專利名稱：一種刺糖多孢菌菌株、其用途及制備多殺霉素的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種刺糖多孢菌(Saccharopolyspora spinosa)菌株、其用途及制備多殺霉素的方法。
背景技術(shù)：
多殺霉素(Spinosad)是一種具有觸殺及攝食毒性的新型微生物源殺蟲劑，具有對害蟲廣譜高效、對人、非靶標(biāo)動物和環(huán)境極為安全、可生物降解的優(yōu)異特點。多殺霉素具有全新的作用機理，它并不作用于乙酰膽堿酯酶和Na+通道，不同于傳統(tǒng)的有機磷和擬除蟲菊酯類殺蟲劑。實驗證明它對昆蟲存在快速觸殺和攝食毒性。它的作用方式是通過刺激昆蟲的神經(jīng)系統(tǒng)，導(dǎo)致非功能性的肌收縮、衰竭，并伴隨顫抖和麻痹。這種作用結(jié)果和煙堿型乙酰膽堿受體被激活的結(jié)果是相一致的，顯而易見這一作用機制在已知的害蟲防治產(chǎn)品中是新穎和獨特的。多殺霉素同時也作用于Y-氨基丁酸受體，有可能這進一步促成了其殺蟲活性的提高，如此的作用模式可謂獨一無二。吡蟲啉和其他的煙堿性受體類的殺蟲劑與多殺霉素的作用位點是不相同的。阿維菌素盡管也是一個天然產(chǎn)物，且同為大環(huán)內(nèi)酯類，但其作用位點亦和多殺霉素不盡相同。迄今為止，尚未發(fā)現(xiàn)某類產(chǎn)品能以相同的作用方式影響昆蟲的神經(jīng)系統(tǒng)，而且尚無有關(guān)多殺霉素交叉抗性的報道。多殺霉素屬廣譜殺蟲劑，能有效地控制鱗翅目、雙翅目和纓翅目害蟲，可以很好地防治鞘翅目和直翅目中某些大量吞食葉片的害蟲種類。多殺霉素對鱗翅目幼蟲的活性大大地高于各種有機磷、氨基甲酸酯殺蟲劑，與擬除蟲菊酯相當(dāng)。多殺霉素具有高殺蟲活性的同時，對捕食性昆蟲還表現(xiàn)出較低毒性，對鱗翅目昆蟲而言，多殺霉素是已發(fā)現(xiàn)的殺蟲劑中選擇性最高的化合物之一。此外，多殺霉素對薊馬、虱、白蟻以及許多膜翅目害蟲也有較好的效果。根據(jù)中國農(nóng)藥毒性分級標(biāo)準(zhǔn)，多殺霉素屬低毒殺蟲劑。它對哺乳動物和鳥類相對低毒，對水生動物也只是輕微的中等毒性。因此，它是進行害蟲綜合治理的首選。然而，我國的多殺霉素發(fā)酵技術(shù)還不成熟，其根本原因在于菌種性能差，發(fā)酵液中多殺霉素的濃度只能達到2g/L，不具備工業(yè)應(yīng)用價值。因而，需要生產(chǎn)多殺霉素能力強的菌種。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個目的是提供可產(chǎn)多殺霉素的菌株。本發(fā)明的另一個目的是提供由上述菌株制備多殺霉素的方法。本發(fā)明所提供的菌株為刺糖多孢菌(Saccharopolyspora spinosa)Z68，其保藏編號為 CGMCC No. 3460。本發(fā)明還涉及由上述刺糖多孢菌菌株得到的突變株。本發(fā)明的另一方面還涉及上述刺糖多孢菌菌株或其突變株在生產(chǎn)多殺霉素中的用途。本發(fā)明還涉及制備多殺霉素的方法，包括以下步驟
(a)發(fā)酵本發(fā)明的刺糖多孢菌菌株、或其突變株，得到含有多殺霉素的發(fā)酵液；(b)從發(fā)酵液中分離多殺霉素。本發(fā)明的菌株產(chǎn)多殺霉素能力強，具備很好的工業(yè)應(yīng)用價值。


