫做加加尼翁(Gagnon’s peptide)的四肽,其氨基酸序列為L(zhǎng)ys-Asn-Pro_Tyr。這個(gè)四肽序列被證實(shí)也是B細(xì)胞刺激物，可以增加雞新城疫疫苗等抗體效價(jià)。為了研究重組疫苗免疫佐劑，本研究利用分子生物學(xué)的方法設(shè)計(jì)了 14個(gè)囊素三肽和2個(gè)加加尼翁四肽的雜合序列，并在序列的末端增加了 6個(gè)組氨酸的標(biāo)簽序列，最終序列長(zhǎng)度為197bp，我們命名其為雜合肽囊素N197。通過合成N197的雜合多肽序列以及體外和體內(nèi)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)來驗(yàn)證基因工程免疫增強(qiáng)劑雜合多肽的免疫活性。

發(fā)明內(nèi)容
(一)本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種可廣泛用于疫苗制備，生產(chǎn)成本低，免疫佐劑效果好的新型雜合肽囊素免疫佐劑及其制備方法和應(yīng)用。(二)本發(fā)明的技術(shù)方案是I雜合肽囊素N197的設(shè)計(jì)合成14個(gè)囊素三肽的氨基酸序列(Lys-HiS-Gly-NH2)和2個(gè)加加尼翁活性四肽的氨基酸序列(Lys-Asn-Pro-Tyr)所對(duì)應(yīng)的密碼子共有150bp的核苷酸。另外，在核酸序列的前面添加一個(gè)起始密碼子的序列(3bp)和一個(gè)限制性內(nèi)切酶EcoRI的酶切位點(diǎn)(6bp)。在序列的末端加上6個(gè)組氨酸的序列(18bp)，一個(gè)終止密碼子(3bp)，另外加上三個(gè)限制性內(nèi)切酶(Xho I1Sal I1Pst I)的核酸序列(17bp)。這樣設(shè)計(jì)好的雜合肽囊素核酸序列共包括197個(gè)核苷酸(N197序列)。2含有雜合肽囊素N197序列原核表達(dá)載體的構(gòu)建與鑒定把合成好的雜合肽囊素N197序列與線性化后的PET32a(Novagen公司商品化產(chǎn)品)原核表達(dá)載體進(jìn)行連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌宿主后，用酶切鑒定的方法篩選含N197的PET32a載體的宿主菌。3雜合肽囊素在大腸桿菌中的誘導(dǎo)表達(dá)以終濃度為ImM的IPTG (異丙基-β -D-硫代吡喃半乳糖苷)對(duì)含雜合肽囊素序列的宿主菌進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，同時(shí)以含PET32a空載體質(zhì)粒的BL-21菌同樣誘導(dǎo)處理后樣品為陰性對(duì)照。以SDS-PAGE電泳結(jié)果來分析雜合肽囊素在大腸桿菌中的表達(dá)水平。4重組大腸桿菌雜合肽囊素N197的純化利用SDS-PAGE電泳來對(duì)雜合肽囊素N197的表達(dá)條帶進(jìn)行分離，并通過切膠回收的方法對(duì)重組雜合肽囊素N197進(jìn)行分離、純化，并可以進(jìn)一步利用SDS-PAGE電泳對(duì)切膠回收的雜合肽囊素N197的純度進(jìn)行分析。 5純化后的重組雜合肽囊素N197的體外免疫活性測(cè)定(碧云天生物公司的CCK8試劑盒)取雞外周血，并分離出淋巴細(xì)胞，在LPS的作用下，測(cè)定純化后的重組雜合肽囊素N197在體外促進(jìn)B淋巴細(xì)胞增殖的免疫活性，并設(shè)立相應(yīng)的陰性對(duì)照和空白對(duì)照。6重組雜合肽囊素N197體外免疫佐劑活性的測(cè)定把I日齡的SPF級(jí)白色來航雞在SPF飼養(yǎng)至10日齡后分為A，B，C和D等4組，每組3只雞。其中A組為商品化的雞傳染性法氏囊病滅活疫苗免疫組(采用市售商品化雞傳染性法氏囊病的滅活苗在雞頸部皮下注射200 μ I) ；Β組為聯(lián)合免疫組(用商品化的雞傳染性法氏囊病滅活疫苗頸部皮下注射加200 μ I切膠回收的O. 14mg/ml的N197) ；C組為陽性攻毒組(不免疫，進(jìn)行攻毒);D組為空白對(duì)照組(不免疫，不攻毒)。對(duì)各組中需要免疫的雞只按上述方案進(jìn)行免疫，在24日齡時(shí)加強(qiáng)免疫一次，疫苗接種劑量及各組免疫增強(qiáng)劑的添加情況同第一次免疫。7雜合肽囊素N197對(duì)商品化雞IBD疫苗免疫抗體水平的影響在第二次免疫13日后，即雞群37日齡時(shí)對(duì)雞群進(jìn)行翅靜脈采血。具體方法如下
