專利名稱：一種來源于嗜酸耐熱菌的第113家族的新β-甘露聚糖酶、基因和及其應用的制作方法
技術(shù)領域：
本發(fā)明涉及基因工程領域，具體地涉及一種來源于嗜酸耐熱菌的第113家族的新β -甘露聚糖酶、基因和及其應用。
背景技術(shù)：
植物細胞壁主要由纖維素、半纖維素及木質(zhì)素等物質(zhì)構(gòu)成。甘露聚糖是植物半纖維素的重要組分，是由β_1，4- -甘露糖連接而成的線狀多聚體，在多糖的側(cè)鏈上主要有葡萄糖基、乙酰基和半乳糖基等取代基團。甘露聚糖具有高親水性，在單胃動物的消化道內(nèi)大量吸水，增加了消化道內(nèi)容物的黏度，抵抗胃腸蠕動，直接影響動物對營養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收。β -甘露聚糖酶(β -mannanase)是一類能夠水解含有甘露糖苷鍵的甘露聚糖(包括異甘露聚糖)的內(nèi)切水解酶，其主要水解產(chǎn)物為單糖、二糖、三糖、四糖等低聚糖。β_甘露聚糖酶來源廣泛，普遍存在于微生物、植物和動物中，有著廣闊的應用前景。在飼料工業(yè)中，β -甘露聚糖酶是一種環(huán)保型飼料添加劑，減輕環(huán)境污染，消除抗營養(yǎng)因子的作用，提高飼料利用率，促進營養(yǎng)物質(zhì)吸收、改善飼料轉(zhuǎn)換率、減少抗生素等化學藥品的使用，以及提高動物生產(chǎn)性能。在食品工業(yè)中，β_甘露聚糖酶可用于降解植物膠，生產(chǎn)功能性低聚甘露糖，也可用于食品的加工、貯藏和果汁澄清。在造紙工業(yè)中，甘露聚糖酶可運用于紙漿的漂白工藝。在紡織工業(yè)中，β_甘露聚糖酶用于降解天然纖維中的半纖維素膠質(zhì)，并能有效地去除紡織印染產(chǎn)品上黏附的多余染料，以取代常規(guī)的化學處理工藝，降低了能耗和對環(huán)境的污染。在洗滌工業(yè)中，甘露聚糖酶可用作洗滌劑添加劑。近年來，隨著甘露寡糖生理功能的發(fā)現(xiàn)，綠色飼料的興起以及人們環(huán)保意識的增強，以及甘露聚糖酶潛在應用價值認識逐步的加深在甘露聚糖酶研究起到了推波助瀾的作用。許多β_甘露聚糖酶基因被克隆、表達以及性質(zhì)測定，其中細菌來源的甘露聚糖酶主要是酸偏中性的甘露聚糖酶。其分子量多在35kDa 55kDa之間，最適反應作用溫度為50°C 70°C。真菌的β-甘露聚糖酶一般呈酸性，分子量大約在45kDa 55kDa，最適作用PH為4.(Γ6.0，最適作用溫度為55°C 75°C。相對細菌而言，真菌來源的β _甘露聚糖酶最適反應pH值、pH穩(wěn)定性都偏低，耐熱性比細菌差。已發(fā)現(xiàn)的80多個β-甘露聚糖酶可以被劃分到糖苷水解酶家族5，26和113，其中絕大多數(shù)的甘露聚糖酶都分布在第5家族和26家族，目前只少數(shù)第113家族的甘露聚糖酶被報道，本研究發(fā)現(xiàn)的甘露聚糖酶是又一個新的第113家族的甘露聚糖酶。目前已經(jīng)被報道的β_甘露聚糖酶的性質(zhì)，均存在一些缺陷，例如，PH作用范圍不合適，熱穩(wěn)定性差，表達量低等，均不能滿足實際應用的需要。因此人們希望能夠找到一種新的能夠滿足實際應用需求的β -甘露聚糖酶，從而能夠進一步推廣該β_甘露聚糖酶在飼料、食品、醫(yī)藥等行業(yè)中應用。本發(fā)明從云南保山高溫溫泉出水處的土樣中分離的AlicyclobacillushesperidumA4菌株中得到了一個新的β _甘露聚糖酶基因，其編碼的甘露聚糖酶具有以下幾個優(yōu)點寬的pH (5-8)作用范圍、良好的熱穩(wěn)定性、強的蛋白酶抗性。所有這些優(yōu)點都意味著新發(fā)明的β_甘露聚糖酶在飼料、食品、醫(yī)藥等行業(yè)中，將會更有應用價值比以前所報道的β_甘露聚糖酶。