專利名稱：刺糖多孢菌染色體的基因整合的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明應(yīng)用于分子遺傳學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，其中，基因可以整合入刺糖多孢菌(Saccharopolyspora spinosa)的染色體。一種關(guān)鍵的代謝工程方法是在對多殺菌素產(chǎn)生或生長幾乎沒有到?jīng)]有負面影響的染色體DNA區(qū)域整合和表達靶基因。
背景技術(shù)：
正如美國專利No. 5，362，634公開的，發(fā)酵產(chǎn)物A83543是由剌糖多孢菌 (Saccharopolyspora spinosa)產(chǎn)生的相關(guān)化合物家族。該家族的已知成員被稱作因子或組分，而且每一個都給予標識字母命名。在下文中這些化合物指多殺菌素A、B等。多殺菌素化合物對于防治蜘蛛、線蟲類及昆蟲，尤其是鱗翅目(Lepidoptera)、雙翅目(Diptera)物種。這些化合物被認為對環(huán)境友好，具有有吸引力的毒理學(xué)譜(toxicological profile)。這些天然產(chǎn)生的多殺菌素化合物是大環(huán)內(nèi)酯類，由附接有兩個脫氧糖的21-碳四環(huán)內(nèi)酯組成，所述兩個脫氧糖為ー個中性糖(鼠李糖)和一個氨基糖(福樂糖胺(forosamine))(參見Kirst等，(1991))。如果氨基糖不存在，將該化合物稱為假糖苷配基(pseudoaglycones)A、D等，如果中性糖不存在，則將該化合物稱為反式假糖苷配基(reverse pseudoaglycones)A、D等。更優(yōu)選的命名法將假糖苷配基稱為多殺菌素A17_Psa、多殺菌素D17_Psa等，而將反式假糖苷配基稱為多殺菌素A9_Psa，多殺菌素D9_Psa等。天然產(chǎn)生的多殺菌素化合物可通過刺糖多孢菌菌株NRRL18395、18537、18538、18539、18719、18720、18743和18823以及由此而來的衍生物發(fā)酵產(chǎn)生。已經(jīng)保藏了這些培養(yǎng)物并使其成為美國農(nóng)業(yè)部農(nóng)業(yè)研究服務(wù)部門中西部地區(qū)北方區(qū)域研究中心(北方大學(xué)街道1815號，皮奧里亞，111.，61604)的原種培養(yǎng)物保藏的一部分。美國專利No. 5，362，634以及相應(yīng)的歐洲專利號0375316B1涉及多殺菌素A、B、C、D、E、F、G、H和J。據(jù)稱這些化合物通過培養(yǎng)選自NRRL18395、NRRL18537、NRRL18538和NRRL18539的新的微生物剌糖多孢菌的菌株產(chǎn)生。1093/09126涉及多殺菌素し] 、隊0、1 、3和1'。其中還討論了兩種產(chǎn)生多殺菌素J的菌株NRRL18719和NRRL18720，和一種產(chǎn)生多殺菌素Q、R、S和T的菌株NRRL18823。W094/20518和美國專利No. 5，670, 486涉及多殺菌素K、O、P、U、V、W和Y及其衍生物。其中也討論了產(chǎn)多殺菌素K的菌株NRRL18743。生產(chǎn)多殺菌素化合物的挑戰(zhàn)源自需要鑒定并驗證刺糖多孢菌基因組中的中性位點，其中包含基因表達盒的多核苷酸能夠整合并穩(wěn)定表達。在其他會賦予現(xiàn)存多殺菌素產(chǎn)生菌株新的有益特征的基因表達盒之外，引入的基因表達盒可含有生物合成基因，所述生物合成基因提供產(chǎn)生可具有不同殺蟲活性譜的新的多殺菌素衍生物的方法，或能増加多殺菌素的滴度水平的基因表達盒。鑒定和引入導(dǎo)致多殺菌素化合物的產(chǎn)生增加的基因會是有利的。使用中性位點也會是有利的，其中穩(wěn)定的整合對多殺菌素產(chǎn)生、生長或其他期望的代謝特征造成很少的負面影響或沒有負面影響。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供鑒定和驗證刺糖多孢菌基因組中性位點的方法，其中含有至少ー種基因表達盒的新的多核苷酸能夠整合并穩(wěn)定表達。本發(fā)明的一些實施方案包括刺糖多孢菌基因組中的中性位點的鑒定和驗證，其中含有至少ー種基因表達盒的新的多核苷酸能夠整合并在后代中穩(wěn)定表達。本發(fā)明的實施方案也可包括使用遮蔽蛋白聚酮合成酶(obscurin polyketidesynthase ；PKS)基因座作為中性位點用于在刺糖多孢菌基因組中整合外源或天然的含有基因表達盒的多核苷酸。更具體地說，在不負面影響多殺菌素產(chǎn)生、生長或其他期望的代謝 特征的情況下，可以破壞遮蔽蛋白聚酮合成酶(PKS)基因座的obsA基因。本發(fā)明的其他方法包括將多核苷酸整合入刺糖多孢菌菌種的染色體DNA中，該方法可用于產(chǎn)生殺蟲劑、其整合體，并且還可用于整合體的應(yīng)用。本發(fā)明的一些實施方案可包括鑒定刺糖多孢菌基因組中任何中性位點以及穩(wěn)定表達的含有基因表達盒的多核苷酸的整合的方法。本發(fā)明的其他實施方案可包括將多核苷酸整合入刺糖多孢菌基因組中而不負面影響多殺菌素產(chǎn)生、生長或其他期望的代謝特征。本發(fā)明的其他實施方案可包括將含有基因表達盒的多核苷酸整合入刺糖多孢菌基因組中，所述多核苷酸的表達導(dǎo)致増加的多殺菌素產(chǎn)生。附圖
簡述圖I描繪了將粘粒克隆的末端序列定位到遮蔽蛋白基因族上。顯不重置的粘?？寺?。實心豎條表示相對于遮蔽蛋白基因簇的粘?？寺?E3和粘?？寺?N14中插入物的實際大小。虛線表不只有一個粘粒末端在遮蔽蛋白基因族中。圖2描繪了質(zhì)粒PIJ773，其含有阿泊拉霉素抗性表達盒(標記為aac (3) IV)。
具體實施例方式對于用于多殺菌素菌株改善的代謝工程有用的分子工具包括鑒定和驗證剌糖多孢菌基因組中可以引入基因表達盒的中性位點。中性位點定義為基因組中的DNA區(qū)域，其對刺糖多孢菌初級代謝活性、多殺菌素產(chǎn)生以及其他期望的特征具有很少的負面影響或沒有負面影響。鑒定的中性位點意圖用于穩(wěn)定整合和表達對于刺糖多孢菌為天然或異源的靶基因，其可以包括i)將有益的特征引入現(xiàn)有的多殺菌素產(chǎn)生菌株，如異源血紅蛋白基因的表達；ii)改善現(xiàn)有的多殺菌素產(chǎn)生菌株的特定特征(例如改善由假糖苷配基到多殺菌素的生物轉(zhuǎn)換)；iii)在不同的中性位點引入同一基因的多個拷貝，從而最大化靶基因的益處并確保工程化重組菌株的穩(wěn)定性；或iv)引入多個靶基因以同時消除兩個或更多個控制多殺菌素生物合成和產(chǎn)生的限速步驟的瓶頸。刺糖多孢菌中對于生物體的初級代謝活性非關(guān)鍵性的次級代謝途徑表現(xiàn)為有吸引力的中性位點來源。在這些中，非多殺菌素聚酮合成酶基因簇尤其受到關(guān)注，因為破壞該基因簇可能導(dǎo)致多殺菌素生物合成和產(chǎn)生所必需的常見こ酰CoA前體和輔因子的潛在競爭途徑的消除。這可在靶基因的益處和增加的前體可使用性間產(chǎn)生協(xié)同作用。在刺糖多孢菌染色體中整合的基因有很多不同的用途。無論天然或異源的克隆基因，均可以用于改善多殺菌素的產(chǎn)量和產(chǎn)生新的多殺菌素。通過在特定菌株的基因組中整合雙重拷貝的基因以克服該菌株中限速的酶來獲得改善的產(chǎn)量。在有些情況下，由于缺少所需的酶使特定突變菌株中的生物合成途徑被阻斷，而通過整合所需基因的拷貝可以恢復(fù)期望的多殺菌素的產(chǎn)生。在生物合成途徑遭破壞的其他情況下，可以產(chǎn)生不同的前體菌株。本文使用的下列定義將用作參考來解釋權(quán)利要求和說明書。如本文使用的，本發(fā)明中元件或組分前的不定冠詞“ー / ー個/ 一種”針對該元件或組分的出現(xiàn)(如發(fā)生)數(shù)量意圖為非限制性的。因此，“一/一個/ 一種”應(yīng)當被解讀為包括ー個/ 一種或至少ー個/至少ー種，并且元件或組分的單數(shù)形式也包括復(fù)數(shù)，除非該數(shù)明顯表示単數(shù)。如本文使用的，術(shù)語“包含”和“包括”意指存在如權(quán)利要求中涉及的規(guī)定的特征、·整體(integer)、步驟或組分,但不排除存在或增加ー個或多個其他特征、整體、步驟、組分或其組合。這意味著“包含”或“包括” 一系列元件的組合物、混合物、過程/エ藝、方法、物品或裝置不限于這些元件，而是可能包括其他未明確列出的或其固有的元件。如本文使用的，“或”指相容的和互斥的“或”。例如，以下任何一種都滿足條件A或B :A為真(或存在的)且B為偽(或不存在的)，A為偽(或不存在的)且B為真(或存在的)，以及A和B均為真(或存在的)。如本文使用的，術(shù)語“約”修飾本發(fā)明中的成分或反應(yīng)物的量，或是用于指可能發(fā)生的數(shù)字量的變化，例如，經(jīng)由在現(xiàn)實的世界中用于制備濃縮物或使用溶液的典型測量和液體處理過程；經(jīng)由這些過程中的意外錯誤；經(jīng)由用于制備組合物或?qū)嵤┓椒ǖ某煞衷谥圃?、來源或純度上的差異；等等。術(shù)語“約”也包括由于從特定的初始混合物產(chǎn)生的組合物的不同平衡條件而不同的量。無論有或沒有術(shù)語“約”修飾，權(quán)利要求都包括所述量的等效量。如本文使用的，術(shù)語“發(fā)明”或“本發(fā)明”是非限制性術(shù)語，旨在包含如說明書中描述的和權(quán)利要求中記載的所有可能的變化。如本文使用的，術(shù)語“多肽”和“肽”會是可以互換使用的，用于指兩個或更多個氨基酸通過肽鍵連接在一起的聚合物。在ー個方面，該術(shù)語也包括多肽的表達后修飾，例如，糖基化、こ酰化、磷酸化等等。例如，含有一個或多個氨基酸類似物或標記的氨基酸和肽模擬物(peptidomimetic)的肽包括在該定義中。肽可能包含L-氨基酸。如本文使用的，術(shù)語“目的肽”、“Ρ0Ι”、“基因產(chǎn)物”、“靶基因產(chǎn)物”和“靶編碼區(qū)基因產(chǎn)物”指由重組表達的外源基因編碼的期望的異源肽/蛋白質(zhì)產(chǎn)物。目的肽可包括任何肽/蛋白質(zhì)產(chǎn)物，其包括但不限于蛋白質(zhì)、融合蛋白、酶、肽、多肽和寡肽。目的肽的大小為長度范圍從2到398個氨基酸。如本文使用的，術(shù)語“遺傳構(gòu)建體”指一系列用于調(diào)節(jié)生物體基因型或表型的連續(xù)核酸。遺傳構(gòu)建體的非限制性實例包括但不限于核酸分子、開放閱讀框、基因、表達盒、載體、質(zhì)粒等等。如本文使用的，術(shù)語“內(nèi)源基因”指生物體基因組中在其天然位點的天然基因。