(I)固定雞只，使雞的翅膀上翻(注意勿使雞翅膀折傷或脫臼)；(2)在雞翅中部選取翅靜脈比較清楚的位置用70%酒精棉球消毒并使血管得以擴(kuò)張;(3)用Iml的一次性無菌注射器在消毒部位采血約Iml/只；(4)將采集的雞血在室溫放置Ih后于4°C冰箱過夜。次日，以2000rpm，4°C離心IOmin并小心吸取上清；(5)采用瓊擴(kuò)實(shí)驗(yàn)方法測(cè)定血清中雞IBD抗體的水平和效價(jià)。中間孔加入標(biāo)準(zhǔn)雞傳染性法氏囊病瓊擴(kuò)抗原，周圍的孔中分別加入采集的免疫雞群及對(duì)照組實(shí)驗(yàn)雞只的抗血清。8雜合肽囊素N197對(duì)攻毒后雞法氏囊的保護(hù)作用分析雞群采血后立即對(duì)其進(jìn)行攻毒，每只雞采用滴眼的方式滴加90 μ I雞IBDV的強(qiáng)毒株BC6/85的病毒液(約1000 EID5tlX攻毒6天后，處死所有雞群并對(duì)其進(jìn)行剖檢。主要取雞的脾臟和法氏囊組織稱重后立即放入10%的福爾馬林溶液進(jìn)行固定后進(jìn)行病理切片分析。(三)本發(fā)明其有益效果是目前，畜禽疫苗所使用的佐劑主要還是礦物油類佐劑為主，雖然油佐劑的免疫效果得到了認(rèn)可，但是其的主要缺陷在于其具有一定的毒副作用(引起局部炎癥等等)。本研究制備的雜合肽囊素N197作為疫苗佐劑主要有如下幾方面的有益效果I雜合肽囊素N197是一種高效、低廉，安全的畜禽疫苗佐劑囊素三肽作為疫苗佐劑的免疫促進(jìn)作用已被廣泛證實(shí)，但是由于天然提取的囊素三肽工藝復(fù)雜，得率較低，成本昂貴，所以用天然提取的囊素工作畜禽用佐劑幾乎沒有可能性。而本研究采用大腸桿菌系統(tǒng)在體外表達(dá)雜合肽囊素N197，此方法獲得的重組蛋白的效率很高，且大腸桿菌系統(tǒng)生產(chǎn)外源蛋白的成本比較低，因此，雜合肽囊素N197是一種高效，低廉的免疫佐劑。另外，由于囊素三肽和加加尼翁活性四肽是家禽等生物體內(nèi)本身存在的一種小肽，且多肽在自然環(huán)境中易降解，因此，把多個(gè)囊素三肽和加加尼翁活性四肽的密碼子串聯(lián)后，在體外表達(dá)的重組雜合肽囊素N197對(duì)畜禽來說應(yīng)該是一種比較安全的免疫佐劑。2重組雜合肽囊素N197是一種具有廣譜促免疫作用的免疫佐劑 該佐劑能提高多種畜禽疫苗的免疫效果，這直接減少了畜禽患病的機(jī)會(huì)，間接增加了養(yǎng)殖戶的收入和經(jīng)濟(jì)效應(yīng)。同時(shí)，該新型佐劑的應(yīng)用可望提高傳統(tǒng)疫苗的免疫效果，降低畜禽重大傳染病的防治成本。3重組雜合肽囊素N197是一種綠色、環(huán)保的免疫佐劑該免疫佐劑可降低畜禽疫苗抗原的使用量，從而減少了因大量繁殖病毒對(duì)疫苗生產(chǎn)區(qū)域的環(huán)境和疫苗使用場(chǎng)所周圍環(huán)境的污染程度，降低企業(yè)的生產(chǎn)成本，是一種綠色、環(huán)保免疫佐劑。此外，重組雜合肽囊素N197屬于重組多肽佐劑，其在自然界中可以被降解，不會(huì)對(duì)環(huán)境和其他生物造成生物危害。
四

圖I :含雜合肽囊素N197核酸序列的PET32a重組載體的酶切鑒定圖A:N197 ;M:DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)；1:含雜合肽囊素N197核酸序列的PET32a重組載體的酶切鑒定；圖2 :含雜合肽囊素N197核酸序列的PET32a表達(dá)載體在大腸桿菌中的誘導(dǎo)表達(dá)。A :雜合肽囊素N197 ;1_2:誘導(dǎo)4h時(shí)的PET32a_N197轉(zhuǎn)化菌；M:蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)；3:誘導(dǎo)4h時(shí)的PET32a空質(zhì)粒轉(zhuǎn)化菌圖3 :雜合肽囊素N197的純化A:純化后的雜合肽囊素N197;M:蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)；I:切膠回收的重組雜合肽囊素N197的印跡