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的是提供來源于嗜酸耐熱脂環(huán)酸芽孢桿菌AlicyclobacillushesperidumA4株的熱穩(wěn)定性良好，pH作用范圍廣的β -甘露聚糖酶。本發(fā)明的再一目的是提供上述熱穩(wěn)定性良好，pH作用范圍廣的β -甘露聚糖酶基因。本發(fā)明的再一目的是提供包含上述熱穩(wěn)定性良好，pH作用范圍廣的β -甘露聚糖酶重組載體。本發(fā)明的再一目的是提供包含上述熱穩(wěn)定性良好，pH作用范圍廣的β -甘露聚糖 酶基因的重組菌株。本發(fā)明的再一目的是提供一種制備上述熱穩(wěn)定性良好，pH作用范圍廣的β -甘露聚糖酶的方法。本發(fā)明的再一目的是提供上述穩(wěn)定性良好，pH作用范圍廣的β_甘露聚糖酶的應用。本發(fā)明首先所要解決的技術(shù)問題是克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種性質(zhì)優(yōu)良的、適合于在飼料、食品、醫(yī)藥等行業(yè)中應用的新β_甘露聚糖酶。所述β_甘露聚糖酶來源于嗜酸耐熱脂環(huán)酸芽抱桿菌Alicyclobacillus hesperidum A4,于2009年6月29日保存于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(北京市朝陽區(qū)大屯路，中國科學院微生物研究所，100101)，其保藏號為=CGMCC No. 3147 (CN101701214A)。從上述菌株中獲得了一種熱穩(wěn)定性良好，pH作用范圍廣的β_甘露聚糖酶MANl 13Α，其氨基酸序列如SEQ ID NO. I MSFAYIKGMT WGffVGHADTff DTLEAEHSMR EMAKLGINWT AIAFQGLQSDPHATTIRFNE 60PPMVSDKEVT VAIDRAHAMG LKVCLKPVVN CADGTffRAHI DFPDDAQGNEPSffSAffFASY 120SEFILHYAHI AETTACEMFC IGCEMVAADR RANEffRSLIE RVREVYHGPITYNCNHHQEE 180KVTffffDAVDL VSTSAYYPET EffKERVPVLR AFAQSVGKPV FFMEVGCPSRKGSAQKPYDff 240THPGAVDLEE QAQFYQTMFD AMENESffFYG FMLffDffPSRL YPREEAAHNRDYCMYGKPAE 300DIIRSFYASR 310其中，該酶全長310個氨基酸，屬于糖基水解酶第113家族，N端沒有信號肽結(jié)構(gòu)，屬于胞內(nèi)酶。其蛋白的理論分子量為36kDa。該β -甘露聚糖酶MAN113A同時具較好的熱穩(wěn)定性和有寬的作用pH范圍，最適溫度為55°C，在35 60°C間能維持50%以上的酶活性；在60°C處理30min，保持30%的酶活性；最適pH為6. 0，在pH5. 0-7. 5范圍內(nèi)，酶活能維持70%以上；同時具有極好的抗胃蛋白酶和胰蛋白酶處理能力。作為一種新型的酶制劑，該酶可廣泛用于動物飼料、食品、醫(yī)藥、釀酒、能源工業(yè)等。本發(fā)明還提供了編碼上述熱穩(wěn)定性良好，pH作用范圍廣的β_甘露聚糖酶的基因。該酶的全基因序列如SEQ ID NO. 2所示ATGTCTTTTG CATATATCAA GGGAATGACG TGGGGATGGG TCGGTCACGCTGATACTTGG 60GACACACTCG AAGCGGAACA CTCGATGCGC GAGATGGCGA AACTCGGGATCAATTGGACG 120GCCATCGCAT TTCAAGGTCT ACAATCCGAT CCGCATGCGA CCACCATTCG