圖1為刺糖多孢菌種子培養(yǎng)成熟的顯微照片。圖2為發(fā)酵罐中本發(fā)明菌株的發(fā)酵曲線。圖3為實施例1搖瓶發(fā)酵發(fā)酵液的HPLC分析圖譜(保留時間3. 47分鐘的峰為多殺霉素A組份，保留時間4. 33分鐘的峰為多殺霉素B組份)。圖4為多殺霉素標(biāo)準(zhǔn)品的HPLC分析圖譜(A組份保留時間3. 53分鐘，D組份的保留時間為4. 42分鐘)。本發(fā)明菌株的保藏信息一種刺糖多孢菌菌株，拉丁學(xué)名Saccharopolyspora spinosa，保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCCJia 北京市朝陽區(qū)大屯路，中國科學(xué)院微生物研究所，郵編100101)，保藏日期2009年11月25日，保藏編號CGMCC No. 3460。
具體實施例方式本發(fā)明的一個目的是提供一種可產(chǎn)多殺霉素的菌株。本發(fā)明所提供的菌株為刺糖多孢菌(Saccharopolyspora spinosa)Z68，其保藏編號為CGMCC No. 3460(以下簡稱刺糖多孢菌3460)。優(yōu)選地，本發(fā)明的刺糖多孢菌3460的生產(chǎn)多殺霉素的能力達8g/L以上，9g/L以上，優(yōu)選10g/L以上，更優(yōu)選12g/L以上，例如8 15g/L，9 15g/L。本發(fā)明還涉及由上述刺糖多孢菌3460得到的突變株。優(yōu)選地，突變株產(chǎn)多殺霉素的能力達8g/L以上，9g/L以上，優(yōu)選10g/L以上，更優(yōu)選12g/L以上，例如8 15g/L，9 15g/L。本發(fā)明的另一方面還涉及刺糖多孢菌3460或其突變株在生產(chǎn)多殺霉素中的用途。本發(fā)明的另一個目的是提供由上述菌株制備多殺霉素的方法。本發(fā)明所提供的制備多殺霉素的方法，包括如下步驟發(fā)酵刺糖多孢菌3460，得到含有多殺霉素的發(fā)酵液。在一種優(yōu)選的實施方式中，本發(fā)明制備多殺霉素的方法包括以下步驟(a)發(fā)酵本發(fā)明的刺糖多孢菌3460、或其突變株，得到含有多殺霉素的發(fā)酵液；(b)從發(fā)酵液中分離多殺霉素。優(yōu)選地，本發(fā)明的方法包括以下步驟在發(fā)酵之前，進行種子培養(yǎng)，得到種子培養(yǎng)液。在一種優(yōu)選的實施方式中，分離多殺霉素通過以下進行(a)含有多殺霉素的發(fā)酵液與有機溶劑混合；(b)固液分離，得到多殺霉素提取液。這種將含有多殺霉素的發(fā)酵液與有機溶劑直接混合進行提取的方法，本文中簡稱為“液相提取法”。優(yōu)選有機溶劑為極性有機溶劑。有機溶劑的實例為甲醇、乙醇、丙醇、乙酸乙酯、乙酸丁酯、甲苯、二甲苯中的一種或至少兩種的混合物，優(yōu)選甲醇、乙醇、丙醇、丁醇、乙酸乙酯以及乙酸丁酯中的一種或至少兩種的混合物，更優(yōu)選甲醇、乙醇、丙醇、丁醇、乙酸乙酯，進一步優(yōu)選甲醇、乙醇、丙醇以及乙酸乙酯中的一種或至少兩種的混合物，最優(yōu)選甲醇和乙醇中的一種或其混合物。在另一種優(yōu)選的實施方式中，分離多殺霉素通過以下進行(a)發(fā)酵液固液分離，得到固體狀態(tài)的含多殺霉素的菌絲體(b)將菌絲體中的多殺霉素溶解到有機溶劑中，固液分離，得到的液體即為多殺霉素提取液。這種將固體狀態(tài)的含多殺霉素的菌絲體與有機溶劑混合進行提取的方法，本文中簡稱為“固相提取法”。步驟(b)中的有機溶劑可以為甲醇、乙醇、甲醇、丙醇、丁醇、乙酸乙酯、乙酸丁酯、 甲苯、二甲苯中的一種或至少兩種的混合物。優(yōu)選地，在將菌絲體中的多殺霉素溶解到有機溶劑中之前，對菌絲體進行干燥。