專利名稱：特異識別沙門氏菌的寡核苷酸適配子的用途的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬于生物學、食品與衛(wèi)生檢測技術領域，具體涉及特異識別沙門氏菌(血清型08，以下簡稱沙門氏菌08)的寡核苷酸適配子的用途。
背景技術：
目前，國內外在食品中沙門氏菌檢測時常用的檢測方法因其檢測手段、識別對象各有不同而各具優(yōu)缺點。傳統(tǒng)檢測沙門氏菌的方法需要先分離再培養(yǎng)，然后用經典的方法鑒定，耗時、不靈敏是這些方法普遍存在的問題。免疫學方法簡單、方便、迅速、特異性較好，但是仍有交叉反應比較嚴重、假陽性多、靈敏度偏低等不足之處。聚合酶鏈式反應(PCR)技術雖具有準確、靈敏、快速的特點，但其在檢測數目較多的樣品時操作比較繁雜，因此在聚合酶鏈式反應(PCR)技術的基礎上又衍生出很多新型聚合酶鏈式反應(PCR)技術，如多重 PCR技術，然而多重PCR雖簡化了 PCR實驗的操作，但是由于該技術需數對引物同時進行擴增，很容易產生非特異性條帶或假陽性，影響檢測結果。通過指數富集配體的系統(tǒng)進化(Systematic evolution of ligands byexponential enrichment, SELEX)技術篩選獲得的寡核苷酸序列稱為適配子(aptamer)。其原理就是利用分子生物學技術，構建人工合成的單鏈隨機寡核苷酸文庫，其隨機序列長度在20-100個堿基左右，將隨機寡核苷酸文庫與靶分子相互作用，保留結合的寡核苷酸配基，經反復擴增、篩選數個循環(huán)，即可使與該靶子特異結合的寡核苷酸序列得到富集，最終獲得靶分子的特異寡核苷酸配基。該技術具有庫容量大、靶分子范圍廣、親和力高、特異性強等優(yōu)點。在臨床檢測方面，特別是對ー些未知的致病性細菌或病毒的研究，雖然不知道其內部結構、功能以及這些物質的表位，但將其作為靶物質，通過SELEX技術篩選到其相應的適配子，以檢測靶物質，已成為該領域的研究熱點。利用SELEX技術篩選獲得的適配子識別分子的模式與蛋白抗體類似，但與蛋白類抗體相比，核酸類配基具有更多的優(yōu)越性，如不受免疫條件和免疫源性限制，可體外人工合成，變性與復性可逆，可修飾并有利于長期保存和室溫運輸等。更重要的是，適配子的靶分子更為廣泛，包括金屬離子、有機染料、氨基酸、細胞因子、輔因子、氨基糖苷、抗生素、堿基類似物、核苷酸和多肽等。其中蛋白質類靶分子最多，包括酶、生長因子、抗體、轉錄因子、細胞粘附分子和選擇素等。完整的病毒顆粒和細菌病原體，甚至完整的細胞也可以通過復合靶子SELEX技術或消減SELEX技術篩選出高親和カ的寡核苷酸配基。適配子比抗體具有更高的特異性和精確識別能力，甚至能識別單抗不能區(qū)分的蛋白質分子。這些特性使得適配子在生物醫(yī)藥和食品衛(wèi)生研究領域得到廣泛應用，成為不可缺少的有力工具。

發(fā)明內容
為了解決現有沙門氏菌檢測中存在的檢測周期長、靈敏度低、假陽性多等問題，本發(fā)明提供一種特異識別沙門氏菌的寡核苷酸適配子的應用。特異識別沙門氏菌的寡核苷酸適配子的核苷酸序列如下5’ -GATCCGGGCCTCATGTCGAACACCCCCCAACTAAAACAACAAAACACCACCGCCATTGAGCGTTTATTCTGAGCTCCCA-3’，特異識別沙門氏菌的寡核苷酸適配子是一條78個堿基長的單鏈DNA。本發(fā)明通過SELEX技術的篩選過程，獲得高親和性特異識別沙門氏菌的寡核苷酸適配子，用于快速、準確檢測沙門氏菌08。本發(fā)明以倉源性沙門氏菌08為目的靶分子，同時以大腸桿菌086:K61和豬霍亂沙門氏菌為反篩菌，獲得了一條沙門氏菌08特異的適配子。本方法具有檢測時間短、研發(fā)周期短、質量穩(wěn)定、操作簡單等優(yōu)點，在食品與衛(wèi)生安全檢測中得到廣泛應用。