CTTTAACGAG 180CCGCCGATGG TCAGCGACAA AGAAGTGACC GTCGCCATTG ACCGAGCACACGCAATGGGA 240CTTAAAGTTT GTCTGAAGCC AGTCGTTAAC TGCGCGGATG GCACCTGGCGCGCTCATATT 300GATTTTCCAG ATGATGCGCA AGGTAACGAG CCGTCGTGGA GCGCTTGGTTCGCCAGTTAT 360AGCGAGTTTA TCCTGCACTA TGCGCACATC GCGGAGACGA CAGCATGCGAGATGTTCTGC 420ATTGGTTGCG AAATGGTGGC GGCGGATCGC AGAGCCAACG AATGGCGGTCCCTTATCGAG 480CGCGTGCGGG AAGTTTATCA CGGCCCCATC ACATACAATT GTAACCACCATCAAGAGGAG 540AAGGTTACCT GGTGGGACGC GGTCGATCTC GTCTCCACGA GCGCCTATTATCCGGAAACC 600GAGTGGAAAG AGCGAGTTCC TGTCCTGCGC GCATTCGCCC AAAGCGTGGGCAAACCCGTG 660TTCTTCATGG AAGTTGGCTG TCCAAGCCGC AAAGGCTCAG CACAAAAGCCTTACGATTGG 720ACACACCCAG GCGCAGTCGA TCTCGAAGAA CAGGCCCAGT TCTATCAGACGATGTTTGAC 780GCCATGGAAA ACGAGTCTTG GTTCTATGGA TTCATGTTGT GGGATTGGCCAAGTCGCCTC 840TACCCACGCG AGGAAGCTGC CCACAATCGG GATTACTGCA TGTATGGGAAACCTGCCGAA 900GACATCATCC GGTCGTTTTA CGCATCTCGA ΤΑΑ933本發(fā)明通過PCR的方法分離克隆了這β-甘露聚糖酶基因manll3A，DNA全序列分析結(jié)果表明，β -甘露聚糖酶MANl 13Α基因全長933bp，編碼310個氨基酸和一個終止密碼子。將β-甘露聚糖酶基因manll3A序列及推導出的氨基酸序列在GenBank中進行BLAST 比對發(fā)現(xiàn)，與 Paenibacillus muciIagnosusKNP414 (AEI40686)來源的一個假使蛋白具有最高的氨基酸序列一致性為55%。與做過功能驗證的來源于Alicyclobacillusacidocalddarius (ABG77968)的內(nèi)切β _甘露聚糖酶最高一致性也僅為55%。說明ΜΑΝ113Α是一種新的甘露聚糖酶。本發(fā)明還提供了包含上述熱穩(wěn)定性良好，pH作用范圍廣的β_甘露聚糖酶ΜΑΝ113Α基因的重組載體，優(yōu)選為pET30a-manll3A。將本發(fā)明的β-甘露聚糖酶基因插入到表達載體合適的限制性酶切位點之間，使其核苷酸序列可操作的與表達調(diào)控序列相連接。作為本發(fā)明的一個最優(yōu)選的實施方案，優(yōu)選為將β -甘露聚糖酶基因插入到質(zhì)粒pET30a上的Nde I和Not I限制性酶切位點之間，使該核苷酸序列位于T7啟動子的下游并受其調(diào)控，得到重組大腸桿菌表達質(zhì)粒pET30a-manll3A。本發(fā)明還提供了包含上述甘露聚糖酶基因的重組菌株，優(yōu)選為重組菌株BL21/manll3A。