優(yōu)選地，發(fā)酵的溫度為25 32°C，優(yōu)選沈 30°C，更優(yōu)選27 ，例如。優(yōu)選地，發(fā)酵的時間為3 20天，優(yōu)選5 15天，更優(yōu)選7 10天。優(yōu)選地，發(fā)酵在有氧發(fā)酵條件下，在培養(yǎng)基中進行。優(yōu)選地，培養(yǎng)基含有可同化的碳源、氮源和水溶性無機鹽。發(fā)酵中使用的發(fā)酵培養(yǎng)基可以是常規(guī)多種培養(yǎng)基中的任意一種。優(yōu)選地，碳源為可溶性淀粉、葡萄糖、麥芽糖、糊精、玉米粉、油酸甲酯以及油類 (如豆油)中的一種或多種。優(yōu)選地，氮源為棉子粉、豆餅粉、豆粕粉，玉米蛋白粉、玉米浸出物、酵母粉、酵母浸提物、魚粉以及各類肉浸提物中的一種或多種。優(yōu)選地，可加入培養(yǎng)基中的營養(yǎng)無機鹽是能夠產(chǎn)生下列離子中的一種或多種的水溶性無機鹽鋅離子、鈉離子、鎂離子、鈣離子、銨離子、氯離子、碳酸根離子、硫酸根離子、硝酸根離子等。優(yōu)選地，發(fā)酵為發(fā)酵罐發(fā)酵，通入發(fā)酵罐的空氣流量為發(fā)酵液體積與每分鐘通入發(fā)酵罐內(nèi)的折成標(biāo)準(zhǔn)狀態(tài)的空氣體積之比為0. 3 2. 0，優(yōu)選0. 5 2. 0，更優(yōu)選0. 5 1. 5， 最優(yōu)選0. 7 1. 5。在一種優(yōu)選的實施方式中，包括如下步驟將刺糖多孢菌(Saccharopolyspora spinosa)Z68CGMCC No. 3460或其突變株接種于種子培養(yǎng)基，進行種子培養(yǎng)，得到種子培養(yǎng)液，再將種子培養(yǎng)液接入發(fā)酵培養(yǎng)基中。種子培養(yǎng)液在發(fā)酵培養(yǎng)基中的接種量為30mL/L 150mL/L，優(yōu)選 50ml/L 150ml/L。優(yōu)選的種子培養(yǎng)基的組成為葡萄糖的終濃度為10g/L，糊精的終濃度為20g/L，豆粕粉的終濃度為3g/L，玉米漿的終濃度為6g/L，
硫酸鎂的終濃度為2g/L ；種子培養(yǎng)基的消前pH值為7. 2。優(yōu)選的發(fā)酵培養(yǎng)基組成和配比如下可溶性淀粉的終濃度為60g/L，葡萄糖的終濃度為10g/L，豆粕粉的終濃度為30g/L，玉米漿的終濃度為10g/L，豆油的終濃度為5g/L，碳酸鈣的終濃度為5g/L，發(fā)酵培養(yǎng)基的消前pH值為7. 0。在一種優(yōu)選的實施方式中，提取多殺霉素的方法為將含有多殺霉素的發(fā)酵液與極性有機溶劑(如甲醇)以適當(dāng)體積比攪拌混和，用本行業(yè)已知方法固液分離，得到的液體即為多殺霉素提取液。在一種優(yōu)選的實施方式中，采取下述方法從發(fā)酵液中提取多殺霉素使用本行業(yè)已知方法(例如過濾)將含有多殺霉素的發(fā)酵液固液分離，棄去液體，得到固體狀態(tài)的含多殺霉素菌絲體。將上述菌絲內(nèi)加入有機溶劑，將貯存于菌絲體中的多殺霉素溶解到有機溶劑中，使用本行業(yè)已知方法固液分離(例如過濾)，得到的液體即為多殺霉素提取液。實驗證明，本發(fā)明的菌株生產(chǎn)多殺霉素的能力強，可達每升發(fā)酵液中含多殺霉素 9-15克。用本發(fā)明菌株來發(fā)酵制備多殺霉素，能夠提高多殺霉素的生產(chǎn)效率，降低生產(chǎn)成本。實施例下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。菌株的分離及鑒定一、菌株的分離從中國南海采集海泥樣品。