如本文使用的，“外源基因”指正常情況下不存在于宿主生物體中，但通過基因轉(zhuǎn)移引入該宿主生物體中的基因。外源基因可包括插入到非天然生物體的天然基因或嵌合基因。如本文使用的，涉及特定生物體/基因組內(nèi)的序列的術(shù)語“異源的”表明該序列源自外源物種，或者，如果來自相同物種，則通過有意的人為干預(yù)實質(zhì)上進行了修飾而在組成和/或基因組位點上不同于其天然形式。因此，例如，異源基因表達指通過將來自ー種生物體/基因組的基因置于不同的生物體/基因組中而表達該基因的方法。如本文使用的，術(shù)語“重組體”指人工組合兩個本來是單獨的序列片段(otherwiseseparated segments of sequence),例如,通過化學(xué)合成或通過遺傳工程技術(shù)操作分離的核酸片段?！爸亟M體”還包括所提到的通過引入異源核酸而經(jīng)過修飾的細胞或載體，或衍生自這樣修飾的細胞的細胞，但是不包括通過自然發(fā)生事件(如，自發(fā)突變、天然轉(zhuǎn)化、天然轉(zhuǎn)導(dǎo)、天然轉(zhuǎn)座)造成的細胞或載體的改變，例如不存在有意的人為干預(yù)而發(fā)生的那些改變。 術(shù)語“遺傳工程化的(genetically engineered) ”和“遺傳改變的”指科學(xué)改變活生物體中遺傳物質(zhì)的結(jié)構(gòu)。其牽涉重組DNA的產(chǎn)生和使用。更具體而言，將其用于描述來自天然存在的生物體的經(jīng)遺傳工程化或修飾的生物體。遺傳工程化可以通過許多本領(lǐng)域已知的技術(shù)進行，諸如例如使用質(zhì)粒、病毒或其他載體進行的基因取代、基因擴增、基因破壞、轉(zhuǎn)染、轉(zhuǎn)化。遺傳修飾的生物體，例如遺傳修飾的微生物，也經(jīng)常稱作重組生物體，如重組微生物。如本文使用的，術(shù)語“破壞的”或“破壞”在涉及基因時指已經(jīng)通過遺傳工程化或通過改變該基因活性的天然原因而經(jīng)過操作或修飾的基因。這樣的基因活性可以是增加的或減少的。此外，這樣的破壞可能消除蛋白質(zhì)功能。為了促進這種減少，可以減少基因的拷貝數(shù)，諸如例如通過該基因的不足表達(underexpression)或破壞該基因。與野生型基因相比，如果所述基因的轉(zhuǎn)錄水平降低則稱該基因為“表達不足的”。這可以通過例如量化mRNA量作為基因表達的指示的Northern印跡分析來測量。如本文使用的，如果與從野生型基因產(chǎn)生的mRNA量相比，產(chǎn)生的mRNA量減少了至少I %、2%、5%、10%、25%、50%、75%、100%、200%或甚至大于500%，則基因是表達不足的。或者，可使用弱啟動子指導(dǎo)多核苷酸的表達。在另ー個實施方案中，可以改變基因上游的啟動子、調(diào)節(jié)區(qū)和/或核糖體結(jié)合位點來實現(xiàn)降低的表達。表達也可以通過減少信使RNA的相對半衰期來降低。在另ー個實施方案中，多肽的活性本身可以通過在多肽氨基酸序列中采用ー個或多個減少活性的突變來減少。例如，改變多肽對其相應(yīng)底物的親和カ可導(dǎo)致活性減少。同樣，可減少多肽的相對半衰期。在有降低的基因表達或降低的活性的任ー情況下，可以通過改變細胞培養(yǎng)基的組成和/或用于培養(yǎng)的方法來實現(xiàn)所述降低。如本文使用的“降低的表達”或“降低的活性”意指與野生型蛋白質(zhì)、多核苷酸、基因相比，或與該多核苷酸或多肽降低之前存在的蛋白質(zhì)的活性和/或濃度相比，至少5%、10%、25%、50%、75%、100%、200%或甚至超過500%的減少。obsA基因組基因座的活性也可通過將蛋白質(zhì)與其活性的特異性或通用抑制劑接觸來降低。在本文術(shù)語“降低的活性”和“減少或消除的活性”可互換使用。在另ー個實施方案中，可以改變基因上游的啟動子、調(diào)節(jié)區(qū)和/或核糖體結(jié)合位點以實現(xiàn)増加的表達。過表達也可通過增加信使RNA的相對半衰期來降低。在另ー個實施方案中，多肽本身的活性可以通過在多肽氨基酸序列中采用ー個或多個增加活性的突變來增加。例如，改變多肽對其相應(yīng)底物的親和カ可導(dǎo)致增加的活性。同樣，可增加多肽的相對半衰期。在有基因過表達或増加的活性的任ー情況下，可以通過改變細胞培養(yǎng)基的組成和/或用于培養(yǎng)的方法來實現(xiàn)所述增加。如本文使用的“過表達”或“増加的活性”意指與野生型蛋白質(zhì)、多核苷酸、基因相比，或與該多核苷酸或多肽降低之前存在的蛋白質(zhì)的活性和/或濃度相比，至少5 %、10 %、25 %、50 %、75 %、100 %、200 %或甚至超過500 %的增加。obsA基因組基因座的活性也可通過將蛋白質(zhì)與其活性的特異性或通用抑制劑接觸來増加。在本文術(shù)語“過表達”和“增加的活性”可互換使用。表述“調(diào)控序列”概括地指啟動子序列、核糖體結(jié)合位點、轉(zhuǎn)錄終止序列、上游調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域、增強子等等，它們在宿主細胞中共同提供編碼序列的轉(zhuǎn)錄和翻譯。并不是所有這些調(diào)控序列都始終需要存在于重組載體中，只要期望的基因能夠得到轉(zhuǎn)錄和翻譯即可。“重組”指兩個DNA或RNA分子之間部分DNA或RNA序列的重排?！巴粗亟M”發(fā)生在兩個DNA分子之間，所述兩個DNA借助存在于每個DNA分子中的同源的或互補的核苷酸序列雜交。 術(shù)語“嚴格條件”或“在嚴格條件下雜交”指在該條件下探針會優(yōu)先與其靶亞序列雜交，且較低程度或完全不與其他序列雜交。在核酸雜交實驗如Southern雜交和Northern雜交的語境中的“嚴格雜交”和“嚴格雜交洗滌條件”是序列依賴性的，并且在不同的環(huán)境參數(shù)下是不同的。紐約埃爾塞維爾科學(xué)出版社的Tiissen(1993)的《生物化學(xué)和分子生物試驗技木》中第一部分第二章的“用核苷酸探針雜交”中關(guān)于雜交原理和核苷酸探針測定法策略的概述(Tijssen(1993)Laboratory Techniques in Biochemistry and MolecularBiology-Hybridization with Nucleic Acid Probes part I chapter 2 Overview ofprinciples of hybridization and the strategy of nucleic acid probe assays,Elsevier,New York)中有核苷酸雜交的詳盡指南。一般來說，高嚴格雜交和洗漆條件選擇為低于在限定的離子強度和PH下特定序列的熱解鏈溫度(Tm)約5°C。Tm指(在限定的離子強度和PH下)50%的靶序列雜交到完全匹配的探針的溫度。非常嚴格條件選擇為與特定探針的Tm相等。用于互補核酸的雜交(其在Southern或Northern印跡中的濾膜上具有超過100個互補殘基)的嚴格雜交條件的實例為，具有Img肝素的50%甲酰胺，在42°C，使雜交過夜進行。高嚴格洗滌條件的實例是在72°C，0. 15M NaCl，約15分鐘。嚴格洗滌條件的實例是在65°C，0. 2 X SSC洗滌15分鐘(關(guān)于SSC緩沖液的描述參見，Sambrook等，(1989)，分子克隆-實驗室手冊(第二版)1-3卷，冷泉港實驗室，冷泉港出版社，紐約(SambiOok etal. , (1989)Molecular Cloning-A Laboratory Manual(2nd ed.) Vol. 1-3, Cold SpringHarbor Laboratory, Cold Spring Harbor Press, NY))。通常，在高嚴格洗漆前為低嚴格洗滌，以去除背景探針信號。用于例如超過100個核苷酸的雙鏈體的中等嚴格洗滌的實例是在45°C，1XSSC，15分鐘。對于例如超過100個核苷酸的雙鏈體的低嚴格洗滌的實例是*40°C，4-6XSSC，15分鐘。一般來說，在特定的雜交測定法中，與對于不相關(guān)的探針觀察到的相比為2x(或更高的)信噪比表明檢測到特異性雜交。在嚴格條件下彼此不雜交的核酸，如果它們編碼的多肽基本上相同，則仍為基本上相同的。這發(fā)生在，例如，當核酸拷貝是使用遺傳密碼所允許的最大密碼子簡并性來產(chǎn)生的吋。
本發(fā)明也涉及在嚴格條件下，優(yōu)選在高嚴格條件下可與如本發(fā)明的多核苷酸雜交的分離的多核苷酸。如本文使用的，術(shù)語“雜交” g在描述雜交和洗滌條件，在該條件下，彼此至少約50%、至少約60%、至少約70%，更優(yōu)選至少約80%，甚至更優(yōu)選至少約85%至90%，最優(yōu)選至少95%同源的核苷酸序列通常保持彼此雜交。在一個實施方案中，本發(fā)明的核酸與本申請中所示的核酸序列或其互補物為至少 40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或更高同源的。嚴格雜交條件的另ー個非限定性實例是，在約45°C在6X氯化鈉/檸檬酸鈉(SSC)中雜交，隨后在50°C，優(yōu)選在55 0C，更優(yōu)選在60 °C，并且甚至更優(yōu)選在65 °C，在1XSSC、0. 1% SDS中進行一次或多次洗滌。
高嚴格條件可包括在42°C溫育數(shù)天的時間，如2-4天，使用標記的DNA探針，例如洋地黃毒苷(DIG)標記的DNA探針，隨后為在室溫在2XSSC、0. 1% SDS中的一次或多次洗滌，和在65-68°C在O. 5XSSC、0. 1% SDS或O. I X SSC,O. 1% SDS中的一次或多次洗滌。具體而言，高嚴格條件包括，例如，使用DIG標記的DNA探針(由例如使用DIG標記系統(tǒng)制備；羅氏診斷有限公司，68298 曼海姆，德國(Roche Diagonostics GmbH,68298Mannheim,Germany)),在溶液中，如DigEasyHyb溶液(羅氏診斷有限公司(Roche DiagonosticsGmbH))(含有或不含 100ug/ml 鮭精 DNA)，或包含 50% 甲酰胺、5 X SSC (150mM NaCl、15mM 檸檬酸鈉)、0. 02%十二烷基硫酸鈉、O. 1% N-月桂酰肌氨酸和2%封閉試劑的溶液(羅氏診斷有限公司(Roche Diagonostics GmbH))，在42°C溫育2小時到4天，隨后在室溫在2XSSC和O. 1% SDS中洗滌濾膜2次，5-15分鐘，然后再在65-68°C，在O. 5 X SSC和O. I % SDS或O. I X SSC和O. 1% SDS中洗滌兩次，15-30分鐘。在一些實施方案中，在高嚴格條件下與本發(fā)明的核苷酸序列雜交的本發(fā)明的分離的核酸分子可對應(yīng)于天然存在的核酸分子。如本文使用的，“天然存在的”核酸分子指具有自然界中存在的核苷酸序列的RNA或DNA分子(例如，編碼天然蛋白質(zhì))。本領(lǐng)域技術(shù)人員會知道哪些條件適用于嚴格和高嚴格雜交條件?