專利名稱：一株鹽單胞菌多基因敲除株的構(gòu)建和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及鹽單胞菌多基因敲除株的構(gòu)建和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
聚輕基脂肪酸酯(polyhydroxyalkanoates,簡稱PHA)是一種環(huán)境友好型塑料,具有良好的生物相容性、生物可降解性、壓電性等優(yōu)良特性，近年來已經(jīng)成為生物材料領(lǐng)域最為活躍的研究熱點，成為能夠替代石油化工 塑料，解決能源危機和環(huán)境污染的新型材料。PHA是許多微生物在碳、氮營養(yǎng)失衡的情況下合成的一種能作為碳源和能源的貯存顆粒，能夠通過微生物發(fā)酵獲得。雖然近十年來PHA產(chǎn)業(yè)鏈發(fā)展迅猛，但PHA制造過程的復(fù)雜性使其制造成本高昂，無法與以石油為基礎(chǔ)的傳統(tǒng)材料競爭。主要原因包括原材料成本、能耗、下游處理成本等。所以目前試圖采取很多方法來降低PHA的生產(chǎn)成本，比如，通過基因工程改造或代謝途徑改造來獲得性狀優(yōu)良的高產(chǎn)菌株，探索簡單有效的下游提取純化方法，利用價格低廉的原材料等。鹽單胞菌Halomonas sp. TDOl從新疆艾丁湖中分離出的一株適應(yīng)范圍很廣的中度嗜鹽菌，能在1%-20%(w/v)氯化鈉條件下生長，最高生長溫度為45°C，最高生長pH為11。Halomonas sp. TDOl能進行無滅菌連續(xù)發(fā)酵生產(chǎn)PHA,能在以葡萄糖作為單一碳源時合成聚輕基丁酸酯(polyhydroxybutyrate,簡稱PHB),發(fā)酵60h能達到80g/L的菌體干重和占菌體干重80%的PHB含量，而以丙酸或戊酸作為輔助碳源時合成聚羥基丁酸戊酸共聚酯(poly(3-hydroxybutyrate-co-3-hydroxyvalerate),簡稱 PHBV),但由于丙酸轉(zhuǎn)化率低，PHBV 中3-輕基戍酸(3-hydroxyvalerate簡稱3HV)單體的比例很低,材料性能差。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個目的是提供一種重組菌。本發(fā)明提供的重組菌，是對生產(chǎn)聚羥基脂肪酸酯的鹽單胞菌進行基因工程改造獲得的菌；所述基因工程改造為失活所述生產(chǎn)聚羥基脂肪酸酯的鹽單胞菌中與丙酸代謝途徑相關(guān)的一個或多個基因；所述與丙酸代謝途徑相關(guān)的一個或多個基因為2-甲基檸檬酸合成酶(PrpC)編碼基因、PHA降解酶I (phaZI)編碼基因、PHA降解酶2 (phaZ2)編碼基因和PHA降解酶3 (phaZ3)編碼基因中的至少一種。上述2-甲基朽1檬酸合成酶(2-methylcitrate synthase)PrpC的核苷酸序列為序列表中的序列I ;PHA降解酶IphaZUPHA降解酶2phaZ2、PHA降解酶3phaZ3的編碼基因的核苷酸序列依次為序列表中的序列2，3，4。上述重組菌中，所述生產(chǎn)聚羥基脂肪酸酯的鹽單胞菌為 Halomonas sp. TD01，保藏號為 CGMCC No. 4353。上述重組菌中，所述失活生產(chǎn)聚羥基脂肪酸酯的鹽單胞菌中的與丙酸代謝途徑相關(guān)的一個或多個基因為刪除各種所述基因的全部編碼框，即敲除各種所述基因的全部編碼框。本發(fā)明的另一個目的是提供一種構(gòu)建上述重組菌的方法。
本發(fā)明提供的方法，包括如下步驟失活生產(chǎn)聚羥基脂肪酸酯的鹽單胞菌中的上述與丙酸代謝途徑相關(guān)的一個或多個基因，得到的重組菌；所述失活生產(chǎn)聚羥基脂肪酸酯的鹽單胞菌中的所述與丙酸代謝途徑相關(guān)的一個或多個基因具體通過同源重組實現(xiàn)。上述與丙酸代謝途徑相關(guān)的一個或多個基因為2-甲基檸檬酸合成酶編碼基因、PHA降解酶I編碼基因、PHA降解酶2編碼基因和PHA降解酶3編碼基因中的至少一種。上述方法中，所述同源重組包括如下步驟I)將含有待敲除基因同源臂的DNA分子插入自殺質(zhì)粒中，得到重組自殺質(zhì)粒；所述含有待敲除基因同源臂的DNA分子由在所述生產(chǎn)聚羥基脂肪酸酯的鹽單胞