將冷凍保藏的海泥樣品梯度稀釋，每個稀釋度涂布2-3 塊雙碟培養(yǎng)基二8°C培養(yǎng)2-6周，培養(yǎng)時將雙碟放置在濕潤的紗布上面，保持一定的濕度， 防止雙碟干燥；之后，每2-3天用相差顯微鏡觀察一次雙碟生長情況，將長出的微生物菌落轉(zhuǎn)接至新雙碟(如發(fā)現(xiàn)微小菌落不再生長及時將菌落挑入液體10%海水LB培養(yǎng)基靜止培養(yǎng)2周左右時間，待液體內(nèi)長出菌絲后，該菌已經(jīng)復(fù)蘇再進行雙碟劃線)，劃線，進行形態(tài)觀察，菌純化后進行保藏入新菌種庫。從菌種庫中進行活性篩選，得到本發(fā)明具有活性的刺糖多孢菌菌株。與其它微生物相同，本發(fā)明的具有高產(chǎn)多殺霉素的菌株仍然易發(fā)生變異，因此，可以利用本領(lǐng)域已知的物理和化學(xué)方法得到這些菌株的突變株，例如，可以通過紫外線處理得到另一些菌株。二、菌株的鑒定通過PCR擴增該菌的16SrDNA，測序后發(fā)現(xiàn)，該菌與刺糖多孢菌的16S序列相同，鑒定為刺糖多孢菌。菌的形態(tài)刺糖多孢菌是好氧型革蘭氏陽性放線菌，在大多數(shù)培養(yǎng)基(如YMS、ATCC174、蘋果酸鈣等)上都能生長良好，形成氣生菌絲體。氣生菌絲為粉黃色，營養(yǎng)菌絲為黃色到黃褐色，產(chǎn)淺粉黃色孢子或白色孢子。孢子鏈外觀為珠狀，有孢子殼，孢子殼表面為針狀，這些針狀物約1mm，環(huán)繞在末端上。孢子形狀為橢圓形，平均大小約為1. IX 1.5 μ m。 孢子鏈長度超過50個孢子。菌體適宜的生長溫度為25°C 35°C，在高滲條件下(11% NaCl)可以生長。菌絲的形態(tài)如圖1所示。綜上鑒定結(jié)果，本發(fā)明菌株為刺糖多孢菌 (Saccharopolyspora spinosa),^ " ^^ Z68。該菌株已于2009年11月25日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCCJia 北京市朝陽區(qū)大屯路，中國科學(xué)院微生物研究所，郵編100101)， 保藏號為CGMCCNo. 3460，分類命名為刺糖多孢菌(Saccharopolyspora spinosa)。菌株的應(yīng)用一、發(fā)酵菌株制備多殺霉素玉米淀粉購自河北趙縣興柏藥業(yè)集團；酵母膏購自上海棱光酵母制品有限公司； 玉米漿購自河北康欣制藥有限公司；可溶性淀粉購自北京現(xiàn)代東方精細化學(xué)品有限公司； 豆粕粉購自北京康明威培養(yǎng)基技術(shù)有限公司；豆油購自廣東金龍魚食用豆油。( 一 )活化菌種甘油管(3-5支)保藏于-80°C冰箱中，取用其中1支室溫緩慢融化，待完全融化后，以無菌移液管涂布均勻斜面培養(yǎng)基中。置于，濕度為56%的培養(yǎng)間，避光靜止培養(yǎng)10天。斜面培養(yǎng)基的組成玉米淀粉的終濃度為25g/L，玉米漿的終濃度為20g/L，酵母膏的終濃度為lg/L，瓊脂粉的終濃度為18g/L ；斜面培養(yǎng)基的消前pH值為7. 0。( 二 )分離待斜面成熟后進行分離。以無菌鐵鏟刮取面積約1. Ocm2的菌絲與孢子混合體，置于5mL無菌水的玻璃試管中，試管中盛有玻璃珠10粒左右，塞好膠塞，振搖5min ；利用事先準(zhǔn)備好的過濾器對懸浮液進行過濾，除去其中菌絲體及剩余培養(yǎng)基；將過濾后孢子懸浮液進行梯度稀釋，稀釋梯度依次為IO-1UO-2UO-3UO-4UO-5,將每個稀釋梯度懸浮液取IOOyL 加入雙碟，用無菌三角刮刀涂布固體雙碟3塊。