圖I為單鏈寡核苷酸(ssDNA)富集庫與沙門氏菌08結合率的測定結果圖。圖2 A為寡核苷酸適配子10號與沙門氏菌08靈敏度測定結果圖。圖2 B為寡核苷酸適配子9號與沙門氏菌08靈敏度測定 結果圖。圖3A為熒光顯微鏡觀察熒光基團標記寡核苷酸適配子10號與大腸桿菌結合比較圖。圖3B為熒光顯微鏡觀察熒光基團標記寡核苷酸適配子10號與豬霍亂沙門氏菌結合比較圖。圖3C為突光顯微鏡觀察突光基團標記寡核苷酸適配子10號與沙門氏菌08結合比較圖。圖3D為熒光顯微鏡觀察熒光基團標記寡核苷酸適配子10號與雙蒸水結合洗脫后空白對照圖。
具體實施例方式特異識別沙門氏菌的寡核苷酸適配子的核苷酸序列如下5’-GATCCGGGCCTCATGTCGAACACCCCCCAACTAAAACAACAAAACACCACCGCCATTGAGCGTTTATTCTGAGCTCCCA-3’ ；特異識別沙門氏菌的寡核苷酸適配子是一條78個堿基長的單鏈DNA。本發(fā)明通過SELEX技術的篩選過程，獲得高親和性特異識別沙門氏菌的寡核苷酸適配子，用于快速、準確檢測沙門氏菌08。下面通過SELEX篩選獲得沙門氏菌08特異的寡核苷酸適配子，并對其中親和カ最高的一條寡核苷酸適配子對沙門氏菌08識別和鑒定作進ー步說明。I.隨機單鏈DNA文庫和引物由上海生物工程有限公司合成 隨機單鏈 DNA 文庫5’ -GGGAGCTCAGAATAAACGCTCAA-
35nt-TTCGACATGAGGCCCGGATC-3’ (注nt 代表 A、T、C、G 堿基中任意ー種)
引物 I : 5 ’ - GGGAGCTCAGAATAAACGCTCAA-3’
引物 II : 5 ’ -GATCCGGGCCTCATGTCGAA-3，
引物III : 5’-地高辛- GGGAGCTCAGAATAAACGCTCAA-3’
引物IV :5’ -生物素-GATCCGGGCCTCATGTCGAA-3’。2.沙門氏菌08 {Salmonella嫩)的制備
沙門氏菌08 {Salmonella 08’購自中國エ業(yè)微生物菌種保藏管理中心CICC)接種于營養(yǎng)瓊脂平板37°C培養(yǎng)15 18小時，刮取菌苔于O. 9%無菌生理鹽水試管，6000 rpm 4°C離心10 min，洗滌菌體3次，棄上清，重懸于O. 9%無菌生理鹽水，用比濁儀調濁度為O. 5，約相當于I. 5X 108/ml沙門氏菌08菌懸液。3. SELEX篩選獲得沙門氏菌08特異的寡核苷酸適配子
I)SELEX篩選過程
a.首輪篩選，取合成的隨機單鏈DNA1/3 OD (I(^g)加入到400ul IX結合緩沖液，95度變性5min，然后迅速置于冰上IOmin ； b.加入ImL菌懸液I.5X IO8 ,于37° C搖床100 rpm結合I小時(以后可減少結合時間)，使單鏈DNA文庫與菌充分作用；
c.更換離心管，以去除與管壁結合的單鏈DNA,室溫下離心10000 rpm離心 IOmin分離未與菌結合的單鏈DNA文庫；
d.棄上清,加入600μ IX沖洗緩沖液,離心10 000 rpm離心IOmin,重復此過程4次，目的是洗去未與菌結合的核酸片段；