菌基因組中待敲除基因的上下游兩條同源臂組成；2)將所述重組自殺質(zhì)粒導(dǎo)入出發(fā)菌中，重組自殺質(zhì)粒通過同源重組整合至基因組的特定位置，得到同源重組菌I ;3)將誘導(dǎo)質(zhì)粒導(dǎo)入所述同源重組菌I中，誘導(dǎo)質(zhì)粒表達的歸位內(nèi)切酶I-SceI在同源重組菌I基因組的6個I-SceI位點進行切割，產(chǎn)生雙鏈的DNA缺口，能誘導(dǎo)二次同源重組的發(fā)生，即得到所述重組菌。在上述方法的步驟3)中，還包括將誘導(dǎo)質(zhì)粒導(dǎo)入所述同源重組菌I中得到的陽性克隆進行阿拉伯糖誘導(dǎo)，得到所述重組菌的步驟。上述方法中，所述生產(chǎn)聚輕基脂肪酸酯的鹽單胞菌為Halomonas sp. TD01,保藏號為 CGMCC No. 4353 ；所述自殺質(zhì)粒為帶有6個I-SceI位點的自殺質(zhì)粒pRE112-phaABC-6IsceI ；所述誘導(dǎo)質(zhì)粒為表達歸位內(nèi)切酶I-SceI的質(zhì)粒pMCSl_Spe_araC_ISceI。上述方法中，所述同源重組中，步驟I)的所述待敲除基因為2-甲基檸檬酸合成酶編碼基因，步驟2)的出發(fā)菌為所述生產(chǎn)聚羥基脂肪酸酯的鹽單胞菌，步驟3)得到重組菌A ;具體如下I)將含有2-甲基檸檬酸合成酶編碼基因同源臂的DNA分子(序列7)插入自殺質(zhì)粒pRE112-phaABC-6IsceI的XbaI和SacI酶切位點間，得到重組自殺質(zhì)粒pRE112-phaABC_6IsceI_A ；2)將上述重組質(zhì)粒pRE112-phaABC-6IsceI_A作為目標(biāo)質(zhì)粒先通過電轉(zhuǎn)化方法轉(zhuǎn)入大腸桿菌S17-lpir中，然后通過接合轉(zhuǎn)化方法轉(zhuǎn)入Halomonas sp. TDOl中，利用自殺質(zhì)粒不能在宿主菌內(nèi)復(fù)制的特性，用25μ g/mL氯霉素抗性的60LB平板篩選出同源重組菌I ;3)將pMCSl-Spe-araC-IScel導(dǎo)入所述同源重組菌I中，在阿拉伯糖誘導(dǎo)下培養(yǎng)，得到所述重組菌A (Halomonas sp. TD04)。上述方法中，所述同源重組中，步驟I)的所述待敲除基因為PHA降解酶I編碼基因，步驟2)的出發(fā)菌為所述生產(chǎn)聚羥基脂肪酸酯的鹽單胞菌，步驟3)得到重組菌B(Halomonas sp. TD02);具體如下I)將含有PHA降解酶I編碼基因同源臂的DNA分子(序列8)插入自殺質(zhì)粒pRE112-phaABC-6IsceI的XbaI和SacI酶切位點間，得到重組自殺質(zhì)粒pRE112-phaABC_6IsceI_B ；2)將上述重組質(zhì)粒pRE112-phaABC-6IsceI_B作為目標(biāo)質(zhì)粒先通過電轉(zhuǎn)化方法轉(zhuǎn)入大腸桿菌S17-lpir中，然后通過接合轉(zhuǎn)化方法轉(zhuǎn)入Halomonas sp. TDOl中，利用自殺質(zhì)粒不能在宿主菌內(nèi)復(fù)制的特性，用25μ g/mL氯霉素抗性的60LB平板篩選出同源重組菌I ;3)將pMCSl-Spe-araC-IScel導(dǎo)入所述同源重組菌I中，在阿拉伯糖誘導(dǎo)下培養(yǎng)，得到所述重組菌B (Halomonas sp. TD02)。上述方法中，對所述重組菌B進行上述的方法中的同源重組，步驟I)的所述待敲除基因為PHA降解酶2編碼基因，步驟2)的出發(fā)菌為所述重組菌B，步驟3)得到重組菌C ；具體如下I)將含有PHA降解酶2編碼基因同源臂 的DNA分子(序列9)插入自殺質(zhì)粒pRE112-phaABC-6IsceI的XbaI和SacI酶切位點間，得到重組自殺質(zhì)粒pRE112-phaABC-6IsceI-C ；2)將上述重組質(zhì)粒pRE112-phaABC-6IsceI_C作為目標(biāo)質(zhì)粒先通過電轉(zhuǎn)化方法轉(zhuǎn)入大腸桿菌S17-lpir中，然后通過接合轉(zhuǎn)化方法轉(zhuǎn)入重組菌B (Halomonas sp. TD02)中，利用自殺質(zhì)粒不能在宿主菌內(nèi)復(fù)制的特性，用25 μ g/mL氯霉素抗性的60LB平板篩選出同源重組菌I ;3)將pMCSl-Spe-araC-IScel導(dǎo)入所述同源重組菌I中，在阿拉伯糖誘導(dǎo)下培養(yǎng)，得到所述重組菌C (Halomonas sp. TD03)。