置于^°C，濕度為56%的培養(yǎng)間中靜止、避光培養(yǎng)8天。固體雙碟的培養(yǎng)基組成與斜面培養(yǎng)基的組成相同。(三)挑菌待分離雙碟生長成熟后，選取合適密度的雙碟(30個左右菌落/雙碟)進行菌種的挑選。利用接種環(huán)刮取孢子均勻涂布于準(zhǔn)備好的斜面培養(yǎng)基中。將涂布好的斜面置于觀°C，濕度為56 %的培養(yǎng)間中靜止、避光培養(yǎng)8天。(四)保存培養(yǎng)成熟的斜面置于-4°C冰箱中保存?zhèn)溆谩?br> (五)傳代舊斜面菌種保存時間不宜過長，應(yīng)及時轉(zhuǎn)接新斜面，轉(zhuǎn)接時同樣以無菌接種環(huán)刮取菌落表面孢子，涂布于新鮮斜面培養(yǎng)基中，以同樣方法培養(yǎng)、保藏。(六)種子培養(yǎng)液的制備在250mL容積的三角瓶中，裝40mL種子培養(yǎng)基，用2層紗布中間夾8g精梳棉作瓶塞，每瓶接已活化好的菌苔(含孢子、氣生菌絲和基生菌絲)約Icm2，然后放置于恒溫 (28°C)恒濕(56%)培養(yǎng)間中，以220rpm的轉(zhuǎn)速進行培養(yǎng)，培養(yǎng)3天即成熟，得到種子培養(yǎng)液。種子培養(yǎng)基的組成葡萄糖的終濃度為10g/L，糊精的終濃度為20g/L，豆粕粉的終濃度為3g/L，玉米漿的終濃度為6g/L，硫酸鎂的終濃度為2g/L ；種子培養(yǎng)基的消前pH值為7. 2。實施例1(1)搖瓶發(fā)酵向250mL容積的三角瓶中，裝40mL發(fā)酵培養(yǎng)基，滅菌后備用。向瓶中接入4毫升種子培養(yǎng)液，進行搖床發(fā)酵培養(yǎng)，溫度為，搖床轉(zhuǎn)速為220rpm，培養(yǎng)8天，發(fā)酵環(huán)境的相對濕度56 %，得到約35mL發(fā)酵液。發(fā)酵培養(yǎng)基的組成可溶性淀粉的終濃度為60g/L，葡萄糖的終濃度為10g/L，豆粕粉的終濃度為30g/L，玉米漿的終濃度為10g/L，豆油的終濃度為5g/L，碳酸鈣的終濃度為5g/L，發(fā)酵培養(yǎng)基的消前pH值為7.0。制作刺糖多胞菌生長曲線。刺糖多胞菌的生長曲線如圖2所示。圖2中，橫坐標(biāo)為發(fā)酵時間(小時)，縱坐標(biāo)為多殺霉素的濃度(yg/mL)曲線表明該菌種可以穩(wěn)定地生產(chǎn)多殺霉素長達270小時，最終發(fā)酵產(chǎn)量可以達到15000 μ g/mL以上。(2)提取多殺霉素液相提取法將發(fā)酵液與甲醇以體積比1 9混和振搖6小時；靜置20分鐘后，取上清溶液；用0. 4 μ m孔徑的微孔濾膜過濾，獲得發(fā)酵液甲醇提取液，待測。(3)產(chǎn)量檢測按照“二、發(fā)酵液中多殺霉素的檢測與分析”的方法進行檢測。發(fā)酵濾液的高效液相色譜圖如圖3所示(樣品被甲醇稀釋至10倍，保留時間3. 47 分鐘的峰為多殺霉素A組份，保留時間4. 33分鐘的峰為多殺霉素B組份)，發(fā)酵濾液中多殺霉素的A組份保留時間為3. 47分鐘；發(fā)酵濾液中多殺霉素的峰面積為2260。
樣品測定液中多殺霉素的濃度為0.909g/L，換算得到平均每升發(fā)酵液中含有 9. 09克多殺霉素。實施例2(1)發(fā)酵采用上海國強FUS-50L全自動發(fā)酵罐系統(tǒng)進行發(fā)酵，培養(yǎng)基配比與實施例1相同， 控制工藝如下表1