e.接上步離心后去上清，加入IOOPL去離子水99°C加熱3min，高速離心18 000rpm離心15min棄沉淀，換管留上清(核酸片段存于上清中)，-20° C保存?zhèn)溆谩?) PCR富集與沙門氏菌08特異結合的寡核苷酸適配子
每輪篩選后獲得的與沙門氏菌08特異結合的寡核苷酸適配子文庫通過PCR擴增得到富集；
a.以上述上清為模板，通過引物I和引物IV擴增產生一端帶生物素標記的雙鏈DNA；
b.PCR擴增條件95° C預變性3min，然后進行30循環(huán)95° C變性30s，60° C退火30s，72。C 延伸 30s，最后 72。C 延伸 IOmin ;
c.PCR產物純化后，一端帶生物素標記的雙鏈DNA通過生物素-鏈親合素之間的作用與鏈親合素交聯的磁珠結合，經過IX連接(the standard Binding and Washing Buffer,B&ff)緩沖液洗滌3次，用IOOmM的新鮮NaOH 37° C變性30 min,使不帶生物素的單鏈DNA從鏈親合素交聯的磁珠上洗脫下來，測定其單鏈DNA的濃度，用作下一輪篩選的富集庫。3)重復篩選重復上述SELEX篩選過程和PCR擴增富集過程，共進行9輪篩選，其中第5、8輪分別用大腸桿菌、豬霍亂沙門氏菌進行反篩。4)富集寡核苷酸適配子與菌結合率的測定
a.第1、3、5、7、9、11輪SELEX篩選的產物，以標記地高辛的引物III和標記生物素的引物IV進行PCR擴增，純化的PCR產物與鏈親和素標記的磁珠充分反應并用NaOH解鏈，地高辛標記的單鏈DNA游離在上清中；
b.按單鏈DNA:沙門氏菌08=300pmol:l. 5X108在IX結合緩沖液中結合，離心，棄上清，加入抗地高辛抗體標記的堿性磷酸酶反應15 min,重復洗漆,洗去未與沙門氏菌08上單鏈DNA-地高辛結合的抗地高辛抗體結合的堿性磷酸酶，以5-溴-4-氯-3-吲哚-磷酸鹽/四唑硝基藍(BCIP/NBT)顯色，終止反應后用酶聯儀于405 nm測定吸光度A值，見圖I。5)富集寡核苷酸適配子文庫的測序結果與分析
a.將最后的富集文庫擴增為雙鏈，連接pEGM-Τ載體，轉化^:coli DH5 α，隨機挑取22個陽性克隆進行DNA序列測定，其中19個為可用序列，見表I ;
b.采用ClustalW、RNA STRUCTURE和DNAMAN軟件分析19條序列一級結構的同源性并進行ニ級結構的預測；
c.結合親和力高低和配基高級結構，選出親和カ最高、能級較低的兩條寡核苷酸適配子的序列(寡核苷酸適配子10號、寡核苷酸適配子9號)，進行下一歩的鑒定。4.熒光基團標記寡核苷酸適配子(寡核苷酸適配子10號)與沙門氏菌08的熒光顯微鏡鑒定
1)將寡核苷酸適配子10號序列送上海生物工程有限公司合成并在5’端標記羥基熒光素(FAM)。5’-FAM-GATCCGGGCCTCATGTCGAACACCCCCCAACTAAAACAACAAAACACCACCGCCATTGAGCGTTTATTCTGAGCTCCCA-3’ ；
2)將FAM標記的寡核苷酸適配子10號分別與沙門氏菌08，豬霍亂沙門氏菌和大腸桿菌在IX結合緩沖液中結合，37° C孵育I小吋，離心棄上清，洗滌數次，直到上清沒有熒光為止；
3)將菌沉淀用10μ IX洗滌緩沖液重懸，涂在載玻片上，過火固定； 4)將載玻片置于緩沖液中洗滌2-3次，2分鐘/次，最后用無菌蒸餾水沖洗2秒鐘；
5)晾干，加封片劑、蓋玻片。熒光顯微鏡下觀察結合情況見圖3。實驗結果