上述方法中，對所述重組菌C進行上述的方法中的同源重組，步驟I)的所述待敲除基因為PHA降解酶3編碼基因，步驟2)的出發(fā)菌為所述重組菌C，步驟3)得到重組菌D ；具體如下I)將含有PHA降解酶3編碼基因同源臂的DNA分子(序列10)插入自殺質(zhì)粒pRE112-phaABC-6IsceI的XbaI和SacI酶切位點間，得到重組自殺質(zhì)粒pRE112-phaABC_6IsceI_D ；2)將上述重組質(zhì)粒pRE112-phaABC-6IsceI_D作為目標(biāo)質(zhì)粒先通過電轉(zhuǎn)化方法轉(zhuǎn)入大腸桿菌S17-lpir中，然后通過接合轉(zhuǎn)化方法轉(zhuǎn)入重組菌C (Halomonas sp. TD03)中，利用自殺質(zhì)粒不能在宿主菌內(nèi)復(fù)制的特性，用25 μ g/mL氯霉素抗性的60LB平板篩選出同源重組菌I ;3)將pMCSl-Spe-araC-IScel導(dǎo)入所述同源重組菌I中，在阿拉伯糖誘導(dǎo)下培養(yǎng)，得到所述重組菌D (Halomonas sp. TD05)。上述方法中，對所述重組菌D進行上述的方法中的同源重組，步驟I)的所述待敲除基因為2-甲基檸檬酸合成酶編碼基因，步驟2)的出發(fā)菌為所述重組菌D，步驟3)得到重組菌E ;具體如下I)將含有2-甲基檸檬酸合成酶編碼基因同源臂的DNA分子(序列7)插入自殺質(zhì)粒pRE112-phaABC-6IsceI的XbaI和SacI酶切位點間，得到重組自殺質(zhì)粒pRE112-phaABC_6IsceI_A ；2)將上述重組質(zhì)粒pRE112-phaABC-6IsceI_A作為目標(biāo)質(zhì)粒先通過電轉(zhuǎn)化方法轉(zhuǎn)入大腸桿菌S17-lpir中，然后通過接合轉(zhuǎn)化方法轉(zhuǎn)入重組菌D (Halomonas sp. TD05)中，利用自殺質(zhì)粒不能在宿主菌內(nèi)復(fù)制的特性，用25 μ g/mL氯霉素抗性的60LB平板篩選出同源重組菌I ;3)將pMCSl-Spe-araC-IScel導(dǎo)入所述同源重組菌I中，在阿拉伯糖誘導(dǎo)下培養(yǎng)，得到所述重組菌E (Halomonas sp. TD08)。上述制備方法得到的重組菌也是本發(fā)明保護的范圍。上述的重組菌在制備聚羥基丁酸戊酸共聚酯中的應(yīng)用也是本發(fā)明保護的范圍。上述的重組菌在提高聚羥基丁酸戊酸共聚酯中3-羥基戊酸單體所占的摩爾百分比中的應(yīng)用也是本發(fā)明保護的范圍。本發(fā)明的第三個目的是提供一種制備聚羥基丁酸戊酸共聚酯的方法。本發(fā)明提供的方法，包括如下步驟在含有丙酸的發(fā)酵培養(yǎng)基中發(fā)酵培養(yǎng)上述的重組菌，收集菌體，即得到聚羥基丁酸戊酸共聚酯。上述方法還可以包括如下步驟進行純化抽提聚羥基丁酸戊酸共聚酯取冰干后菌體用氯仿抽提得到PHBV，具體方法為氯仿干菌體=10:1混合后，加蓋密閉，1001處理4小時，冷卻至室溫后，加入等體積蒸餾水，充分振蕩混勻，靜置分層。取下層氯仿層，加入過量冰乙醇沉淀，晾干后得到PHBV粉末。上述方法中，所基述發(fā)酵培養(yǎng)中的丙酸終濃度為O. 5g/L_lg/L，發(fā)酵培養(yǎng)基中的丙酸終濃度具體為O. 5g/L。上述方法中，所述發(fā)酵培養(yǎng)基中含有氯化鈉，所述氯化鈉的濃度為250g/L以下，所述發(fā)酵培養(yǎng)基中氯化鈉的濃度具體為60g/L。上述發(fā)酵培養(yǎng)基為MM-G培養(yǎng)基，具體配方見實施例。