，F(xiàn)有技術(shù)中可以容易地獲得關(guān)于這些條件的其他指導(dǎo)，例如，Sambrook等，1989，分子克隆，實驗室手冊，冷泉港出版社，紐約(Sambrook et al. , 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Press, N. Y.);和 Ausubel 等(編輯)，1995,分子生物學(xué)的通用流程(Current Protocols in Molecular Biology), (John Wiley&Sons，紐約)。含有多殺菌素生物合成酶基因的DNA的克隆片段會使在多殺菌素產(chǎn)生中編碼限速酶的基因能夠加倍(duplication)。這能夠用于在任何編碼的活性之一限制了期望的多殺菌素合成的情況中來提高產(chǎn)量。當多殺菌素聚酮合成酶連鎖的基因通過將含有它們的粘粒整合入刺糖多孢菌而加倍時，觀察到多殺菌素A/D的產(chǎn)量增加(Madduri等，2001)。在另一個實例中，在弗氏鏈霉菌(Streptomyces fradiae)的發(fā)酵中，通過加倍編碼限速甲基轉(zhuǎn)移酶的基因?qū)崿F(xiàn)了這種類型的產(chǎn)量增加，所述甲基轉(zhuǎn)移酶使大菌素轉(zhuǎn)化為泰樂菌素(Baltz等，1997)。特定的中間體(或它們的天然衍生物)能夠通過刺糖多孢菌的突變菌株合成，在所述刺糖多孢菌的突變菌株中，已經(jīng)破壞了某些編碼多殺菌素生物合成的酶的基因。這樣的菌株可以通過經(jīng)由同源重組整合含有靶基因的內(nèi)部片段的誘變質(zhì)粒來產(chǎn)生。在質(zhì)粒整合后，形成生物合成基因的兩個不完整拷貝，由此消除其編碼的酶功能。這種酶的底物，或其ー些天然衍生物，應(yīng)在該突變菌株發(fā)酵時積累。將這樣的策略有效地用于生成產(chǎn)生新的6-脫氧紅霉素衍生物的紅色糖多孢菌(Saccharopolyspora erythraea)菌株(Weber和McAlpine,1992)。這樣的菌株可經(jīng)由雙交換同源重組通過與誘變質(zhì)粒交換靶區(qū)產(chǎn)生，所述誘變質(zhì)粒含有在所述靶區(qū)側(cè)翼的非突變序列之間的新片段。該雜合基因會產(chǎn)生具有改變的功能的蛋白質(zhì)，其或是缺少活性，或是實施新的酶促轉(zhuǎn)化。新的衍生物會在所述突變菌株發(fā)酵時積累。將這樣的策略有效地用于生成產(chǎn)生新的脫水紅霉素衍生物紅色糖多孢菌菌株(Donadio等，1993)?？寺×硕鄽⒕厣锖铣苫蚝拖嚓P(guān)的0RF，并確定了各自的DNA序列?？寺〉幕蚝?ORF 在下文中命名為 spnA、spnB、spnC、spnD、spnE、spnF、spnG、spnH、spnl、spnj、spnK、spnL、spnM、spnN、spnO、spnP、spnQ、spnR、spnS、ORFLl5> 0RFL16、ORFRl、0RFR2、剌糖多孢菌gtt、刺糖多孢菌gdh、刺糖多孢菌epi和刺糖多孢菌kre。 刺糖多孢菌產(chǎn)生統(tǒng)稱為“多殺菌素”的9種密切相關(guān)的化合物的混合物。在該混合物中，稱為Spinosad的多殺菌素A和D是主要組分并具有針對關(guān)鍵昆蟲目標的活性。多殺菌素J和し，兩種在多殺菌素混合物中的次要組分，是こ基多殺菌素的如體，こ基多殺菌素是另ー種多殺菌素類殺蟲劑。Spinosad 是一種由 Dow AgroSciences (Indianapolis, Ind.)生產(chǎn)的殺蟲劑，該殺蟲劑主要含有約85%的多殺菌素A和約15%的多殺菌素D。多殺菌素A和D是由刺糖多孢菌發(fā)酵產(chǎn)生的天然產(chǎn)物，如美國專利No. 5，362，634中公開的。Spinosad是可從Dow AgroSciences商購獲得的數(shù)種殺蟲制劑中的活性成分，所述制劑包括TRACER 、SUCCESS 、SPINT0R 和CONSERVE 昆蟲防治產(chǎn)品。例如，TRACER產(chǎn)品包含約44%到約48%Spinosad(w/v),或姆加侖約4磅的Spinosad。已經(jīng)確定了顆粒和液體制劑中的多殺菌素化合物用于控制蜘蛛、線蟲和昆蟲，特別是鱗翅目(Lepidoptera)、纟嬰翅目(Thysanoptera)和雙翅目(Diptera)物種的用途。多殺菌素A和D在此也稱作多殺菌素A/D。こ基多殺菌素是5，6-ニ氫-3'-こ氧基多殺菌素J(主要成分)和3'-こ氧基多殺菌素L的混合物，由Dow AgroScience生產(chǎn)。該混合物可以通過こ氧基化多殺菌素J和多殺菌素L的混合物，再進行氫化來制備。多殺菌素J的5，6雙鍵及其3'-こ氧基比多殺菌素L和其3'-こ氧基衍生物更加易于氫化，原因是多殺菌素L及其3'-こ氧基衍生物中C-5上的甲基的空間位阻。參見，美國專利No. 6，001，981。多殺菌素J和L在此也稱作多殺菌素J/し此處使用常規(guī)表示法來描述多核苷酸序列單鏈多核苷酸序列的左手端是5'端；雙鏈多核苷酸序列的左手方向稱為5'方向。向新生RNA轉(zhuǎn)錄物從5'到3'添加核苷酸的方向稱為轉(zhuǎn)錄方向。與mRNA具有相同序列的DNA鏈稱為“編碼鏈”;在具有與轉(zhuǎn)錄自該DNA的mRNA相同序列的DNA鏈上且位于該RNA轉(zhuǎn)錄物5’端的5’的序列稱作“上游序列”；在具有與RNA相同序列的DNA鏈上且位于該編碼RNA轉(zhuǎn)錄物3’端的3’的序列稱作“下游序列”。在某些用于改善剌糖多孢菌菌株改良的實施方案中，通過將基因表達盒整合入刺糖多孢菌的基因組中來產(chǎn)生穩(wěn)定的多核苷酸轉(zhuǎn)化體。這通過使用染色體DNA的一部分和插入元件經(jīng)由同源重組整合基因來實現(xiàn)的?；谶@種重組并作為其應(yīng)用的結(jié)果，分別將aac (3) IV和vhb基因表達盒整合入了刺糖多孢菌染色體中遮蔽蛋白聚酮合成酶(PKS)基因座處，導(dǎo)致天然基因obsA的失活。本發(fā)明的其他實施方案可包括將多核苷酸整合入刺糖多孢菌基因組，而不負面影響多殺菌素產(chǎn)生、生長和其他期望的代謝特征。本發(fā)明的另外的實施方案可包括將包含基因表達盒的多核苷酸整合入刺糖多孢菌基因組，其表達導(dǎo)致増加的多殺菌素產(chǎn)生。本發(fā)明的實施方案也可以包括將多核苷酸整合入剌糖多孢菌基因組的中性位點，并且隨后在相同位置疊加第二多核苷酸。其中，利用剌糖多孢菌內(nèi)的中性位點作為引入額 外的多核苷酸的優(yōu)選基因座。本發(fā)明的其他實施方案可以包括將含有基因表達盒的多核苷酸整合入刺糖多孢菌基因組的中性位點，并且隨后從整合的多核苷酸中去除選擇性標志表達盒。其中，除了現(xiàn)有技術(shù)中已知的其他切除方法外，用于去除所述選擇性標志表達盒的方法是雙交換方法、使用CRE-LOX的切除方法、使用FLP-FRT的切除方法、或使用RED/ET RECOMBINATION 試劑盒(Genebridges, Heidelberg, Germany)的切除萬法。本發(fā)明另外的實施方案包括將多核苷酸整合入刺糖多孢菌基因組的中性位點，作為使用外來復(fù)制質(zhì)粒的替代物。其中，由于存在類似的來源或復(fù)制、不相容群、冗余的選擇性標志、或其他基因元件，ー個或多個外來復(fù)制質(zhì)粒是不相容的。其中，由于刺糖多孢菌限制修飾系統(tǒng)的特異性，ー個或多個外來復(fù)制質(zhì)粒在刺糖多孢菌中是不起作用的。其中，ー個或多個外來復(fù)制質(zhì)粒在刺糖多孢菌中不可用、不起作用的或不是能夠容易地轉(zhuǎn)化的。本發(fā)明的其他實施方案可以包括在原核細胞中増加同源重組效率的方法。依賴于引入的酶介導(dǎo)的同源重組的方法，如λ-red “重組工程化”和類似方法在有限數(shù)量的細菌種類中是有用的，尤其是埃希氏菌屬(Escherichia) (Datsenko和Wanner (2000)ProcNatl Acad Sci USA. 97 :6640-597 :6640-5)和沙門氏菌屬(Salmonella)。也可以使用依賴于引入的酶介導(dǎo)的位點特異性重組的方法，所述酶如噬菌體整合酶、FLP/FRT或Cre/IoxP,但依賴于祀DNA中事先存在的位點的存在(Wirth等，(2007) Current Opinions inBiotechnologyl8,411-419)。另一方法采用病毒或可動因子(mobile element),或它們的組分(例如噬菌體、轉(zhuǎn)座子或可動內(nèi)含子)。然而，依賴于宿主介導(dǎo)的同源重組的方法是目前最常使用的染色體DNA修飾類型。在宿主介導(dǎo)的同源重組的典型微生物應(yīng)用中，通過單交換整合將具有與染色體有序列同一性的單個區(qū)域的質(zhì)粒整合入染色體，有時稱作坎貝爾式整合(Campbell-likeintegration)。在這樣的事件后，在引入的質(zhì)粒上的基因作為染色體的一部分復(fù)制，這可以比質(zhì)粒復(fù)制更迅速。相應(yīng)地，在帶有針對質(zhì)粒攜帯的選擇性標志基因的選擇的培養(yǎng)基中生長可為整合提供選擇壓力。通過將目的基因的內(nèi)部片段置于質(zhì)粒上，坎貝爾式整合能夠用于失活染色體基因，從而在整合之后，染色體將不含該基因的全長拷貝?？藏悹柺秸象w細胞的染色體是不穩(wěn)定的，因為整合的質(zhì)粒側(cè)翼是引導(dǎo)該整合的同源序列。這些序列間的進一歩同源重組事件導(dǎo)致質(zhì)粒的切除，和染色體逆轉(zhuǎn)為野生型。因為這個原因，可能有必要保持對質(zhì)粒攜帯的選擇性標志基因的選擇以保持整合體克隆。