五具體實(shí)施例方式I雜合肽囊素N197的設(shè)計(jì)合成14個(gè)囊素三肽的氨基酸序列(Lys-His-Gly-NH2)和2個(gè)活性四肽的氨基酸序列(Lys-Asn-Pro-Tyr)所對(duì)應(yīng)的密碼子共有150bp的核苷酸。另外在核酸序列的前面添加一個(gè)起始密碼子的序列(3bp)和一個(gè)限制性內(nèi)切酶EcoR I的酶切位點(diǎn)(6bp)。在序列的末端加上6個(gè)組氨酸的序列(18bp)，一個(gè)終止密碼子(3bp)，另外加上三個(gè)限制性內(nèi)切酶(XhoI，Sal I1Pst I)的核酸序列(17bp)。這樣設(shè)計(jì)好的雜合肽基因共包括197個(gè)核苷酸。具體序列如下
5 ' -GAATTCATGAAACACGGTAAACATGGCAAACACGGTAAACACGGCAAACACGGCAAACACGGTAAACACGGTAAACATGGCAAACACGGCAAGCACGGTAAGCACGGTAAACACGGCAAACATGGCAAACACGGTAAAAATCCGTACAAGAACCCGTATCATCACCACCATCACCATTAAGTCGACTCGAGCTGCAG-3 ^N197序列設(shè)計(jì)好之后，送南京金斯瑞公司進(jìn)行序列的合成。2含有雜合肽囊素N197序列原核表達(dá)載體的構(gòu)建2. I雜合肽囊素N197序列的準(zhǔn)備取金斯瑞公司提供的含N197雜合肽基因的克隆載體PUC57-N197的轉(zhuǎn)化菌(穿刺菌)溶解于普通的LB培養(yǎng)基中，再用接種環(huán)蘸取TOC57-N197的轉(zhuǎn)化菌的菌液，在含有終濃度為50μ g/ml氨芐青霉素(Amp)的普通LB瓊脂平板上，以四區(qū)劃線的方式進(jìn)行轉(zhuǎn)接，接著
置于37°C培養(yǎng)箱，培養(yǎng)12-16h，以獲得含N197雜合肽基因的克隆載體roC57_N197的轉(zhuǎn)化菌的單菌落。次日從PUC57-N197的轉(zhuǎn)化菌劃線平板上挑取單個(gè)菌落至I支含3ml液體LB培養(yǎng)基的試管中，37°C培養(yǎng)12-16h后取I. 2ml菌液用普通質(zhì)粒小提試劑盒提取質(zhì)粒。提取的PUC57-N197質(zhì)粒用EcoR I和Sal I進(jìn)行酶切，酶切體系如下
提取的 PUC57-N19740μ1
IO^Buffer H16μ1
EcoR I3·2μ1
Sal I3.2μ1
(IdH2O97.6μ1
總體積160μ1以上酶切體系在37°C作用2h后，用2%的瓊脂糖凝膠電泳來鑒定PUC57-N197是否正確。如鑒定為正確的含有N197核酸片段的質(zhì)粒，則可以對(duì)該質(zhì)粒進(jìn)行大量酶切，并在紫外燈下割取分子量在197bp左右的目標(biāo)條帶，并對(duì)其中的核酸進(jìn)行回收。2. 2PET32a表達(dá)載體的線性化及其回收按如下體系的組成對(duì)原核表達(dá)載體PET32a進(jìn)行酶切(EcoR I、Sal I)、回收。
PET32a20 il
IOxButTer H8μ1
hcoR Ii .6μ1
Sail1.6μ1
ddH2048.8μ1
總體積80μ12. 3重組雜合肽囊素Ν197原核表達(dá)載體(PET32a_N197)的構(gòu)建把分別經(jīng)過EcoR I和Sal I兩個(gè)酶酶切的PET32a回收溶液和N197進(jìn)行連接，構(gòu)建含N197序列原核表達(dá)載體PET32a，具體連接體系如下_切回收的N1973μ1
PET32aI μ!