本發(fā)明的實驗證明，本發(fā)明通過對一株能夠進行無滅菌連續(xù)發(fā)酵的中度嗜鹽菌Halomonas sp. TDOl進行基因工程改造，失活2-甲基檸檬酸合成酶PrpC和3個PHA降解酶，得到性狀更加優(yōu)良的新菌株，該菌株可高效地利用丙酸生產(chǎn)性能優(yōu)良的材料PHBV，丙酸轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物PHBV中3HV單體的轉(zhuǎn)化率接近100%，因而PHBV中3HV的摩爾比大大提高，改善了材料性能的同時也降低了 PHBV生產(chǎn)的底物成本；由于一系列遺傳操作手段的建立，有望使該菌株通過代謝工程改造，成為一種平臺生物來無滅菌連續(xù)生產(chǎn)各種生物制品，大幅度降低生物制品的生產(chǎn)成本。


圖I 為質(zhì)粒 pRE112-phaABC_6IsceI 和 pMCSl-Spe-araC-IScel 的圖譜。圖2為PrpC敲除株Halomonas sp. TD04丙酸梯度的搖瓶實驗。圖3 為 PrpC 敲除株 Halomonas sp. TD04 與野生型 Halomonas sp. TDOl 生產(chǎn) PHBV搖瓶對比實驗。圖4為PrpC敲除株Halomonas sp. TD04在發(fā)酵罐中細胞干重、PHBV含量、PHBV中3HV比例變化。圖 5 為 Halomonas sp. TDOKHalomonas sp. TD04 和 Halomonas sp.TD08 搖瓶對比實驗。
具體實施例方式本文所用的術(shù)語“丙酸轉(zhuǎn)化率”是指丙酸轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物PHBV中3HV的轉(zhuǎn)化率，具體為產(chǎn)物PHBV中3HV的濃度與丙酸消耗濃度的比值。本文所用的術(shù)語“鹽單胞菌”是指鹽單胞菌屬，是一類能在1-25% (質(zhì)量分數(shù))的鹽濃度中生長的中度嗜鹽細菌，革蘭氏陰性菌。本文所用的術(shù)語“PrpC”是指2-甲基檸檬酸合成酶。本文所用的術(shù)語“自殺質(zhì)?！笔侵覆荒茉谒拗骶羞M行復(fù)制的質(zhì)粒。本文所用的術(shù)語“敲除基因”是指通過將該基因的編碼框全部刪除，達到失活該基因的目的。本文所用的術(shù)語“失活基因”是指通過刪除全部或者部分編碼框，以及其他ー些方式，使該基因不能表達產(chǎn)物或者表達產(chǎn)物沒有功能。本文所用細胞干重(CDW，g/L)為冰干菌體的質(zhì)量與發(fā)酵產(chǎn)物體積的比值；本文所用PHBV含量(WT%)為PHBV的質(zhì)量與參與酯化的冰干菌體質(zhì)量的百分比，其中PHBV質(zhì)量為酯化后得到的3HV質(zhì)量與3HB的質(zhì)量和。本文所用3HV (mol%)為3HV單體的摩爾數(shù)與PHBV總摩爾數(shù)的百分比，其中PHBV總摩爾數(shù)為3HV單體的摩爾數(shù)+3HB (3-hydroxybutyrate, 3_輕基丁酸)單體的摩爾數(shù)。本發(fā)明的重組菌是在生產(chǎn)聚羥基脂肪酸酯的鹽單胞菌的基礎(chǔ)上通過基因工程改造而獲得的?；蚬こ滩僮鞯钠鹗季昕梢允且吧望}單胞菌，例如Halomonas sp. TDOl ；也可以是已經(jīng)經(jīng)過某些基因工程改造的重組鹽單胞菌，例如Halomonas sp. TD02。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解，本發(fā)明的重組菌中還可以包含其他基因突變，以便獲得某些性狀，例如底物代謝能力。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)的教導(dǎo)容易地引入此類突變。下面將結(jié)合實施例對本發(fā)明進行更加具體的描述。下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。