本發(fā)明還提供了一種制備熱穩(wěn)定性良好，pH作用范圍廣的β_甘露聚糖酶的方法，包括以下步驟I)用上述重組載體轉(zhuǎn)化宿主細胞，得重組菌株；2)培養(yǎng)重組菌株，誘導重組β -甘露聚糖酶的表達；以及3)純化所表達的β -甘露聚糖酶本發(fā)明還提供了上述作用pH范圍廣的β_甘露聚糖酶的應用。運用基因工程手段來產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)pH作用范圍廣的甘露聚糖酶產(chǎn)品還未見報道。本發(fā)明提供了一個新的甘露聚糖酶基因，其編碼的甘露聚糖酶具有熱穩(wěn)定性良好，PH作用范圍廣的β_甘露聚糖酶，可作應用于飼料、食品、醫(yī)藥等工業(yè)。根據(jù)本發(fā)明的技術(shù)方案就可以實現(xiàn)利用基因工程手段生產(chǎn)性質(zhì)優(yōu)良適合工業(yè)應用的甘露聚糖酶。


圖lmanl 13Α在畢赤酵母中表達的β -甘露聚糖酶的SDS-PAGE分析，1，分子量標準；2，純化的重組β -甘露聚糖酶。圖2本發(fā)明重組β -甘露聚糖酶manll3A的最適pH值。圖3本發(fā)明重組β -甘露聚糖酶manll3A的pH穩(wěn)定性。圖4本發(fā)明重組β -甘露聚糖酶manll3A的最適反應溫度。圖5本發(fā)明重組β -甘露聚糖酶manll3A的熱穩(wěn)定性。
具體實施例方式實驗條件I、菌株及載體Alicyclobacillus hesperidum A4云南保山高溫溫泉出水處的土樣，該菌最適生長溫度在55-60°C之間，最適生長pH為3. 03. 5。大腸桿菌EscherichiacoliBL21 (DE3)、表達載體 pET_30a(+)(購自 Novagen 公司)。2、酶類及其他生化試劑內(nèi)切酶購自TaKaRa公司，連接酶購自Invitrogen公司。PNPGal、植酸鈉等底物購自Sigma公司，其它都為國產(chǎn)試劑。3、脂環(huán)酸芽孢桿菌培養(yǎng)基為7#液體培養(yǎng)基(蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，微量元素(50X)20ml/L蒸餾水配制)。微量元素(50X):氮川三醋酸5g/L，NaClO. 4g/L,KN035. 15.g/L, NaN0334. 45g/L, Na2HP045. 5g/L, FeC135g/L, CaS043g/L, MgS045g/L。大腸桿菌培養(yǎng)基為LB (1%蛋白胨、O. 5%酵母提取物、l%NaCl，ρΗ7· O)。本發(fā)明中所用到重組遺傳學技術(shù)均為本領域中的常規(guī)技術(shù)。在以下實施例中未作詳細介紹的技術(shù)，均按照以下實驗手冊或文獻中的相關(guān)章節(jié)或部分來進行，包括=SambiOok等人，Molcular Cloning, A Laboratory Manual (第 3 版· 2001);和 Current Protocolsin Molecular Biology (Ausubel 等人編,1994)。實施例I脂環(huán)酸芽孢桿菌的篩選及分離在一個IOOmL三角瓶中裝7#液體培養(yǎng)基，調(diào)pH值為2. 0，滅菌后待用。在無菌操作臺將4°C冰箱中取出高溫泉流淌物的土壤樣品大約0. 5g，裝于上述三角瓶中，60°C靜止培養(yǎng)24小時進行富集培養(yǎng)。