通過SELEX篩選和親和カ分析，獲得了一條親和カ最高、能級最低的沙門氏菌08特異的寡核苷酸適配子10號，且對寡核苷酸適配子10號序列進行熒光基團標記應用后，上顯微鏡能明顯觀察到與沙門氏菌08發(fā)生特異性的結合。由圖I可見，隨著篩選輪數的増加，單鏈DNA富集庫的結合力逐漸增加，第9輪篩選獲得了很好的親和力，但當沙門氏菌上的結合位點達到ー個飽和狀態(tài)時，吸附到沙門氏菌上的單鏈DNA就不再增加。表I為SELEX篩選獲得的寡核苷酸適配子序列 寡核苷酸適配子I號
GATCCGGGCCTCATGTCGAACCCACACCCCACAACCACCCAGCCCCAGCCCGCTATTGAGCGTTTATTCTGAG
CTCCC
寡核苷酸適配子2號
GATCCGGGCCTCATGTCGAACACAACACCCAGCCAACGACCACAACTCCAACTCATTGAGCGTTTATTCTGAG
CTCCC
寡核苷酸適配子3號
GATCCGGGCCTCATGTCGAAACCACAACCCAACAACAAGAACCACAAAGAGCCCCTTGAGCGTTTATTCTGAG
CTCCC
寡核苷酸適配子4號
GATCCGGGCCTCATGTCGAACACACACAGAACCACAACCACTAAACACGAGGGCCTTGAGCGTTTATTCTGAG
CTCCC
寡核苷酸適配子5號
GATCCGGGCCTCATGTCGAACCAACAAGGCAGAAAGAAACCGACAAACCGCACTGTTGAGCGTTTATTCTGAG
CTCCC
寡核苷酸適配子6號
GATCCGGGCCTCATGTCGAACCAACAAGGCAGAAAGAAACCGACAAACCGCACTGTTGAGCGTTTATTCTGAG
CTCCC寡核苷酸適配子7號
GATCCGGGCCTCATGTCGAACCAACAAGGCAGAAAGAAACCGACAAACCGCACTGTTGAGCGTTTATTCTGAG
CTCCC
寡核苷酸適配子8號
GATCCGGGCCTCATGTCGAACCGAACGACTCAAAGATCAAGCCAAGCCACGCCCGTTGAGCGTTTATTCTGAG
CTCCC
寡核苷酸適配子9號
GATCCGGGCCTCATGTCGAACCAACCCAACACCAAAGAGACCACCACCACACGAGTTGAGCGTTTATTCTGAG
CTCCC
寡核苷酸適配子10號
GATCCGGGCCTCATGTCGAACACCCCCCAACTAAAACAACAAAACACCACCGCCATTGAGCGTTTATTCTGAG
CTCCC
寡核苷酸適配子11號
GATCCGGGCCTCATGTCGAACACGAGCCACCAACGCACCAAAACCCGTCCTCCACTTGAGCGTTTATTCTGAG
CTCCC
寡核苷酸適配子12號
GATCCGGGCCTCATGTCGAAGGCACGCGCACCAAAACACAAACTCCCCCCGCACCTTGAGCGTTTATTCTGAG
CTCCC
寡核苷酸適配子13號
GATCCGGGCCTCATGTCGAAGGGCCACCTAACCACCTCTGCCAATACCCCCCGCGTTGAGCGTTTATTCTGAG
CTCCC
寡核苷酸適配子14號
GATCCGGGCCTCATGTCGAAGGGAAGTCATGGCATGGATGCGCTCCCCGCCCACCTTGAGCGTTTATTCTGAG