下述實施例中所用酶試劑均購自MBI Fermentas公司，提取質(zhì)粒所用的試劑盒購自北京博邁德科技發(fā)展公司，提取細菌基因組及回收DNA片段所用的試劑盒購自美國omega公司，相應(yīng)的操作步驟按照產(chǎn)品說明書進行；所有培養(yǎng)基如無特別說明均用去離子水配制。下述實施例中產(chǎn)聚輕基脂肪酸酯的鹽單胞菌Halomonas sp. TDOl已于2010年11月19日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCC，地址為北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號，中國科學(xué)院微生物研究所)，保藏登記號為CGMCC No. 4353，分類命名為鹽單胞菌Halomonas sp. TDOl0下述實施例中的接合轉(zhuǎn)化方法具體如下I.將含有目標(biāo)質(zhì)粒的大腸桿菌S17_lpir (Biovector中國質(zhì)粒載體菌株基因庫，貨號Biovector-104802, http://biovector, blog. 163. com) 37°C培養(yǎng)至 0D600 0. 6-0. 8,4000rpm,4°C, IOmin離心,用新鮮LB洗漆一次并在同樣條件下離心,然后用500 y I新鮮LB重懸。2.將Halomonas sp. TDOl(或其敲除突變株)在37°C過夜培養(yǎng)，4000rpm，4°C，IOmin離心，用新鮮含有60g/L氯化鈉的LB培養(yǎng)基(以下簡稱為60LB)洗滌一次并在同樣條件下離心，然后用Iml新鮮含有60g/L氯化鈉的LB培養(yǎng)基。3. 二者各100 U I輕輕混合，并滴在30LB平板上(含有30g/L氯化鈉的LB平板)中央，37°C下接合6h。4.用新鮮含有60g/L氯化鈉的LB培養(yǎng)基Iml將上述平板上的菌苔洗下來，涂篩選平板(60LB+CmK+PH10 ;含有60g/L氯化鈉的LB固體培養(yǎng)基，含有25 u g/mL氯霉素，PH調(diào)節(jié)為10)，倒置培養(yǎng)24-36小吋。挑取單菌落用目標(biāo)質(zhì)粒的特異性引物進行菌落PCR驗證。下述實施例中的Halomonas sp. TDOl的2_甲基朽1樣酸合成酶(2-methylcitratesynthase) PrpC的核苷酸序列為序列表中的序列I ;PHA降解酶I phaZl、PHA降解酶2phaZ2、PHA降解酶3 phaZ3的編碼基因的核苷酸序列依次為序列表中的序列2，3，4。實施例l、Halomonas sp. TD04菌株的構(gòu)建及其功能鑒定(敲除2_甲基朽1檬酸合成酶(PrpC))經(jīng)過實驗摸索，發(fā)現(xiàn)以自殺質(zhì) 粒(pRE112_phaABC_6IsceI,不能在鹽單胞菌中進行復(fù)制的質(zhì)粒)介導(dǎo)的利用同源重組進行的定向基因組DNA敲除技術(shù)是適用于Halomonassp. TDOl的高效的敲除方法。優(yōu)點是可徹底對基因組DNA進行缺失突變，不存在回復(fù)突變的可能性，同時不會給基因組DNA引入任何抗性標(biāo)記，利于后續(xù)分子生物學(xué)工作的進行。通過優(yōu)化負篩方式，即通過額外表達歸位內(nèi)切酶I-Scel，在插入突變株基因組的6個I-SceI位點進行切割產(chǎn)生雙鏈的DNA缺ロ，能強烈誘導(dǎo)第二次同源重組的發(fā)生，相對于傳統(tǒng)的高蔗糖負篩方法，敲除效率大大提高。這種負篩方式在大腸桿菌中被證明有效[(;yfirgyPosfai et al. Markeriess gene replacement m Escherichia coll stimulated by adouble-strand break in the chromosome. Nucleic Acids Res 1999，27:4409-4415],但在Halomonas sp. TDOl中是首次成功被應(yīng)用。