梯度稀釋法分離取ImL經(jīng)過富集培養(yǎng)的菌液，加入裝有9mL無菌生理鹽水的試管，混勻后，即制成KT1的菌懸液。然后按10的倍數(shù)關(guān)系進行逐步稀釋到10_7。取10_5、10_6梯度的土壤懸液各100 μ L,分別涂于7#固體培養(yǎng)基平板上,于60°C恒溫箱培養(yǎng)。2-3天后待長出菌落，根據(jù)菌落形態(tài)的差異(主要是通過觀察菌落的顏色、濕潤情況、大小、菌落表面的皺褶等)，隨機挑取了 26株菌。再次通過梯度稀釋培養(yǎng)法(10_5、10_6稀釋液)，60°C條件下培養(yǎng)，獲得單一純化的菌株。實施例2脂環(huán)酸芽孢桿菌基因組的提取和16s DNA的鑒定基因組DNA提取取2天的菌液IOOOOrpm離心2min。取IOOmg菌體加500 μ L無菌水清洗，離心取沉淀。沉淀重懸于500 μ L提取液混合液，于37°C溫育60min，IOOOOrpm離心IOmin去沉淀。上清液用等體積酹、酹氯仿、氯仿依次抽提。取上層溶液加0. 6-1倍體積的異丙醇常溫沉淀lOmin。12000rpm離心15min。沉淀用70%乙醇清洗，稍離心，將沉淀烘干后用30 μ L無菌水溶解，備用。16s DNA 的鑒定選用 16SrDNA 通用引物 27F，(5-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3)和1492R, (5-GGTTACCTTGTTACGACTT-3),以分離菌株的基因組DNA為模板，進行PCR擴增。PCR反應條件為預變性95°C 3min，變性95°C lmin，退火55°C lmin，延長72°C 2min，30個循環(huán)，再延長72°C lOmin。PCR產(chǎn)物回收，直接送測序公司測序。經(jīng)BLAST分析，與已報道的多數(shù)Alicyclobacillus屬菌株的16S rDNA有99. 9%的相似性，初步確定分離的菌為脂環(huán)酸芽孢桿菌，并命名為 Alicyclobacillus hesperidum A4。實施例3脂環(huán)酸芽孢桿菌β -甘露聚糖酶編碼基因manll3A的克隆根據(jù)第113家族的甘露聚糖酶基因保守序列設計合成了兼并引物，以提取的脂環(huán)酸芽孢桿菌的基因組為模板進行兼并性PCR擴增。PCR反應參數(shù)為95°C 5min;94°C 30sec, 50^45°C 30sec, 72°C 30sec, 12個循環(huán)(其中每個循環(huán)后復性溫度下降1°C ) ;94°C 30miη, 45°C 30sec, 72°C 30sec, 30個循環(huán);；72°C IOmin0電泳檢測分析擴增的產(chǎn)物，回收大小合適的片段，進行測序。測序結(jié)果分析表明所獲得的200bp左右的基因片段為β-甘露聚糖酶基因片段。根據(jù)已知序列，采用TAIL-PCR方法分別設計上下游特異性引物，擴增得到基因的全部序列。最后經(jīng)過正確的拼接，最終得到一個β_甘露聚糖酶基因，Manll3A，該基因的開放閱讀框以ATG為起始密碼子，由933個堿基組成，編碼310個氨基酸和一個終止密碼子TAA。實施例4 β -甘露聚糖基因manll3A的表達根據(jù)已克隆的-甘露聚糖酶基因的編碼序列設計表達引物manl13A-F，5-GGGCATATGTCTTTTGCATATATCAAGG-3’，manl 13A-R，5’ -GGGCGGCCGCTCGAGATGCGTAAAACGACC-3，，并在引物manll3A-F的末端引入酶切位點Nde I，在引物manll3A_R的末端引入NotI，以脂環(huán)酸芽孢桿菌基因組DNA為模板，進行PCR擴增得到成熟蛋白編碼序列。用Nde I和NotI酶切，連接到表達載體pET-30a中，獲得含有β -甘露聚糖編碼基因manll3A的重組質(zhì)粒pET-30a-manll3A,并轉(zhuǎn)化大腸桿菌 E. coli BL21 (DE3)，獲得重組菌株 pET-30a_manll3A/DE3。 