IOxiigase BufferΙμ
14DNA ligaseUd
ddH^O4μ1
總體積10μ1以上各組分在O. 25ml的離心管中混勻并稍加離心，放入4°C恒溫體系中連接過夜。
2. 4雜合肽囊素N197序列與表達(dá)載體PET32a的連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化將10 μ I Ν197回收片段與PET32a載體的連接產(chǎn)物加入一支200 μ I BL-21感受態(tài)細(xì)胞的菌液中，輕輕混勻后冰浴30min。將冰浴后的連接產(chǎn)物在42°C，熱應(yīng)激90s后輕輕放置冰水中冰浴5min。接著在轉(zhuǎn)化體系中加入800 μ I的LB培養(yǎng)基，37°C，170rpm振蕩培養(yǎng)50min。取200 μ I轉(zhuǎn)化菌液均勻涂布于含有50 μ g/ml終濃度的Amp的普通LB瓊脂平板上，37°C培養(yǎng)12-16h后觀察菌落的生長(zhǎng)情況。在涂有轉(zhuǎn)化菌液的平板上挑取I個(gè)大小適中，形態(tài)飽滿的轉(zhuǎn)化菌落至含3ml液體普通LB培養(yǎng)基(含50 μ g/ml濃度的Amp)的試管中，37°C培養(yǎng)過夜。在每個(gè)試管中取I. 5ml的菌液至Eppendorf管中，使用普通質(zhì)粒小提試劑盒提取質(zhì)粒。2. 5含雜合肽囊素N197序列的PET32a表達(dá)載體的鑒定把提取的轉(zhuǎn)化菌的質(zhì)粒用EcoR I和Sal I酶切，酶切體系如下
轉(zhuǎn)化的質(zhì)粒8μ1
IOxBuffer H2μ1
I0.5μ1
Sal I0.5μ1
CidH2O9μ1
總體積20μ1以上各組分在O. 25ml的離心管中混勻并稍加離心后于37°C恒溫水浴2. 5h左右，取酶切后的質(zhì)粒溶液在2%的瓊脂糖凝膠中電泳，100V電壓，電泳20min左右，在UVPBiospectrum 600下觀察有無分子量大小分別為200bp和5900bp左右的兩條核酸條帶,轉(zhuǎn)化質(zhì)粒中能酶切出這兩種分子量核酸的質(zhì)粒即可鑒定為重組N197的PET32a表達(dá)質(zhì)粒。2. 6雜合肽囊素N197序列在大腸桿菌中的誘導(dǎo)表達(dá)把本章2. 2中含有陽性重組N197的PET32a表達(dá)載體的大腸桿菌在氨節(jié)青霉素平板上四區(qū)劃線，37°C培養(yǎng)至肉眼可見大小適度的單菌落后停止培養(yǎng)。從劃線平板上挑取2個(gè)菌落接種到3ml含氨芐青霉素(100 μ g/ml)的LB液體培養(yǎng)基中，37°C振搖過夜。次日取2%過夜培養(yǎng)物接種到4ml含氨芐青霉素的普通LB液體培養(yǎng)基中，37°C劇烈振搖培養(yǎng)，約2-2. 5h后達(dá)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)中期(菌液OD6tltl值為O. 5-0. 6左右)，加入終濃度為ImM的IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。以PET32a空載體質(zhì)粒的BL-21菌同樣誘導(dǎo)處理后為陰性對(duì)照。2個(gè)誘導(dǎo)菌和空載體PET32a菌在IPTG誘導(dǎo)4h時(shí)各取500 μ I樣品，誘導(dǎo)菌室溫12000rpm離心30s。收各管的菌體沉淀加入40 μ I的ddH20重懸細(xì)菌沉淀，100°C處理IOmin后進(jìn)行SDS-PAGE。2. 7重組大腸桿菌雜合肽囊素N197的純化從劃線平板上挑取單菌落接種到3mlLB液體培養(yǎng)基(含終濃度為50 μ g/ml的氨芐青霉素)，37°C振搖過夜。