一、Halomonas sp. TD04 菌株的構(gòu)建I、構(gòu)建敲除載體以Halomonas sp. TDOl 的基因組 DNA 為模板，用引物 prpC-Hl-F (ATCG TCTAGAGGGCTTAGACGCTGCCATCG，斜體加粗為XbaI酶切位點及保護堿基，下同)和引物prpC_Hl-R(￡TTCTCAGGACCAGTGTAGTCGGCGCTTTGTCCACGGAGTCCT,劃線部分為重疊序列便于講行重疊延伸PCR (簡稱SOE PCR)，下同)進行擴增，得到501bp的產(chǎn)物(HI片段，2-甲基檸檬酸合成酶編碼基因的上游同源臂)；用 prpC-H2-F (AGGACTCCGTGGACAAAGCGCCGACTACACTGGTCCTGAGAAG)和 prpC-H2-R (ATCG 'GAGCTC CATTGGCTGTTGAGCACGCAG,斜體加粗為 SacI 酶切位點及保護堿基，下同)進行擴增，得到492bp的產(chǎn)物(H2片段，2-甲基檸檬酸合成酶編碼基因的下游同源臂)。以Hl片段和H2片段為模板，以prpC-Hl-F和prpC_H2-R為引物，進行PCR，得到993bp的融合PCR產(chǎn)物(H1-H2片段)，經(jīng)過測序，該融合PCR產(chǎn)物具有序列表中序列I所示的核苷酸(含有2-甲基檸檬酸合成酶編碼基因同源臂的DNA分子)。將上述融合PCR產(chǎn)物經(jīng)XbaI和SacI酶切，得到酶切產(chǎn)物，將酶切產(chǎn)物與經(jīng)過同樣酶切的自殺質(zhì)粒pRE112-phaABC-6ISCeI (該載體的核苷酸序列為序列表中的序列5，為自行構(gòu)建的自殺質(zhì)粒，即在pRE112[Robert A. Edwards. Improved allelic exchange vectorsand their use to analyze 987P fimbria gene expression.Gene207(1998) 149 -157]質(zhì)粒中通過酶切連接的方式插入了 6個I-SceI位點，圖1A)連接，得到重組質(zhì)粒pRE112-phaABC-6IsceI-A (將序列 I 插入 pRE112-phaABC_6IsceI 的 XbaI 和 SacI 酶切位點間得到的載體)。2、一次同源重組將上述重組質(zhì)粒pRE112-phaABC-6IsceI_A作為目標(biāo)質(zhì)粒先通過電轉(zhuǎn)化方法轉(zhuǎn)入大腸桿菌S17-lpir中，然后通過接合轉(zhuǎn)化方法轉(zhuǎn)入Halomonas sp. TDOl中(具體方法如前所述)，利用自殺質(zhì)粒不能在宿主菌內(nèi)復(fù)制的特性，用25 y g/mL氯霉素抗性的60LB平板篩選出陽性克隆I。在陽性克隆I中，帶有同源片段的自殺質(zhì)粒整合到基因組特定位置(經(jīng)過測序，該陽性克隆I基因組中含有pRE112-phaABC-6IsceI-A的全序列)。3、篩選二次同源重組突變株誘導(dǎo)質(zhì)粒pMCSl-Spe-araC-IScel(該載體的核苷酸序列為序列表中的序列6，自行構(gòu)建的載體，在pBBRlMCSl [Kovach, M. E. Four new derivatives of the broad-host-rangecloning vector pBBRlMCS, carrying different antibiotic-resistant cassettes.Genel66 (1995) 175 - 176]的多克隆位點處插入了壯觀霉素抗性基因及阿拉伯糖啟動子控制下的I-SceI基因，圖1B)表達ー種歸位內(nèi)切酶I-Scel，將在一次同源重組后產(chǎn)生的插入突變株基因組的6個I-SceI位點進行切割，產(chǎn)生雙鏈的DNA缺ロ(Double-Strand-Break)，這一行為將強烈的誘發(fā)第二次同源重組的發(fā)生，產(chǎn)生突變型或者野生型，然后通過特異的PCR引物將突變株篩選出來。最后將PCR產(chǎn)物進行測序進一步確認，具體步驟如下將上述陽性克隆I通過接合轉(zhuǎn)化導(dǎo)入誘導(dǎo)質(zhì)粒pMCSl-Spe-araC-IScel，在含有25 u g/mL氯霉素和100 u g/mL壯觀霉素的60LB平板上篩選得到陽性克隆2。