對染色體修飾的基本單交換整合方法的改進可以包括雙交換同源重組，也稱作等位基因交換，其涉及兩個重組事件。將期望的經(jīng)修飾的等位基因置于質(zhì)粒上，側(cè)翼是與染色體中靶等位基因側(cè)翼的區(qū)域具有同源性的區(qū)域(“同源臂”)。第一整合事件可以發(fā)生在任一一對同源臂中，導(dǎo)致質(zhì)粒以與坎貝爾式整合相同的方式整合入染色體。在第一交換事件之后，染色體含有能夠引導(dǎo)第二重組事件的兩組可供選擇的同源序列。如果與引導(dǎo)第一事件的相同的序列重組，那么質(zhì)粒會被切除，并且細胞會回復(fù)成野生型。如果第二重組事件由另ー同源臂引導(dǎo)，質(zhì)粒會被切除，但原有的染色體等位基因會替換為質(zhì)粒上引入的經(jīng)修飾的等位基因；會實現(xiàn)期望的染色體修飾。與坎貝爾式整合一祥，通常檢測第一重組事件，并且使用通過質(zhì)粒攜帯的選擇性標志基因的整合所賦予的選擇優(yōu)勢來分離整合體。本文使用的“功能多態(tài)性”指基因堿基對序列的變化，所述變化導(dǎo)致在該基因編碼的蛋白質(zhì)的活性上的質(zhì)變或量變(例如，活性的特異性的改變；活性水平的改變)。術(shù)語“功能多態(tài)性”包括突變、缺失和插入。一般來說，可以通過從來源收集合有DNA的生物學(xué)樣品，然后確定該生物學(xué)樣品中含有目的多態(tài)性的DNA存在或缺失來實施檢測目的多態(tài)性的步驟。 確定編碼特定突變的DNA的存在或缺失可以使用以合適的可檢測基團標記的寡核苷酸探針，和/或憑借擴增反應(yīng)如聚合酶鏈式反應(yīng)或連接酶鏈式反應(yīng)(其后可使用標記的寡核苷酸探針或多種其他技術(shù)來檢測這些擴增反應(yīng)的產(chǎn)物)來實施?？梢杂糜趯嵤┍景l(fā)明的大量不同的寡核苷酸探針測定形式是已知的。參見如Wahl等的美國專利No. 4，302，204 ；Falkow 等的美國專利 No. 4，358，535 ；Ranki 等的美國專利 No. 4，563，419 ；及 Stavrianopoulos 等的美國專利 No. 4, 994, 373。選定的或靶核酸序列的擴增可以通過任何適合的手段實施。大體上參見Kwoh等，Am. Biotechnol. Lab. 8,14-25 (1990)。合適的擴增技術(shù)的實例包括但不限于，聚合酶鏈式反應(yīng)、連接酶鏈式反應(yīng)、鏈置換擴增(大體上參見G. Walker等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA89,392-396(1992) ;G. Walker 等，Nucleic Acids Res. 20，1691-1696 (1992))、基于轉(zhuǎn)錄的擴增(參見 D. Kwoh 等，Proc. Natl. Acad Sci. USA 86，1173-1177 (1989))、自動維持序列復(fù)制(或“3SR”)(參見 J. Guatelli 等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA87,1874-1878 (1990))、Q β復(fù)制酶系統(tǒng)(參見P. Lizardi等，BioTechnology6,1197-1202 (1988))、基于核酸序列的擴增(或“NASBA”)(參見 R. Lewis, Genetic Engineering News 12 (9), I (1992))、修復(fù)鏈反應(yīng)(或"RCR")(參見 R. Lewis,同上)和回旋 DNA 擴增(或"BDA" ) (boomerang DNAamplification)(參見R. Lewis,同上)。通常優(yōu)選聚合酶鏈式反應(yīng)。聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR)可以依照已知技術(shù)實施。參見，例如，美國專利No. 4, 683, 195 ；4, 683, 202 ;4，800，159 和 4，965，188。一般來說，PCR 涉及，首先，在雜交條件下使用針對待檢測的特定序列各條鏈的一個寡核苷酸引物處理核酸樣品(例如，在熱穩(wěn)定DNA聚合酶的存在下)，以便合成各引物的延伸產(chǎn)物，該產(chǎn)物與各條核酸鏈互補，引物與引物所雜交的特定序列的各條鏈充分互補，從而從各引物合成延伸產(chǎn)物，當它與其互補物分開后，能夠充當模板用于其他引物的延伸產(chǎn)物的合成，然后如果帶檢測的ー個或多個序列存在，在變性條件下處理所述樣品以將引物延伸產(chǎn)物與它們的模板分開。循環(huán)重復(fù)這些步驟直到獲得期望的擴增程度。通過向反應(yīng)產(chǎn)物添加能夠與該反應(yīng)產(chǎn)物雜交的寡核苷酸探針(例如，本發(fā)明的寡核苷酸探針)來實施對擴增序列的檢測，該探針攜帶可檢測的標記，然后依照已知技術(shù)，或通過在凝膠上直接顯現(xiàn)來檢測該標志。這些探針的長度可以是從5到500個核苷酸，優(yōu)選5到250個，更優(yōu)選5到100或5到50個核酸。當PCR條件允許擴增所有的等位基因類型時，通過與等位基因特異性探針雜交、通過限制性內(nèi)切核酸酶消化、通過在變性梯度凝膠上電泳或其他技術(shù)能夠區(qū)分所述類型。連接酶鏈式反應(yīng)(LCR)也依照已知技術(shù)實施。參見例如R. Weiss，Science 254，1292 (1991)。一般來說，該反應(yīng)使用兩對寡核苷酸探針進行一對結(jié)合至待檢測序列的一條鏈上，另ー對結(jié)合至待檢測序列的另一條鏈上。每ー對在一起與其對應(yīng)的鏈完全重疊。如下實施該反應(yīng)，首先使待檢測序列的鏈變性(例如，分離)，然后在熱穩(wěn)定連接酶存在下使所述鏈與兩對寡核苷酸探針反應(yīng)，從而使每對寡核苷酸探針連接在一起，然后分離反應(yīng)產(chǎn)物，然后循環(huán)重復(fù)該過程直到序列已經(jīng)擴增到期望的程度。然后可以按照與如上所述的關(guān)于PCR的類似方式檢測。DNA擴增技術(shù)(例如前述的)可以涉及使用探針、ー對探針或兩對探針，其特異性結(jié)合至含有功能多態(tài)性的DNA，但不結(jié)合至不含該功能多態(tài)性的DNA。或者，探針或探針對能夠結(jié)合至含有和不含功能多態(tài)性的兩種DNA，但產(chǎn)生或擴增出其中可以確定可檢測差異·的產(chǎn)物(例如，延伸產(chǎn)物)(例如，較短的產(chǎn)物，在此功能多態(tài)性是缺失突變)。可以依照標準技術(shù)從與obsA連鎖的基因中的或與該基因有關(guān)的DNA的已知序列中或從能夠從這些基因生成的序列依照標準技術(shù)來生成這類探針。會理解的是本文描述的檢測步驟可以直接或間接實施。其他間接確定等位基因類型的手段包括測量與特定功能多態(tài)性連鎖的多態(tài)性標志，如已經(jīng)針對VNTR(可變數(shù)目串聯(lián)重復(fù))所示范的。分子生物學(xué)包含廣泛多祥的用于核酸和蛋白質(zhì)序列分析的技木。許多技術(shù)和程序形成了臨床診斷測定和檢驗的基礎(chǔ)。這些技術(shù)包括核酸雜交分析、限制酶分析、基因序列分析、以及核酸和蛋白質(zhì)的分離和純化(參見，例如，J. Sambrook, E. F. Fritsch,和T. Maniatis, Molecular Cloning A Laboratory Manual,弟ニ版，Cold spring HarborLaboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y. ,1989)。這些技術(shù)中的大部分涉及對大量樣品實施許多操作(例如，移液、離心和電泳)。它們常常是復(fù)雜且費時的，并且通常要求高度精確性。許多技術(shù)由于缺乏靈敏度、特異性和再現(xiàn)性而在應(yīng)用上受限。核酸雜交分析通常涉及在相對大量的復(fù)雜非靶核酸中，用過量的探針DNA檢測非常小量的特定靶核酸(DNA或RNA)。樣品中核酸的復(fù)雜性的降低有助于檢測低拷貝數(shù)(即10，000到100，000)的核酸靶物。通過擴增靶核酸序列來實現(xiàn)某種程度的DNA復(fù)雜性降低。(參見，M. A. Innis 等，PCR Protocols A Guide to Methods and Applications,Academic Press,1990 ;Spargo等，1996,Molecular & Cellular Probes,in regard to SDAamplification)。這是因為靶核酸的擴增導(dǎo)致相對于非靶序列而言巨大數(shù)量的靶核酸序列，由此改善后續(xù)的靶雜交步驟。雜交步驟涉及將制備好的DNA樣品與特異性報告探針在為了使靶DNA序列和探針之間發(fā)生雜交的設(shè)定的最適條件下接觸。雜交可能在許多形式中的任何一種中進行。例如，多祥品核酸雜交分析已經(jīng)在多種濾膜和固體支持物形式下進行(參見Beltz等，Methods in Enzymology, Vol. 100, Part 等編輯，Academic Press, New York, Chapterl9,pp. 266-308，1985)。一種所謂的“點印跡”雜交形式涉及將靶DNA非共價附接至濾膜，接著是與放射性同位素標記的探針的后續(xù)雜交。“點印跡”雜交在過去的二十年間得到了廣泛使用，在這段時間里發(fā)展出很多版本(參見Anderson和Young,于Nucleic AcidHybridization-A Practical Approach ；Hames 和 Higgins 編輯，IRL Press, Washington,
D.C. Chapter4, pp. 73-111，1985)。例如，點印跡方法已經(jīng)發(fā)展用于基因組突變的多重分析(Nanibhushan等的EPA0228075)以及用于重疊克隆的檢測和基因組圖譜的構(gòu)建(Evans的美國專利 No. 5，219，726)。用于實施多樣品核酸雜交分析的其他技術(shù)包括微量形式多路或矩陣設(shè)備(micro-formatted multiplex or matrix device)(例如，DNA 芯片)(參見 M. Barinaga，253 Science, pp. 1489，1991 ；ff. Bains, lOBio/Technology, pp. 757-758，1992)。這些方法通常將特定DNA序列附接至固體支持物的非常小的特定區(qū)域，例如DNA芯片的微孔。這些雜交形式是常規(guī)“點印跡”和“夾心”雜交系統(tǒng)的微量規(guī)模版本。該微量形式雜交可以用于實施“通過雜交進行的測序”(SBH)(參見M. Barinaga,253 Science, pp. 1489，1991 ；ff. Bains, 10 Bio/Technology, pp. 757-758，1992)。SBH 使用所有可能的n核苷酸寡聚體(η聚物(n-mer))來鑒定未知DNA樣品中的η聚物,其后通過算法分析排列這些η聚物以產(chǎn)生DNA序列(參見Drmanac美國專利No. 5，202, 230)。有兩種用于實施SBH的形式。第一種形式涉及在支持物上創(chuàng)建所有可能的η聚物的陣列，然后將其與靶序列雜交。第二種形式涉及將靶序列附接至支持物，將其用所有可能的η聚物按順序探查。Southern (英國專利申請GB8810400,1988 ；E. M. Southern等，13Genomics 1008,1992)提出使用第一種形式分析或測序DNA。Southern使用PCR擴增的基因組DNA鑒定了已知的單點突變。Southern還描述了一種在固體支持物上合成寡核苷酸 陣列以供SBH的方法。Drmanac等(260 Science 1649-1652，1993)使用了第二種形式來測序幾種短(116bp)DNA序列。將靶DNA附接至膜支持物上(“點印跡”形式)。將各濾膜與272種標記的10聚物和I聚物寡核苷酸按順序雜交。