控制參數(shù)控制點裝量35L溫度28"C ±0. 5"C轉(zhuǎn)速起始400rpm，根據(jù)溶氧調(diào)解通氣比1 1罐壓0. 05MPa溶氧全程> 40%周期10天(2)提取多殺霉素固相提取法采取下述方法從發(fā)酵液中提取多殺霉素(固相提取法)取發(fā)酵液 ImL進行固液分離，棄去液體，得到固體狀態(tài)的含多殺霉素菌絲體，將上述菌絲體干燥后，得到菌絲0. 4克，加入5mL甲醇振搖6小時；靜置20分鐘后，取上清溶液；用0. 4 μ m孔徑的微孔濾膜過濾，獲得發(fā)酵液甲醇提取液，待測。(3)產(chǎn)量檢測產(chǎn)量檢測方法與實施例1相同。發(fā)酵濾液中多殺霉素的A組份保留時間為3. 51分鐘。樣品測定液中多殺霉素的濃度為2. 5g/L，換算得到平均每升發(fā)酵液中含有12. 5 克多殺霉素。實施例3(1)發(fā)酵使用上海國強FUS-50L全自動發(fā)酵罐進行發(fā)酵，培養(yǎng)基配比除將實施例1培養(yǎng)基中的可溶性淀粉更改為玉米淀粉外，其它與實施例1相同，控制工藝與實施例2相同。(2)提取采用液相提取法，與實施例1相同。(3)產(chǎn)量檢測發(fā)酵濾液中多殺霉素的A組份保留時間為3. 61分鐘；發(fā)酵濾液中多殺霉素的峰面積為2908。樣品測定液中多殺霉素的濃度為1. 17g/L，換算得到平均每升發(fā)酵液中含有 11. 7克多殺霉素。比較例1采用公司現(xiàn)有的國內(nèi)通用低產(chǎn)菌株L318進行搖瓶發(fā)酵，發(fā)酵條件和提取條件與實施例1相同。經(jīng)檢測其發(fā)酵產(chǎn)量為1. 85g/L。比較例2采用公司現(xiàn)有的國內(nèi)通用低產(chǎn)菌株L318進行，發(fā)酵條件和提取條件與實施例2相同。經(jīng)檢測器發(fā)酵產(chǎn)量為2. 2g/L。比較例3采用公司現(xiàn)有的國內(nèi)通用低產(chǎn)菌株L318，發(fā)酵條件和提取條件與實施例3相同。 經(jīng)檢測其發(fā)酵產(chǎn)量為1. 75g/L。二、發(fā)酵液中多殺霉素的檢測與分析多殺霉素HPLC檢測1.取上述發(fā)酵液甲醇提取液，進行色譜檢測。2.色譜條件如下儀器為LC-9101型循環(huán)制備液相色譜儀；色譜柱為YMC 0DS-A4. 6X150(日本YMC公司)，柱長150_，孔徑4. 6_，填充介質(zhì)為0DS-3，孔徑5 μ m ；柱溫25 0C ；自動進樣器進樣，進樣量2 μ L ；洗脫液(流動相)的組成由A液、B液和C液組成，A液Β液C液= 45 25 30(體積比)；A液為甲醇，B液為已腈，C液為0. (體積百分含量)三氟乙酸(TFA)的水溶液。流動相流速為lmL/min。檢測器為紫外檢測器，檢測激發(fā)波長M6nm。多殺霉素標(biāo)準(zhǔn)品為 Spinosad mixture of Spinosyn A und D PES,購自 Sigma-Aldrich，產(chǎn)品目錄號為 33706-50MG。3.結(jié)果在如上色譜條件下，多殺霉素標(biāo)準(zhǔn)品的色譜圖如圖4所示。多殺霉素標(biāo)準(zhǔn)品中A 組份保留時間3. 53分鐘，D組份的保留時間為4. 42分鐘，含600 μ g/mL多殺霉素的標(biāo)準(zhǔn)品的A組份峰面積為1491。表2實施例1發(fā)酵液的HPLC數(shù)據(jù)
權(quán)利要求
1.一種刺糖多孢菌(Saccharopolyspora spinosa)菌株，保藏編號為 CGMCC No. 3460。