在阿拉伯糖誘導(dǎo)下培養(yǎng)(在含有0. 3%阿拉伯糖濃度的60LB固體平板上，37°C培養(yǎng)24h)陽性克隆2，對得到的單克隆用上述引物prpC-Hl-F和prpC_H2-R進行菌落PCR驗證。得到993bp的PCR產(chǎn)物為陽性克隆3。測序該陽性克隆3的基因組DNA，發(fā)現(xiàn)其為將Halomonas sp. TDOl敲除prpC基因(序列I)得到的菌株，命名為Halomonas sp. TD04。ニ、Halomonas sp. TD04 菌株的功能鑒定I、培養(yǎng)基配方種子液活化采用60LB培養(yǎng)基5g/L酵母提取物，10g/L蛋白胨，60g/L NaCl，其余為水。121°C高壓蒸汽滅菌20分鐘。搖瓶發(fā)酵采用優(yōu)化MM-G培養(yǎng)基I升優(yōu)化MM-G培養(yǎng)基按照如下方法制備基底30g葡萄糖、60g氯化鈉、Ig酵母粉，890mL蒸餾水溶解，112°C滅菌20分鐘；組分I :2g/L氯化銨、0. 2g/L硫酸鎂，配制成50倍母液，121°C滅菌20分鐘；組分II :1. 5g/L磷酸ニ氫鉀、9. 65g/L十二水合磷酸氫ニ鈉，配制成50倍母液，121°C滅菌20分鐘；微量元素微量元素I10ml/L、微量元素II lml/L，配制成50倍母液，母液pH值調(diào)節(jié)至4. 0-5. 0，121°C滅菌20分鐘；微量元素I和微量元素II配制同下；I升所述微量元素I按照如下方法制備將檸檬酸鐵銨5g、ニ水合氯化鈣2g和0. 5mol/L鹽酸水溶液混合，用0. 5mol/L鹽酸水溶液補足至I升，得到所述微量元素I ;I升微量元素II按照如下方法制備將七水合硫酸鋅lOOmg、四水合氯化錳30mg、硼酸300mg、六水合氯化鈷200mg、五水合硫酸銅10mg、六水合氯化鎳20mg、ニ水合鑰酸鈉30mg和0. 5mol/L鹽酸水溶液混合，用0. 5mol/L鹽酸水溶液補足至I升，得到所述微量元素II。
基底、組分I、組分II、微量元素分別單獨滅菌，冷卻后，分別取20mL組分I母液、20mL組分II母液和20mL微量元素母液加入基底，再調(diào)節(jié)pH至9. O。在實際培養(yǎng)過程中，可向上述培養(yǎng)基中再添加一定濃度的抗生素以維持質(zhì)粒的穩(wěn)定性，如100 Ii g/mL氨節(jié)青霉素，50 u g/mL硫酸卡那霉素和25 u g/mL的氯霉素。發(fā)酵罐發(fā)酵采用培養(yǎng)基如下I升發(fā)酵初始培養(yǎng)基由氯化鈉60g，葡萄糖30g，酵母粉lg，氯化銨2g，尿素3g，硫酸鎂0. 2g，磷酸ニ氫鉀I. 5g，十二水合 磷酸氫ニ鈉9. 65g，IOmL微量元素I、ImL微量元素II和自來水組成，用自來水定容至I升。微量元素I，II的配制如前所述。發(fā)酵補料培養(yǎng)基配制I升補料培養(yǎng)基I :600g葡萄糖,60g氯化銨,用自來水定容至I升。I升補料培養(yǎng)基II :600g葡萄糖,用自來水定容至I升。發(fā)酵初始條件 .溫度為37°C，pH值為9. 0，DO設(shè)置為50%，空氣通氣量為3升/分鐘，DO與轉(zhuǎn)速相偶聯(lián)，最低轉(zhuǎn)速200轉(zhuǎn)/分，最高轉(zhuǎn)速800轉(zhuǎn)/分。在6L 發(fā)酵罐(Bioflo 3000, New Brunswick, NJ, USA)中配制 2. 7L 發(fā)酵初始培養(yǎng)基，不進行滅菌，所用水為自來水。當(dāng)發(fā)酵初始條件(溫度、pH、D0)調(diào)試完成后，接入300mLニ級種子培養(yǎng)液，開始發(fā)酵。發(fā)酵12小時后，每隔4小時加入IOOmL補料培養(yǎng)基I ;發(fā)酵24小時后，每隔4小時加入IOOmL補料培養(yǎng)基II。整個過程包括初始培養(yǎng)基，補料培養(yǎng)基，發(fā)酵罐體等均不滅菌。500L中試發(fā)酵(工作體積300L)在山東魯抗集團進行，發(fā)酵條件同上。2、發(fā)酵Halomonas sp. TDOl野生型在添加丙酸作為輔助碳源時，能積累PHBV中3HV的比例維持在2-3mol%[薛源生.