使用了較寬范圍的嚴格條件來實現(xiàn)每種η聚物探針的特異性雜交。使用從0°C至16°C的溫度，洗滌時間從5分鐘到過夜不等。大多數(shù)探針需要在16°C下的3小時洗滌。為了檢測雜交信號，必需將濾膜曝光2到18小時。一般來說，多種方法可用于雜交事件的檢測和分析。取決于用于標記DNA探針的報告基團(熒光團、酶、放射性同位素等)，通過熒光計量法、量熱法或通過放射自顯影來進行檢測和分析。通過觀察和測量發(fā)出的輻射，如熒光輻射或粒子發(fā)射，可以獲得有關(guān)雜交事件的信息。即使當檢測方法具有非常高的固有靈敏度時，由于背景存在非特異性結(jié)合的物質(zhì)，雜交事件的檢測是困難的。因此，雜交事件的檢測依賴于能夠使雜交具有何種特異性和靈敏度。關(guān)于遺傳分析，已經(jīng)開發(fā)了幾種試圖增加特異性和靈敏度的方法。遺傳分析的一種形式是以闡明單核酸多態(tài)性或(“SNP”)為中心的分析。使用SNP的有利因素是其在人類基因組內(nèi)的高豐度(尤其與短串聯(lián)重復(fù)(STR)相比)，其頻繁定位在基因的編碼區(qū)或調(diào)節(jié)區(qū)內(nèi)(這能夠影響蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)或表達水平)，以及其從一代傳遞到下一代時的穩(wěn)定性(Landegren 等，Genome Research,第 8 卷，第 769-776 頁，1998)。SNP定義為以兩種變型存在的基因組中的任意位置，并且最常見的變型在少于99%的時間出現(xiàn)。為了使用SNP作為普遍的遺傳標志，關(guān)鍵是能夠簡單、快速、準確和經(jīng)濟地對它們進行分型。目前有很多技術(shù)可用于測定SNP類型(關(guān)于綜述，參見Landegren等，Genome Research，第8卷，第769-776頁，(1998))，所有這些都需要靶擴增。它們包括直接測序(Carothers等，BioTechniques,第7卷，第494-499頁，1989),單鏈構(gòu)象多態(tài)性(Orita 等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA，第 86 卷，第 2766-2770 頁，1989)，等位基因特異性擴增(Newton 等，Nucleic Acids Research,第 17 卷，第 2503-2516 頁，(1989),限制性生消化(Day 和 Humphries, Analytical Biochemistry,第 222 卷，第 389-395 頁，1994)和雜交測定法。在其最基本的形式中，雜交測定法通過區(qū)別針對匹配和錯配靶物的短寡核苷酸報告物來發(fā)揮功能。對該基本方案已經(jīng)發(fā)展出了許多適應(yīng)性變化。這些包括連接鏈反應(yīng)(Wu和 Wallace,Gene,第 76 卷,第 245-254 頁，1989)和微測序(minisequencing) (Syvanen 等，Genomics，第8卷，第684-692頁，1990)。其他的增強包括使用Taq DNA聚合酶的5'-核酸酶活性(Holland 等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA,第 88 卷，第 7276-7280 頁，1991)、分子信標(Tyagi 和 Kramer, Nature Biotechnology,第 14 卷，303-308 頁，1996)、熱變性曲線(Howell 等，Nature Biotechnology,第 17 卷，第 87-88 頁，1999)和 DNA “芯片”(Wang 等，Science，第 280 卷，1077-1082 頁，1998)。
能夠用于區(qū)分SNP的另ー個現(xiàn)象是源自多靶特異性探針對單一靶的雜交的核酸相互作用能或喊基堆積能。(參見，R. Ornstein 等，"An O ptimized Potential Functionfor the Calculation of Nucleic Acid Interaction Energies" , Biopolymers,弟 17卷，第 2341-2360 頁，(1978) ;J. Norberg 和 L. Nilsson, Biophysical Journal,第 74 卷，第 394-402 頁，(1998);和 J. Pieters 等，Nucleic Acids Research,第 17 卷，第 12 期，第4551-4565頁(1989))。在本發(fā)明中，以獨特的形式利用堿基堆積現(xiàn)象，以提供高靈敏度的Tm微分(Tm differentials),允許直接檢測在核酸樣品中的SNP。已經(jīng)使用了其他方法來區(qū)分相關(guān)生物中的核酸序列或測序DNA。例如，Hogan等的美國專利No. 5，030，557公開了單鏈靶核酸的ニ級和三級結(jié)構(gòu)除了“探針”寡核苷酸之外還可能因結(jié)合“輔助(helper)”寡核苷酸而受到影響，導(dǎo)致在探針和靶核酸之間展現(xiàn)較高的Tm。然而，該應(yīng)用在其方法上限于僅將雜交能用于改變自退火RNA鏈的ニ級和三級結(jié)構(gòu)，如果其保持不變則會傾向于阻止探針雜交至靶。關(guān)于DNA 測序，例如，K. Khrapko 等，F(xiàn)ederation of European BiochemicalSocieties Letters,第256卷,第I, 2期,第118-122頁(1989),公開了連續(xù)堆積雜交導(dǎo)致的雙鏈體穩(wěn)定化。另外，J. Kieleczawa等，Science,第258卷,第1787-1791頁(1992)，公開了使用六聚體的連續(xù)串(contiguous strings)來引發(fā)DNA合成,其中所述連續(xù)串似乎將引發(fā)穩(wěn)定化。同樣地，L. Kotler 等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA,第 90 卷，第 4241-4245 頁，(1993)，公開了通過使用六聚體和五聚體寡核苷酸模塊，在DNA測序反應(yīng)引發(fā)中的序列特異性。此外，S. Parinov 等，Nucleic Acids Research,第 24 卷，no. 15,第 2998-3004 頁，(1996),公開了使用堿基堆積寡聚物用于與被動DNA測序微芯片(passive DNA sequencingmicrochips)聯(lián)合的 DNA 測序。而且,G. Yershov 等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA,第 93 卷，第4913-4918頁(1996),公開了堿基堆積能在被動微芯片(passive microchip)上的SBH中的應(yīng)用。在Yershov的實例中，將10聚物DNA探針錨定于微芯片表面，并連同另外短探針雜交至靶序列，這樣的組合似乎穩(wěn)定了探針的結(jié)合。以這種形式，能夠闡明核酸序列的短片段以供DNA測序。Yershov進ー步指出，在其系統(tǒng)中使用較短的探針(例如，5聚物)增加了錯配的去穩(wěn)定化效果。在DNA測序中使用這樣的短探針提供了沿著正在探查的序列辨別錯配存在的能力，而不是僅僅在探針/靶雜交復(fù)合物的一個指定位置的單一錯配。對于這樣的目的，使用較長的探針(例如，8聚物、10聚物和13聚物寡聚物)功能較差。在核酸分析中已經(jīng)使用了堿基堆積的方法的其他實例包括Lane等的美國專利No. 5，770，365，其中公開了使用具有單鏈環(huán)和雙鏈區(qū)的單分子捕獲探針捕獲核酸靶的方法，所述探針連同結(jié)合的靶發(fā)揮作用通過堆積能穩(wěn)定雙鏈體形成。依照常規(guī)方法，通過定點誘變可以方便地修飾核苷酸序列?；蛘?，可以通過化學(xué)合成制備核苷酸序列，包括但不限于通過使用寡核苷酸合成儀，其中基于所需多肽的氨基酸序列設(shè)計寡核苷酸，并且優(yōu)選選擇將要產(chǎn)生該重組多肽的宿主細胞中偏好的那些密碼子。通過克隆基因的誘變，并在產(chǎn)生多殺菌素的生物中用突變的基因取代其未突變的對應(yīng)物，也可以產(chǎn)生新型多殺菌素。誘變可以涉及，例如1)酮還原酶、脫水酶或烯酰還原酶(KR、DH或ER)結(jié)構(gòu)域的缺失或失活，使得這些功能中的一種或多種被阻斷，而菌株產(chǎn)生具有含雙鍵、輕基或麗基(其不存在于多殺菌素A的核中)的內(nèi)酷核的多殺菌素(參見 Donadio等，1993) ；2)替換AT結(jié)構(gòu)域,從而將不同的羧酸并入該內(nèi)酯核中(參見Ruan等，1997) ；3)向現(xiàn)有的PKS模塊添加KR、DH或ER結(jié)構(gòu)域，從而使得菌株產(chǎn)生具有含飽和鍵、羥基或雙鍵(其不存在于多殺菌素A的核中)的內(nèi)酯核的多殺菌素；或4)添加或去掉完整的PKS模塊，從而使環(huán)內(nèi)酯核具有更多或更少的碳原子數(shù)。通過用異源PKS加載物(loading)替代多殺菌素PKS加載結(jié)構(gòu)域來產(chǎn)生雜合PKS。參見，例如，美國專利7，626，010。進一步注意到通過修飾附接于多殺菌素內(nèi)酯骨架的糖多殺菌素可以包括鼠李糖和/或福樂糖胺(forosamine)部分的修飾或不同脫氧糖的附接。西班牙的Salas小組證明，通過用不同的糖分子取代現(xiàn)有的糖分子可以產(chǎn)生新的聚酮化合物。Rodriguez等，J. Mol. MicrobiolBiotechnol. 2000 Jul ；2(3) :271_6。遵循貫穿本申請的實例有助于舉例說明使用誘變來產(chǎn)生具有經(jīng)修飾的功能性的多殺菌素。來自多殺菌素基因簇區(qū)的DNA可以用作雜交探針來鑒定同源序列。因此，在此克隆的DNA可用于從刺糖多孢菌基因文庫定位其他的質(zhì)粒，所述質(zhì)粒與此處描述的區(qū)重疊，但還包含來自刺糖多孢菌基因組中鄰近區(qū)域的之前未克隆的DNA。另外，來自此處克隆的區(qū)的DNA可以用于鑒定其他生物中不同但類似的序列。雜交探針通常長至少約20個堿基并被標記以允許檢測。為了不同的目的，本發(fā)明中可以使用多種類型的誘變。它們包括但不限于，定點的、隨機點誘變、同源重組、DNA改組或其他遞歸誘變方法、嵌合構(gòu)建、使用含尿嘧啶的模板的誘變、寡核苷酸定向誘變、硫代磷酸酯修飾的DNA誘變、使用缺口雙鏈DNA的誘變等等，或其任意組合。其他合適的方法包括點錯配修復(fù)、使用修復(fù)缺陷型宿主菌株的誘變、限制性選擇和限制性純化、缺失誘變、通過全基因合成進行的誘變、雙鏈斷裂修復(fù)等等。誘變包括但不限于，涉及嵌合建構(gòu)體的，也包括在本發(fā)明中。