取含有重組質(zhì)粒的BL21 (DE3 )菌株和含有pET_30a空質(zhì)粒的BL21 (DE3 )菌株(作對照)，分別接種于3mLLB (加有100μ g/mL的氨芐青霉素)培養(yǎng)液中，10_37°C不同條件下快速振蕩培養(yǎng)過夜；按照1/100體積接種過夜培養(yǎng)液于含有100 μ g/mL氨芐青霉素的20mL LB培養(yǎng)液中(IOOmL三角瓶)，快速振蕩培養(yǎng)約2h (0D600達到O. 6)，加入1/1000體積lmol/L的誘導劑IPTG，振蕩培養(yǎng)24h，使其表達目的蛋白。取培養(yǎng)液，10，OOOrpm離心5min，收集沉淀，加入適量的檸檬酸緩沖液，利用超聲波破碎細胞。離心取上清測定甘露聚糖酶的活性。實施例5重組β -甘露聚糖酶的純化根據(jù)NEB的裝柱說明書將ImL的NTA柱質(zhì)加到空柱子中，并準備如下ρΗ7. 6，不同咪唑濃度0、20、40、60、80、100和200mmol/L的緩沖液。具體操作流程離心收集誘導后的菌體，加入用5mL0mmol/L的咪唑緩沖液重懸，超聲波破碎條件為冰浴中破碎，破碎3sec停止4sec每組80次。將誘導后的細胞破碎液于4°C、12，OOOrpm離心lOmin，獲得上清(粗酶液);鎳柱平衡處理，柱子先用10-20mL水平衡，再用15-20mL0mmol/L的咪唑緩沖液平衡，力口樣品5mL粗酶液并開始收集穿透峰；然后依次加入20、40、60、80、100和200mmol/L的各種咪唑緩沖液5mL洗脫并收集洗脫液；然后對收集管中的溶液測定甘露聚糖酶的酶活，并進行蛋白電泳分析。實施例6重組β -甘露聚糖酶部分性質(zhì)分析采用DNS法對本發(fā)明的甘露聚糖酶進行活性分析。具體方法如下在ρΗ6. 0，37°C條件下，ImL的反應體系包括100 μ L適當?shù)南♂屆敢?900 μ L底物,反應IOrnin,加入I. 5mLDNS終止反應，沸水煮5mn。冷卻后540nm測定OD值。甘露聚糖酶活性單位定義在一定條件下，每分鐘分解甘露聚糖生成I μ mol還原糖所需的酶量為I個活性單位(U)。(I)甘露聚糖酶MANl 13A的最適pH及pH穩(wěn)定性經(jīng)純化的甘露聚糖酶MAN113A在不同的pH下進行酶促反應以測定其最適pH。所用緩沖液為PHO. 5 2. 2KCI-HC1緩沖液，pH2. 2 8. O的檸檬酸一磷酸氫二鈉系列緩沖液及pH8. O 10. OTris-HCl系列緩沖液。純化的甘露聚糖酶MAN113A在不同pH的緩沖體系.37°C下測定的pH適性結(jié)果(圖2)表明MAN113A的最適pH為6. 0，在pH5. 0-7. 5范圍內(nèi)，酶活能維持70%以上；在pH8. O時，人能保持40%的酶活性。將酶液在不同pH值的緩沖液中于37°C下處理60min，再測定酶活性以研究酶的pH穩(wěn)定性。結(jié)果表明(圖3)，在pH5. O 10. O之間該酶保持了非常好的穩(wěn)定性，酶活能維持在90%以上，這說明此酶具有較好的耐酸耐堿性。
(2)甘露聚糖酶MANl13A反應最適溫度及熱穩(wěn)定性。最適溫度的測定在pH6. O緩沖體系及不同溫度下進行酶促反應。酶反應最適溫度測定結(jié)果(圖4)表明，其最適溫度為55°C。耐溫性測定為甘露聚糖酶在不同溫度下處理不同時間，再在37°C下進行酶活性測定。酶的熱穩(wěn)定性試驗表明(圖5)，MAN113A在50°C下保溫60min，酶活性基本不損失；60°C下保溫IOmin.剩余酶活性為35%。這表明MAN113A具有較好的熱穩(wěn)定性。(3)甘露聚糖酶MAN5A的抗胰蛋白酶和胃蛋白酶能力。用pH2. OKCl-HCl緩沖液配制O. lmg/mL胃蛋白酶，pH7. OTris-HCI緩沖液配制