次日，取2%過夜培養(yǎng)物接種到IOml含氨芐青霉素的普通LB液體培養(yǎng)基中，37°C劇烈振搖培養(yǎng)，約2-2. 5h后達(dá)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)中期(菌液0D600值為O. 5-0. 6左右)，加入終濃度為ImM的IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。在誘導(dǎo)4h時(shí)，所有的誘導(dǎo)菌經(jīng)12000rpm，離心30s，其沉淀用800 μ I的ddH20重懸后加入200 μ I的SDS-PAGE的loading buffer中，在100°C煮沸IOmin后進(jìn)行SDS-PAGE。剩余的樣品于_20°C保存。SDS-PAGE結(jié)束后把膠用ddH20稍漂洗后去掉泡沫，用O. 25M的KCl溶液(4°C預(yù)冷)浸泡膠，雜合肽囊素N197的印跡會(huì)立即顯現(xiàn)出來，此時(shí)用干凈的刀片把含有雜合肽囊素N197的凝膠切割下來并浸泡在ddH20中約Imin后，用注射器針筒壓碎凝膠，使凝膠顆粒大 小約為O. 然后在碎的凝膠中加入PBS或ddH20,過夜后12000rpm,離心15min,取上清即為含有很純雜合肽囊素N197的切膠回收溶液。取40 μ I的雜合肽囊素N197的切膠回收溶液，加10 μ I loading buffer，在100°C煮沸IOmin后進(jìn)行SDS-PAGE。通過電泳來確定雜合肽囊素N197的純度。2. 8雜合肽囊素N197對(duì)商品化雞傳染性法氏囊疫苗的免疫增強(qiáng)劑效應(yīng)把I日齡的SPF級(jí)白色來航雞在SPF飼養(yǎng)至10日齡后分為A，B，C和D等4組，每組3只雞。其中A組為商品化的雞傳染性法氏囊病滅活疫苗免疫組(采用市售商品化雞傳染性法氏囊病的滅活苗在雞頸部皮下注射200 μ I) ；Β組為聯(lián)合免疫組(用商品化的雞傳染性法氏囊病滅活疫苗頸部皮下注射加200 μ I切膠回收的O. 14mg/ml的N197) ；C組為陽性攻毒組(不免疫，進(jìn)行攻毒);D組為空白對(duì)照組(不免疫，不攻毒)。對(duì)各組中需要免疫的雞只按上述方案進(jìn)行免疫，在24日齡時(shí)加強(qiáng)免疫一次，疫苗接種劑量及各組免疫增強(qiáng)劑的添加情況同第一次免疫。2. 8. I雜合肽囊素N197對(duì)商品化雞IBD疫苗免疫抗體水平的影響在第二次免疫13日后，即雞群37日齡時(shí)對(duì)雞群進(jìn)行翅靜脈采血。具體方法如下(I)固定雞只，使雞的翅膀上翻(注意勿使雞翅膀折傷或脫臼)；(2)在雞翅中部選取翅靜脈比較清楚的位置，用70%酒精棉球消毒并使血管得以擴(kuò)張；(3)用Iml的一次性無菌注射器在消毒部位采血約Iml/只；(4)將采集的雞血在室溫放置Ih后于4°C冰箱過夜。次日，以2000rpm，4°C離心IOmin并小心吸取上清；(5)采用瓊擴(kuò)實(shí)驗(yàn)方法測(cè)定血清中雞IBD抗體的水平和效價(jià)。中間孔加入標(biāo)準(zhǔn)雞傳染性法氏囊病瓊擴(kuò)抗原，周圍的孔中分別加入采集的免疫雞群及對(duì)照組實(shí)驗(yàn)雞只的抗血清。2. 8. 2雜合肽囊素N197對(duì)攻毒后雞法氏囊的保護(hù)作用分析雞群采血后立即對(duì)其進(jìn)行攻毒，每只雞采用滴眼的方式滴加90 μ I雞IBDV的強(qiáng)毒株BC6/85的病毒液(約1000EID5(i)。攻毒6天后，處死所有雞群并對(duì)其進(jìn)行剖檢。主要取雞的脾臟和法氏囊組織稱重后立即放入10%的福爾馬林溶液進(jìn)行固定后進(jìn)行病理切片分析。
權(quán)利要求