在一個實施方案中，由天然存在的分子或改變的或突變的天然存在的分子的已知信息來指導(dǎo)誘變，所述信息包括但不限于序列、序列比較、物理性質(zhì)、晶體結(jié)構(gòu)等等。此處存在的文字和實例描述了這些程序。在下列出版物和其中引用的參考文件中存在額外的信息Ling 等,Approaches to DNA mutagenesis an overview,Anal Biochem. 254 (2) 10157-178 (1997) ；Dale 等，Oligonucleotide-directedrandom mutagenesis using the phosphorothioate method，Methods Mol. Biol. 57 369-374 (1996) ；Smith, In vitro mutagenesis，Ann. Rev. Genet. 19 :423-462 (1985)；Botstein & Shortle, Strategies and applications of in vitro mutagenesis，Science 229:1193-1201 (1985) ；Carter, Site-directed mutagenesis，Biochem. J. 237 1-7(1986) ;Kunkel， The efficiency of oligonucleotide directed mutagenesis，于 Nucleic Acids&Molecular Biology (Eckstein, F. and Lilley, D. M. J.編輯，Springer Verlag，Berlin) (1987) ;Kunkel，Rapid and efficient site-specificmutagenesis without phenotypic selection， Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82 488-492 (1985) ;Kunkel 等，Rapid and efficient site-specific mutagenesis withoutphenotypic selection，Methods in Enzymol. 154，367-382(1987) ;Bass 等，Mutant Trprepressors with new DNA-binding specificities， Science 242:240-245(1988)；Methods in Enzymol. 100 :468-500(1983) ；Methods in Enzymol. 154 :329-350(1987)；Zoller&Smith， Oligonucleotide-directed mutagenesis using M13_derived vectors an efficient and general procedure for the production of point mutationsin any DNA fragment, Nucleic Acids Res. 10 :6487-6500 (1982) ；Zoller&Smith,Oligonucleotide-directed mutagenesis of DNA fragments cloned into M13vectors， Methods in Enzymol. 100 :468-500 (1983) ；Zoller&Smith, Oligonucleotide-directedmutagenesis a simple method using two oligonucleotide primers and asingle-stranded DNA template，Methods in Enzymol. 154 :329-350(1987) ；Taylor等，The use of phosphorothioate-modified DNA in restriction enzyme reactionsto prepare nicked DNA, Nucl.Acids Res. 13 :8749-8764(1985) ；Taylor 等，Therapid generation of oiigonucIeotide-directed mutations at high frequencyusing phosphorothioate-modif ied DNA, Nucl.Acids Res. 13 :8765-8787 (1985)；Nakamaye&Eckstein, Inhibition of restriction endonuclease Nci I cleavageby phosphorothioate groups and its application to oligonucleotide-directedmutagenesis, Nucl. Acids Res. 14 :9679-9698(1986) ；Sayers 等，Y_T Exonucleases inphosphorothioate-based oligonucleotide-directed mutagenesis,Nucl. Acids Res. 16 791-802 (1988) ;Sayers等，Strand specific cleavage of phosphorothioate-containingDNA by reaction with restriction endonucleases in the presence of ethidiumbromide, (1988) Nucl. Acids Res. 16 :803-814 ；Kramer 等，The gapped duplex DNAapproach to oligonucleotide-directed mutation construction，Nucl. Acids Res. 12 9441-9456 (1984) ；Kramer&Fritz Oligonucleotide-directed construction ofmutations via gapped duplex DNA, Methods in Enzymol. 154 :350-367 (1987) ；Kramer等，Improved enzymatic in vitro reactions in the gapped duplex DNA approachto oligonucleotide—directed constrtuction of mutations，Nucl. Acids Res. 16 7207(1988) ；Fritz 等，Oligonucleotide-directed construction of mutations agapped duplex DNA procedure without enzymatic reactions in vitro, Nucl. AcidsRes. 16 :6987-6999(1988) ;Kramer 等，Point Mismatch Repair，Cell 38:879-887(1984)；Carter等 Improved oligonucleotide site-directed mutagennesis using M13 vectors,Nucl.Acids Res. 13 :4431-4443(1985) ；Carter, Improved oligonucleotide-directedmutagennesis using M13 vectors, Methods in Enzymol. 154 :382-403 (1987)；Eghtedarzadeh&Henikoff， Use of oligonucleotides to generate large deletions，Nucl.Acids Res. 14 :5115 (1986) ；Wells 等，Importance of hydrogen-bond formationin stabilizing the trarnsition state of subtilisin, Phil. Trans. R. Soc.Lond.A 317 :415-423 (1986) ；Nambiar 等，Total synthesis and cloning of a gennecoding for the ribonuclease S protein，Science 223:1299-1301 (1984) ；Sakamar和 Khorana， Total synthesis and expression of a gene for the a-subunnit ofbovine rod outer segment guanine nucleotide-binding protein (transducin)，Nucl.Acids Res. 14 :6361-6372(1988) ;Wells 等，Cassette mutagenesis :an efficientmethod for generation of multiple mutations at defined sites， Genne 34 315-323(1985) ;Grundstrom等，Oligonucleotide-directed mutagenesis by microscale! shot-gun ! gene synthesis, Nucl. Acids Res. 13 :3305-3316 (1985) ;Mandecki，Oligonucleotide-directed double-strand break repair in plasmids of Escherichiacoli a method for site-specific mutagenesis，Proc. Natl. Acad.Sci.USA,83 7177-7181 (1986) ；Arnold, Protein engineering for unusual environments, CurrentOpinion in Biotechnology4 :450-455 (1993) ；Sieber 等，Nature Biotechnology,19 456-460 (2001) · W. P. C. Stemmet，Nature 370，389-91 (1994)；和 I. A. Lorimer, I. Pastan，Nucleic Acids Res. 23，3067-8 (1995) 以上許多方法的其他細節(jié)可以在Methods inEnzymology第154卷找到，其還描述了對于解決各種誘變方法的問題有用的控制方法。術(shù)語“同源性”或“百分比同一性”在此處可互換使用。為了本發(fā)明的目的，此處定義為了確定兩個氨基酸序列或兩個核酸序列的百分比同一性，出于最佳比較的目的來比對序列(例如，為了與第二氨基酸或核酸序列的最佳比對，可以將缺口引入第一氨基酸或核酸序列的序列中)。