CTCCC
寡核苷酸適配子15號
GATCCGGGCCTCATGTCGAAGGGAAGTCATGGCATGGATGCGCTCCCCGCCCACCTTGAGCGTTTATTCTGAG
CTCCC
寡核苷酸適配子16號
GATCCGGGCCTCATGTCGAACGGCGCAGTGACACGGTAGGGAGTCGTGCCGCGGCTTGAGCGTTTATTCTGAG
CTCCC
寡核苷酸適配子17號
GGGAGCTCAGAATAAACGCTCAAGGTGGGCGGGCGGCGTTGCTGTTCTTTTGCTGGTGTTCGACATGAGGCCC
GGATC
寡核苷酸適配子18號
GGGAGCTCAGAATAAACGCTCAAGAGGCGGCCTGTTCGCTTGTTGTGGGTCCGCTTGGTTCGACATGAGGCCC
GGATC
寡核苷酸適配子19號
GGGAGCTCAGAATAAACGCTCAAGGGCACTGGGTGGTGATGTTTTGTTTGTCTGGCGGTTCGACATGAGGCCC
GGATC寡核苷酸適配子20號
GGGAGCTCAGAATAAACGCTCAAGGGGGGGGTGGAGGGGTATGCAGTTTCGGTGGCCGTTCGACATGAGGCCC
GGATC
表I列出了 20條序列,一般來說，自由能最低的ニ級結構最穩(wěn)定。我們選擇自由能較低的寡核苷酸適配子10號和寡核苷酸適配子9號來測定其親和力。由圖2可見，寡核苷酸適配子10號的解離常數(Kd)為32. 04，寡核苷酸適配子9號的解離常數(Kd)為175.9。根據解離常數(Kd)值越低，適體的親和カ就越高，最終我們挑選寡核苷酸適配子10號為最優(yōu)適配體，并做進一歩驗證。由圖3可以得到結論熒光基團標記寡核苷酸適配子10號能特異識別沙門氏菌08，有較強的熒光，而與大腸桿菌和豬霍亂沙門氏菌無明顯結合，只存在極少量的熒光。
總之，篩選得到的寡核苷酸適配子10號能特異識別沙門氏菌08，敏感性高、速度快，該發(fā)明可用于檢測試劑盒的制備。本發(fā)明用于特異性檢測沙門氏菌08的具體方法如實施例中步驟4。
權利要求
1.特異識別沙門氏菌的寡核苷酸適配子的用途，所述寡核苷酸適配子的核苷酸序列如下5’-GATCCGGGCCTCATGTCGAACACCCCCCAACTAAAACAACAAAACACCACCGCCATTGAGCGTTTATTCTGAGCTCCCA-3’，其特征在于所述寡核苷酸適配子是一條78個堿基長的單鏈DNA，其在沙門氏菌08檢測中的應用。
全文摘要
本發(fā)明涉及特異識別沙門氏菌的寡核苷酸適配子的用途。所述寡核苷酸適配子是一條78個堿基長的單鏈DNA，其在沙門氏菌O8檢測中的應用。本發(fā)明以食源性沙門氏菌O8為目的靶分子，同時以大腸桿菌O86:K61和豬霍亂沙門氏菌為反篩菌，獲得了一條沙門氏菌O8特異的適配子。本方法具有檢測時間短、研發(fā)周期短、質量穩(wěn)定、操作簡單等優(yōu)點，在食品與衛(wèi)生安全檢測中得到廣泛應用。
文檔編號C12N15/115GK102808022SQ20121025865
公開日2012年12月5日 申請日期2012年7月25日 優(yōu)先權日2012年7月25日
發(fā)明者余曉峰, 張萍, 宗凱, 孫娟娟, 李云飛, 陳雪嬌, 鄭海松 申請人:安徽出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術中心