O.lmg/mL胰蛋白酶。取pH2. OKCl-HCl緩沖液稀釋后的O. 5mL純化的酶液加入O. 5mL胃蛋白酶.pH7. OTris-HCI緩沖液稀釋后的O. 5mL純化的酶液加入O. 5mL胰蛋白酶混合，蛋白 酶/甘露驟糖酶(w/w) ^ O. 1，371保溫，601^11取樣，在pH6. O及37 °C條件下測定酶活性。實驗結(jié)果表明甘露聚糖酶MAN113A用胃蛋白酶處理60min后，酶活完全損失。在用胰蛋白酶處理后酶活仍能保持為原來的83. 5% ;說明β -甘露聚糖酶ΜΑΝ113Α具有非常好的抗胰蛋白酶水解的能力。(4)底物特異性分析吸取純化好的相同酶量甘露聚糖酶MANl 13Α，分別用O. 3%魔芋粉，O. 3%角豆膠、O. 3%瓜兒豆膠、O. 3%可溶性淀粉和O. 3%的羥甲基纖維素鈉作底物，按DNS法測定β -甘露聚糖酶ΜΑΝ113Α對不同底物的水解活性。其中酶活性最高的為魔芋粉，并以其作為參考，活性定為100%。角豆膠、瓜兒豆膠、可溶性淀粉和羥甲基纖維素鈉的相對酶活性分別為62%、14. 7%、0. 5%和O. 2%。因此可以確定β _甘露聚糖酶MANl 13Α最適底物為魔芋粉，對角豆膠和瓜兒豆膠也就較好的水解能力。
權(quán)利要求
1.一種可來源于嗜酸耐熱菌的第113家族的β-甘露聚糖酶MAN113A，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO. I所示。
2.一種可來源于嗜酸耐熱菌的第113家族的β-甘露聚糖酶基因manll3a，其特征在于，編碼權(quán)利要求I所述的β -甘露聚糖酶MANl 13Α。
3.如權(quán)利要求2所述的β-甘露聚糖酶基因manll3a，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 2。
4.包含有權(quán)利要求2所述β-甘露聚糖酶基因manl13a序列的重組表達載體。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的表達載體,其特征在于,所述表達載體為pET30a-manll3A。
6.包含權(quán)利要求2所述β-甘露聚糖酶基因manll3a的重組菌株。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的重組菌株，其特征在于，所述宿主細胞為畢赤酵母細胞、釀酒酵母細胞、大腸桿菌、曲霉或木霉細胞，優(yōu)選為畢赤酵母細胞。
8.根據(jù)權(quán)利要求I所述的β-甘露聚糖酶MANl 13Α的應用。
9.根據(jù)權(quán)利要求2所述β-甘露聚糖酶基因manll3a的應用。
全文摘要
本發(fā)明涉及基因工程領域，具體地涉及一種來源于嗜酸耐熱菌的第113家族的新β-甘露聚糖酶、基因和及其應用。根據(jù)本發(fā)明的β-甘露聚糖酶MAN113A，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。本發(fā)明的甘露聚糖酶具有以下幾個優(yōu)點寬的pH(5-8)作用范圍、良好的熱穩(wěn)定性、強的蛋白酶抗性。所有這些優(yōu)點都意味著新發(fā)明的β-甘露聚糖酶在飼料、食品、醫(yī)藥等行業(yè)中，將會更有應用價值比以前所報道的β-甘露聚糖酶。
文檔編號C12N15/63GK102816750SQ20121029435
公開日2012年12月12日 申請日期2012年8月17日 優(yōu)先權(quán)日2012年8月17日
發(fā)明者詹志春, 陶純長, 方萍 申請人:武漢新華揚生物股份有限公司