然后比較在相應(yīng)氨基酸位置或核苷酸位置的氨基酸殘基或核苷酸。當?shù)谝恍蛄兄械奈恢糜膳c第二序列中相應(yīng)位置相同的氨基酸殘基或核苷酸占據(jù)時，那么這些分子在該位置是相同的。兩個序列間的百分比同一性是序列共享的相同位置的數(shù)目的函數(shù)(即，％同一性=相同位置數(shù)/位置總數(shù)(即，重疊位置X100)。優(yōu)選地，兩個序列的長度相同。本領(lǐng)域技術(shù)人員將會意識到可以使用幾個不同的計算機程序測定兩個序列之間的同源性。例如，使用數(shù)學(xué)算法可以完成兩個序列之間的序列比較和百分比同一性的測定。在優(yōu)選的實施方案中，使用 Needleman 和 Wunsch (J. Mol. Biol. (48) :444-453 (1970))算法測定兩個氨基酸序列間的百分比同一性，所述算法已經(jīng)納入GCG軟件包(可從因特網(wǎng)的accelrys網(wǎng)站獲得，更具體地，在http://www. accelrys. com)中的GAP程序中，使用Blossom62 矩陣或 PAM250 矩陣，和缺口加權(quán)(gap weight) 16、14、12、10、8、6 或 4，長度加權(quán)(length weight) 1、2、3、4、5或6。本領(lǐng)域技術(shù)人員會理解，所有這些不同的參數(shù)會產(chǎn)生稍微不同的結(jié)果，但是當使用不同的算法時，兩個序列的整體百分比同一性不會顯著變化。在又一個實施方案中，使用GCG軟件包(可從因特網(wǎng)上的accelrys網(wǎng)站獲得，更具體地，在http://www. accelrys. com)中的GAP程序確定兩個核苷酸序列間的百分比同一性，使用NWSgapdna. CMP矩陣以及缺口加權(quán)40、50、60、70或80，和長度加權(quán)1、2、3、4、5或6。在另ー個實施方案中，使用E. Meyers和W. Miller的算法(CABIOS，4 :11-17 (1989))確定兩個氨基酸或核苷酸序列間的百分比同一性，該算法已經(jīng)并入ALIGN程序(2. O版本)(可從因特網(wǎng)在vega網(wǎng)站獲得，更具體為ALIGN-IGH Montpellier,或更具體地，http://vega. lgh. cnrs. fr/bin/align-guess. cgi),使用 PAM120 加權(quán)殘基表，缺 ロ 長度罰分(gaplength penalty) 12 和缺ロ罰分(gap penalty) 4 本發(fā)明的核酸和蛋白質(zhì)序列可進ー步作為“查詢序列”使用，以針對公共數(shù)據(jù)庫進行檢索，例如，以鑒定其他家族成員或相關(guān)序列。使用Altschul等(1990) J. Mol. Biol. 215 403-10的BLASTN和BLASTX程序(2. O版本)進行這樣的檢索。BLAST核苷酸檢索可以使用BLASTN程序執(zhí)行,分值(score) = 100,字長(word length) = 12,以獲得與本發(fā)明的核酸分子同源的核苷酸序列。BLAST蛋白質(zhì)檢索可以使用BLASTX程序執(zhí)行，分值=50，字長=5，以獲得與本發(fā)明的蛋白質(zhì)分子同源的氨基酸序列。為了獲得用于比較目的的帶缺ロ比對(gapped alignments),缺ロ BLAST (Gapped BLAST)可以如 Altschul 等，(1997) NucleicAcids Res. 25(17) :3389-3402中所述使用。當使用BLAST和缺ロ BLAST程序時，可使用各程序(例如，BLASTX和BLASTN)的缺省參數(shù)(可從因特網(wǎng)在ncbi網(wǎng)站獲得，更具體地在 www. ncbi. nlm. nih. gov)。在本發(fā)明中使用的合適的表達載體包括原核和真核載體(例如，質(zhì)粒、噬菌?；蚴删w)，包括哺乳動物載體和植物載體。合適的原核載體包括質(zhì)粒，例如但不限于，通常用于在放線菌屬(Actinomyces)中的DNA操作的質(zhì)粒，(例如pSET152、p0J260、pIJ101、pJVl、pSG5、pHJL302、pSAM2、pKC1250)。Kieser 等("Practical Streptomyces Genetics",2000)公開了這些質(zhì)粒。其他合適的載體可以包括例如那些在大腸桿菌中能夠復(fù)制的質(zhì)粒(例如，pBR322、ColEl、pSC101、PACYC 184、itVX、pRSET、pBAD (Invitrogen，Carlsbad,Calif.)等等)。Sambrook 公開了這些質(zhì)粒(參見"Molecular Cloning A LaboratoryManual,"第二版，Sambrook,Fritsch,&Maniatis 編輯，Cold Spring Harbor Laboratory,(1989))，并且許多這類載體可通過商業(yè)方法獲得。芽孢桿菌屬(Bacillus)質(zhì)粒包括pC194、pC221、pT127 等等，并且由 Gryczan 公開(在The Molecular Biology of theBacilli、Academic Press, NY(1982),第 307-329 頁)。合適的鏈霉菌屬(Streptomyces)質(zhì)粒包括 plilOl (Kendall 等，J. Bacteriol. 169 :4177-4183,1987)，而鏈霉菌屬噬菌體包括但不限于如 WC31 (Chater 等，在 Sixth International Symposium on ActinomycetalesBiology,Akademiai Kaido,Budapest,Hungary (1986),第 45-54頁)。John等(Rev. Infect.Dis. 8 :693-704,1986)和 Izaki (Jpn. J. Bacteriol. 33 :729-742,1978)綜述了假單胞菌屬(Pseudomonas)質(zhì)粒。特定基因表達的抑制對于研究和開發(fā)更適合特定目的的遺傳工程化生物都是重要的手段。基因沉默可以通過引入轉(zhuǎn)基因?qū)崿F(xiàn)，所述轉(zhuǎn)基因?qū)?yīng)于目的基因處于相對于其啟動子的反義方向(參見，例如，Sheehy等，Proc. Nat' I Acad. Sci. USA 85:88058808(1988) ;Smith等，Nature 334:724 726 (1988))，或處于相對于其啟動子的有義方向(Napoli 等，Plant Cell 2:279 289(1990) ；van der Krol 等，Plant Cell 2:291299(1990);美國專利 No. 5，034，323 ;美國專利 No. 5，231,020 ;和美國專利 No. 5，283，184)，這兩種情況都導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因以及內(nèi)源基因的表達降低。已報導(dǎo)了轉(zhuǎn)錄后的基因沉默伴隨著反義RNA小片段(20至25個核苷酸)的積累，所述片段可從RNA模板合成，并且代表該過程的特異性和移動性(mobility)的決定因素(Hamilton & Baulcombe, Science286 :950952 (1999))。已經(jīng)清楚的是在一系列生物中，dsRNA(雙鏈RNA)的引入是導(dǎo)致基因沉默的重要要素(Fire等，Nature 391 :806811(1998) ；Timmons & Fire,Nature395 :854(1998) ；W099/32619 ；Kennerdell & Carthew,Cell 95 :1017 1026(1998) ;Ngo 等，Proc. Nat' I Acad. Sci. USA 95:14687 14692(1998)；Waterhouse 等，Proc. Nat ' I Acad. Sci. USA 95:13959 13964(1998) ；W099/53050 ；Cogoni&Macino, Nature399 166 169(1999) ;Lohmann 等，Dev. Biol. 214 :211 214(1999)；Sanchez-Alvarado & Newmark,Proc. Nat' I Acad. Sci. USA 96:5049 5054(1999))。在細菌中受抑制的基因不需要是內(nèi)源細菌基因，因為報告轉(zhuǎn)基因和病毒基因二者均受到引入的轉(zhuǎn)基因的轉(zhuǎn)錄后基因沉默(English 等,Plant Cell8 :179 188(1996) ;Waterhouse 等，同上)。然而，在以上所有情況中，在引入的轉(zhuǎn)基因和受到抑制的基因之間的一些序列相似性可能是優(yōu)選的。在以下的非限制性實施例中更詳細地解釋本發(fā)明。實施例
攜帶遮蔽蛋白PKS基因ObsA的粘粒克隆的鑒定使用來自刺糖多孢菌的obsA基因組基因座的806-bp探針(SEQ ID NO 1)完成了粘粒文庫的篩選。通過BioS&T (Montreal, Canada)使用Supercos I粘粒載體(Stratagene,La Jolla, CA)和根據(jù)Kieser等(2000)描述的基因組DNA分離方案制備的來自刺糖多孢菌菌株的基因組DNA，從刺糖多孢菌菌株構(gòu)建了粘粒文庫。使用obsA探針篩選文庫允許在嚴格條件下鑒定攜帶obsA的5 ^端的粘?？寺?。根據(jù)制造商的說明書使用DIG DNA標記試劑盒和DIG核酸檢測試劑盒(Roche，Basel,Switzerland)進行探針標記、雜交和檢測。具體地,將源自obsA的5 '端的806_bp PCR片段使用隨機引物DNA標記試劑盒(Roche)標記。在雜交烘箱中于58°C雜交過夜，之后在65°C使用含有O. IX SSC和O. I % SDS的洗滌緩沖液洗滌兩個濾膜兩次，共30分鐘。使用Roche的DIG核酸檢測試劑盒基于酶聯(lián)免疫測定法使用高特異性抗-DIG-AP抗體綴合物和有色底物NBT (硝基四氮唑藍)和BCIP (5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸鹽)來檢測雜交的探針。鑒定出了幾組具有強雜交信號的粘粒。選擇克隆中的四個，S卩1E3、2N14、3M23和4E16用于粘粒DNA分離和測序確認。使用obsA 正向引物(SEQ ID NO :25' -CAAGATCGTTGGGACCTGGCC-3')和 obsA 反向引物(SEQ ID NO 35/ -TCGACGTACTGGACCTCGGC-3')對粘?？寺∵M行PCR擴增，產(chǎn)生了大小等同于806-bp探針的單一 PCR片段。根據(jù)制造商說明書使用FAILSAFE PCR系統(tǒng)(Epicentre Biotechnologies, Madison, WI)完成 PCR 反應(yīng)。也對四個粘粒克隆攜帶的DNA插入物的兩個末端都進行了測序，從而將所述粘?？寺《ㄎ坏秸诒蔚鞍谆虼厣喜⒐浪闼稣沉？寺〉牟迦胛锎笮?圖I)。確定了粘粒克隆1E3的大小為42，900bp，并且在DNA插入物的中部含有obsA的5'端。確定了粘?？寺?N14的大小為40，153bp，并且不攜帶整個obsA編碼區(qū)。粘?？寺?M23和4E16中的插入物在一端含有obsA的5'端，并在另一端含有超出遮蔽蛋白基因族之外的DNA序列。沒有估算粘?？寺?M23和4E16的實際大小。選擇了粘?？寺?E3用于完成obsA的破壞，以確定聚酮合成酶基因功能消除對刺糖多孢菌特征和多殺菌素的產(chǎn)生的影響。