2.由根據(jù)權(quán)利要求1所述的刺糖多孢菌菌株得到的突變株。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的突變株，其中，所述突變株產(chǎn)多殺霉素的能力達每升發(fā)酵液 8g/L以上，9g/L以上，優(yōu)選10g/L以上，更優(yōu)選12g/L以上，例如8 15g/L，9 15g/L。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的刺糖多孢菌菌株、或根據(jù)權(quán)利要求2至3任一項所述的突變株在生產(chǎn)多殺霉素中的用途。
5.制備多殺霉素的方法，包括以下步驟(a)發(fā)酵根據(jù)權(quán)利要求1所述的刺糖多孢菌菌株、或根據(jù)權(quán)利要求2至3任一項所述的突變株，得到含有多殺霉素的發(fā)酵液；(b)從所述發(fā)酵液中分離多殺霉素。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其中，所述發(fā)酵在有氧發(fā)酵條件下，在培養(yǎng)基中進行。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其中，所述培養(yǎng)基含有可同化的碳源、氮源和水溶性無機鹽。
8.根據(jù)權(quán)利要求5至7任一項所述的方法，其中，所述方法進一步包括以下步驟在所述發(fā)酵之前，進行種子培養(yǎng)，得到種子培養(yǎng)液。
9.根據(jù)權(quán)利要求5至8任一項所述的方法，其中，分離多殺霉素通過萃取法進行。
10.根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法，其中，分離多殺霉素通過以下方法1或方法2進行方法1 (a)所述含有多殺霉素的發(fā)酵液與極性有機溶劑混合；(b)固液分離，得到多殺霉素提取液；方法2:(a)發(fā)酵液固液分離，得到固體狀態(tài)的含多殺霉素的菌絲體；(b)將所述菌絲體中的多殺霉素溶解到有機溶劑中，固液分離，得到多殺霉素提取液。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法，其中，所述極性有機溶劑和/或所述有機溶劑為乙醇、甲醇、丁醇、丙醇、乙酸乙酯、乙酸丁酯、甲苯、和二甲苯中的一種或至少兩種的混合物， 優(yōu)選甲醇、乙醇、丙醇、丁醇、乙酸乙酯以及乙酸丁酯中的一種或至少兩種的混合物，更優(yōu)選甲醇、乙醇、丙醇、丁醇、乙酸乙酯，進一步優(yōu)選甲醇、乙醇、丙醇以及乙酸乙酯中的一種或至少兩種的混合物，最優(yōu)選甲醇和乙醇中的一種或其混合物。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種刺糖多孢菌菌株(Saccharopolyspora spinosa)、其用途及制備多殺霉素的方法。本發(fā)明所涉及的菌株保藏編號為CGMCC No.3460。本發(fā)明還涉及由上述菌株得到的突變株。本發(fā)明還涉及制備多殺霉素的方法，包括以下步驟a)發(fā)酵本發(fā)明的刺糖多孢菌菌株或其突變株，得到含有多殺霉素的發(fā)酵液；b)從發(fā)酵液中分離多殺霉素。本發(fā)明的菌株產(chǎn)多殺霉素能力強，具備很好的工業(yè)應(yīng)用價值。
文檔編號C07H1/06GK102337219SQ20111018724
公開日2012年2月1日 申請日期2011年7月5日 優(yōu)先權(quán)日2010年7月19日
發(fā)明者蔣勤軍 申請人:牡丹江佰佳信生物科技有限公司