1.一種雜合肽囊素N197佐劑，其特征是由14個(gè)囊素三肽的氨基酸序列Lys-His-Gly-NH2和2個(gè)活性四肽的氨基酸序列Lys-Asn-Pro-Tyr及6個(gè)組氨酸組成的雜合多肽序列。
2.權(quán)利要求I所述的雜合肽囊素N197佐劑的制備方法，其特征是由以下步驟組成 ①雜合肽囊素N197的設(shè)計(jì)合成 14個(gè)囊素三肽的氨基酸Lys-His-Gly-NH2和2個(gè)活性四肽的氨基酸Lys-Asn-Pro-Tyr所對(duì)應(yīng)的核酸序列,共150bp的核苷酸，同時(shí)在該核酸序列的N段添加一個(gè)起始密碼子的序列3bp和一個(gè)限制性內(nèi)切酶EcoR I的酶切位點(diǎn)6bp，另外在該序列的C端加上6個(gè)組氨酸的密碼子序列18bp，一個(gè)終止密碼子3bp和三個(gè)限制性內(nèi)切酶Xho I，Sal I1Pst I的核酸序列17bp，這樣設(shè)計(jì)好的雜合肽囊素基因共197個(gè)核苷酸，具體序列如下5 z -GAATTCATGAAACACGGTAAACATGGCAAACACGGTAAACACGGCAAACACGGCAAACACGGTAAACACGGTAAACATGGCAAACACGGCAAGCACGGTAAGCACGGTAAACACGGCAAACATGGCAAACACGGTAAAAATCCGTACAAGAACCCGTATCATCACCACCATCACCATTAAGTCGACTCGAGCTGCAG-3 ,； ②重組雜合肽囊素N197的原核表達(dá)載體PET32a-N197的構(gòu)建及其重組菌 雜合肽囊素N197核酸序列與線性化的PET32a (Novagen公司商品化產(chǎn)品)原核表達(dá)載體進(jìn)行連接，獲得了重組雜合肽囊素N197的原核表達(dá)載體PET32a-N197，該載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL-21宿主后獲得了含PET32a-N197載體的重組菌，該重組菌表達(dá)重組雜合肽囊素N197的量可高達(dá)20% ；
3.權(quán)利要求I所述重組雜合肽囊素N197佐劑在制備法氏囊疫苗或新城疫疫苗或豬瘟疫苗或禽流感疫苗或馬立克氏病疫苗等畜禽疫苗制備中的應(yīng)用。
4.權(quán)利要求I所述重組雜合肽囊素N197獨(dú)立使用時(shí)，對(duì)畜禽免疫力的增強(qiáng)作用。
全文摘要
本發(fā)明屬于分子免疫學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種雜合肽囊素佐劑及其制備方法和應(yīng)用。主要技術(shù)方法如下先設(shè)計(jì)出14個(gè)囊素三肽的氨基酸序列(Lys-His-Gly-NH2)和2個(gè)活性四肽的氨基酸序列(Lys-Asn-Pro-Tyr)密碼子為主體的雜合肽囊素N197的核酸序列。接著構(gòu)建了重組表達(dá)載體PET32a-N197，將其轉(zhuǎn)入BL-21(DE3)大腸桿菌后，雜合肽囊素N197獲得了高效表達(dá)。純化后的雜合肽囊素N197具有顯著的免疫佐劑的特性。本發(fā)明中的雜合肽囊素N197具有高效的佐劑特性，且利用大腸桿菌系統(tǒng)可以在體外對(duì)其進(jìn)行大規(guī)模的生產(chǎn)，其生產(chǎn)成本低，生產(chǎn)效率高，生物活性好，非常適合企業(yè)化生產(chǎn)，具有很好的作為畜禽免疫佐劑的應(yīng)用前景。
文檔編號(hào)C12N15/70GK102796200SQ20121029558
公開日2012年11月28日 申請(qǐng)日期2012年8月17日 優(yōu)先權(quán)日2012年8月17日
發(fā)明者沈萍萍, 蔡梅紅 申請(qǐng)人:南京大學(xué)