經(jīng)由PCR靶向來工程化obsA破壞粘粒克隆為了破壞遮蔽蛋白基因簇中的obsA，經(jīng)由PCR靶向?qū)①|(zhì)粒pIJ773(由John InnesCenter Plant Biosciences Limited, Norwich, England 提供；圖 2)的阿泊拉霉素抗性破壞表達盒(disruption cassette) (FRT_aac3 (IV)-oriT-FRT)整合到粘?？寺?1E3 中。根據(jù)Gust等(2002)將obsA破壞表達盒(FRT_aac3 (IV) -oriT-FRT)整合入粘?？寺?E3中，并做出以下修改。使用了從耶魯大學(xué)的The Coli Cenetic Stock Center (CGSC)獲得的包含入代(1重組酶表達質(zhì)粒？1(078的大腸桿菌BW25141/pKD78，該表達質(zhì)粒衍生自 pKD46 (Datsenko 和 Wanner，2000)。以下長 PCR 引物，0bsA5 ' FRT aac3 (SEQ ID NO:45' -GGCAATGCGCAGAGTTCGTAGTGCGGGAGCCATTTGATGTGTAGGCT GGAGCTGCTTC-3')和 ObsA內(nèi)部 oriT FRT SEQ ID NO :55 ' -GAAGAAGGCGGCGTCGAACTGGTCGACCTCGGTGAGGAAATTCCGGGGATCCGTCGACC-3')，用于使用 pIJ773(圖 2)作為模板擴增攜帶 FRT_aac3 (IV)-oriT-FRT的1322-bp片段。根據(jù)Gust等(2002)純化了 1，322bp的擴增片段并將其整合入粘粒1E3中。
·
所有十個從所述PCR靶向產(chǎn)生的重組大腸桿菌克隆對阿泊拉霉素都有抗性，并且都具有相同的BamHI限制性酶消化模式(這種消化模式與不含所述破壞表達盒的粘?？寺?E3不同)。經(jīng)由使用一對分別退火至obsA的起始密碼子上游的95bp DNA區(qū)和obsA起始密碼子下游的334bp DNA區(qū)的引物的擴增來進行對重組克隆的進ー步確認。所述引物為obsA 5'上游正向(SEQ ID NO 65/ -CGACCGGTGTGTCGATGTTAGGGT-3')和 obsA 內(nèi)部反向(SEQ ID NO 75/ -CTTCCAACGCTTCCCAGCCC-3')。根據(jù)制造商的說明書，使用 FAILSAFE PCR 系統(tǒng)(Epicentre Biotechnologies, Madison, WI)完成了 PCR 反應(yīng)。使用用來生成粘粒的Spinosad菌株的基因組DNA或來自粘?？寺?E3的DNA的擴增生成了預(yù)期的429bp片段。使用分離自十個重組粘?？寺≈械木艂€的粘粒DNA(克隆10由于冗余而未繼續(xù))的擴增生成了對應(yīng)于預(yù)期大小l，538bp的單一片段。預(yù)期的l，538bp的PCR片段是由于在obsA的5'端插入了 1，322bp的破壞表達盒(FRT-aac3 (IV)-oriT-FRT)，同時從obsA基因缺失了 213bp。所有的重組粘粒克隆都產(chǎn)生了 1，538bp的單ー PCR片段，并且沒有產(chǎn)生見于對照粘粒克隆1E3的429_bp片段，表明每個重組粘粒克隆都在obsA的5'端含有破壞表達盒(FRT-aac3 (IV)-oriT-FRT)。經(jīng)由將破壞表達盒(FRT_aac3 (IV)-oriT-FRT)整合入刺糖多孢菌破壞遮蔽蛋白基因簇內(nèi)的obsA使用接合方法將攜帶obsA破壞表達盒(FRT_aac3 (IV) -oriT-FRT)的重組粘粒克隆引入刺糖多孢菌菌株，從而從全部祀菌株取得轉(zhuǎn)化接合自(transconjugant)以供結(jié)論性分析obsA破壞對生長和多殺菌素的產(chǎn)生的影響。根據(jù)Matsushima等(1994)描述的方法,實施在攜帶重組粘粒1E3的供體菌株和受體刺糖多孢菌菌株NRRL18538之間的菌絲接合。產(chǎn)生了轉(zhuǎn)化接合子。幾乎所有的原代(primary)轉(zhuǎn)化接合子均確認了期望的阿泊拉霉素抗性表型，表明所述轉(zhuǎn)化接合子攜帶經(jīng)由同源重組整合入遮蔽蛋白聚酮合成酶基因簇的阿泊拉霉素抗性基因aac3(IV)。測試了幾個選出的轉(zhuǎn)化接合子中對應(yīng)于PCR擴增中的785bp大小的aac3(IV)片段的DNA片段的存在。不含破壞表達盒(FRT-aac3 (IV) -oriT-FRT)的陰性對照不產(chǎn)生PCR擴增子。
obsA破壞對刺糖多孢菌生長和多殺菌素產(chǎn)生的影響使用多殺菌素搖瓶方案來評估obsA破壞對多殺菌素的產(chǎn)生的影響。在Burns等(W02003070908)描述的條件下進行了轉(zhuǎn)化接合子的發(fā)酵。在Baltz等(美國專利No. 6，143，526)描述的條件下進行了對發(fā)酵液中多殺菌素因子存在性的分析。對于刺糖多孢菌分離株完成了所述轉(zhuǎn)化接合子相對于它們各自的親本菌株的直接比較。在搖瓶中評估了衍生自NRRL 18538的四個obsA敲除突變體。每個敲除突變體的平均滴度均高于親本菌株。然而，該差異基于統(tǒng)計分析并沒有顯示為顯著的(表I)。表I.衍生自NRRL 18538的obsA敲除突變體在第10天的多殺菌素產(chǎn)生
權(quán)利要求
1.一種用于將基因整合入刺糖多孢菌(Saccharopolyspora spinosa)菌種菌株的染色體DNA的方法，包括步驟 創(chuàng)建噬菌體文庫以鑒定基因組基因座； 從基因組基因座克隆兩個基因組DNA片段，其中將一個基因組片段克隆至多核苷酸的待整合基因的上游，并且將第二基因組片段克隆至所述多核苷酸的待整合基因的下游，并且所得的連接的DNA片段成為整合質(zhì)粒； 通過轉(zhuǎn)化方法將步驟(b)的質(zhì)粒引入刺糖多孢菌菌株； 獲得轉(zhuǎn)化接合子；并， 篩選存在所述多核苷酸的所述轉(zhuǎn)化接合子。
2.權(quán)利要求1的方法，其中所述多核甘酸含有基因表達盒。
3.權(quán)利要求2的基因表達盒，其中所述基因表達盒含有抗生素可選擇標志或多殺菌素增強基因表達盒。
4.刺糖多孢菌菌種的基因整合體，其中已經(jīng)通過根據(jù)如權(quán)利要求I限定的方法將基因整合入染色體DNA而添加、取代或缺失了基因，其中所述已經(jīng)取代的基因與天然刺糖多孢菌基因不同。
5.刺糖多孢菌菌種的基因整合體，其中已經(jīng)通過根據(jù)如權(quán)利要求I限定的方法將基因整合入染色體DNA而添加、取代或缺失了基因，其中所述已經(jīng)取代的基因與天然刺糖多孢菌基因相同。
6.用于產(chǎn)生選定基因的蛋白質(zhì)產(chǎn)物的方法，所述方法包括制備剌糖多孢菌菌株，在所述菌株中根據(jù)權(quán)利要求I的方法將特定拷貝數(shù)的所述選定基因整合入刺糖多孢菌的基因組，并且在合適的培養(yǎng)基中將所述細菌菌株培養(yǎng)足夠的時間以使所述選定的基因得到表達并且所述蛋白質(zhì)得到產(chǎn)生。
7.一種用于改善多殺菌素產(chǎn)生的方法，包括將遮蔽蛋白聚酮合成酶基因簇作為用于整合和表達目的靶基因的中性位點整合入刺糖多孢菌基因組。
8.權(quán)利要求7的方法，其中遮蔽蛋白聚酮合成酶基因簇的整合不負面影響多殺菌素產(chǎn)生、生長或其他期望的代謝特征。
9.權(quán)利要求7的遮蔽蛋白聚酮合成酶基因簇，其中遮蔽蛋白聚酮合成酶基因座用于整合多核苷酸，并且其中遮蔽蛋白PKS基因obsA是整合的位點。
10.一種用于改善刺糖多孢菌菌株的發(fā)酵過程的方法，包括 將遮蔽蛋白聚酮合成酶基因簇作為用于整合和表達目的靶基因的中性位點整合入刺糖多孢菌基因組。
11.一種制備刺糖多孢菌菌株的方法，其中將特定拷貝數(shù)的選定基因或選定DNA分子整合入刺糖多孢菌基因組，其中所述方法包括 將所述選定基因或所述選定DNA分子克隆至移動元件中，其中有至少一個標志基因定位在所述移動元件中； 將含有所述選定基因或所述選定DNA分子的所述移動元件整合入所述剌糖多孢菌菌株的染色體或附加體； 用功能基因補充所述移動元件； 表達所述功能移動元件基因；以獲得含有特定拷貝數(shù)的所述選定基因或選定DNA分子的菌株的方式在對于所述標記基因為選擇性的培養(yǎng)基上選擇所述菌株；并回收由此選擇的菌株。
12.權(quán)利要求11的方法，其中所述染色體包含于質(zhì)粒上并且通過轉(zhuǎn)化引入。
13.權(quán)利要求12的方法，其中所述質(zhì)粒包括用于整合多核苷酸的基因組基因座。
14.權(quán)利要求I或13的基因組基因座中，其中用于整合多核苷酸的基因組基因座是遮蔽蛋白聚酮合成酶基因座。
15.權(quán)利要求14的遮蔽蛋白聚酮合成酶基因座，其中所述遮蔽蛋白聚酮合成酶基因座用于多核苷酸的整合，并且其中所述遮蔽蛋白PKS基因obsA是整合位點。
16.權(quán)利要求I或10的方法，或權(quán)利要求13的基因組基因座，其中多核苷酸的整合不負面影響多殺菌素產(chǎn)生、生長、或其他期望的代謝特征。
17.權(quán)利要求14的遮蔽蛋白聚酮合成酶基因座，其中所述遮蔽蛋白聚酮合成酶基因座作為中性位點發(fā)揮作用用于含有基因表達盒的多核苷酸的整合。
全文摘要
本發(fā)明包括在刺糖多孢菌(Saccharopolyspora spinosa)基因組中鑒定和確認中性多核苷酸整合位點的方法。此外，本發(fā)明包括中性位點的用途和用于整合在后續(xù)世代中穩(wěn)定維持和表達的包含基因表達盒的多核苷酸的方法。本發(fā)明包括可被破壞而對多殺菌素產(chǎn)生、生長、或其他期望的代謝特征沒有負面影響的中性整合位點。
文檔編號C12P19/62GK102816783SQ20121028430
公開日2012年12月12日 申請日期2012年5月3日 優(yōu)先權(quán)日2011年5月3日
發(fā)明者韓蕾, N·芒西 申請人:陶氏益農(nóng)公司