利用Halomonas sp. TDOl生產(chǎn)低成本聚羥基脂肪酸酷.清華大學(xué)理學(xué)碩士論文.2011]，這種低比例影響了材料的性能，所以需要提高PHBV中3HV的比例。丙酸在Halomonas sp. TDOl中的代謝途徑顯示，丙酸在細胞內(nèi)被轉(zhuǎn)化成丙酰輔酶A后，一部分會進入PHBV的合成途徑，另一部分會被2-甲基檸檬酸合成酶PrpC催化成2-甲基檸檬酸合成酶，隨后進入三羧酸循環(huán)被代謝掉，用于細胞生長。敲除關(guān)鍵酶2-甲基檸檬酸合成酶PrpC后，加入的丙酸將不能進入三羧酸循環(huán)用于細胞生長。A)、搖瓶實驗I)種子活化培養(yǎng)將上述得到的Halomonas sp. TD04菌株接種于相應(yīng)60LB培養(yǎng)基，在37°C、200轉(zhuǎn)/分搖床中培養(yǎng)12h，得到種子培養(yǎng)液。2)搖瓶發(fā)酵將上述I)得到的種子培養(yǎng)液按5% (體積百分含量)接種量接入裝有IOOmL含有不同濃度丙酸優(yōu)化MM-G培養(yǎng)基的500mL三角瓶中，丙酸濃度分別為0g/L，0. Ig/L，0. 3g/L，0. 5g/L，0. 8g/L，I. Og/L，I. 5g/L，2. Og/L，2. 5g/L，3. Og/L，37°C、pH9. 0、200 轉(zhuǎn) / 分條件下，搖床培養(yǎng)48小吋，收集發(fā)酵產(chǎn)物。3)發(fā)酵產(chǎn)物分析(I)細胞干重取出25mL發(fā)酵產(chǎn)物12000轉(zhuǎn)/分(20670xg，離心直徑115mm)離心10分鐘收集菌體，用去離子水洗滌兩次，冷凍冰干，得到TD04冰干后菌體，冰干后菌體稱重計算細胞干重(CDff)0實驗重復(fù)三次，結(jié)果取平均值。(2 )、PHBV產(chǎn)量和3HV占PHBV的比例取30mg TD04冰干后菌體進行酯化，氣相色譜(GC)檢測PHBV含量，實驗重復(fù)三次，結(jié)果取平均值；具體如下酷化方法為取30mg冰干菌體于酯化管中，加入2mL氯仿、2mL酷化液混勻，加蓋密閉，100°C烘箱中酯化4小吋。冷卻至室溫后，加入ImL蒸餾水，充分振蕩混勻，靜置分層。待氯仿相與水完全分離后，取氯仿相進行氣相色譜分析。I升酯化液配置方法lg苯甲酸、30mL濃硫酸溶于970mL甲醇,得到酯化液。同時取IOmg的標(biāo)樣物質(zhì)進行酯化。氣相色譜(GC)分析依照HP公司Hewlett Packard 6890 (HP, USA)氣相色譜儀的說明書操作氣相色譜儀。設(shè)定柱頭溫度為140°C，進樣器溫度為200°C，檢測器溫度為220°C，柱頭壓カ為0. 25Mpa，程序升溫條件為140°C I分鐘，以20°C /分的速度升溫至220°C，并在此溫度保持I分鐘。樣品進樣量為lul。液相色譜(HPLC)分析用于檢測培養(yǎng)液中的葡萄糖及各類酸，流動相為5mMH2SO4,流速為 0. 5ml/min (BioRad, Aminexs HPX-87H, 7. 8*300mm2 離子交換柱，示差折光檢測器)。上述兩個實驗的結(jié)果如表I和圖2所示。表I為Halomonas sp. TD04生產(chǎn)PHBV的丙酸搖瓶梯度實驗結(jié)果
權(quán)利要求
1.ー種重組菌，是對生產(chǎn)聚羥基脂肪酸酷的鹽單胞菌進行基因工程改造獲得的菌；所述基因工程改造為失活所述生產(chǎn)聚羥基脂肪酸酯的鹽單胞菌中與丙酸代謝途徑相關(guān)的ー個或多個基因；所述與丙酸代謝途徑相關(guān)的ー個或多個基因為2-甲基檸檬酸合成酶編碼基因、PHA降解酶I編碼基因、PHA降解酶2編碼基因和PHA降解酶3編碼基因中的至少ー種。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的重組菌，其特征在于 所述生產(chǎn)聚羥基脂肪酸酷的鹽單胞菌為Halomonas sp. TDOl，保藏號為CGMCCNo. 4353。
3.根據(jù)權(quán)利要求I或2所述的重組菌，其特征在于 所述失活生產(chǎn)聚羥基脂肪酸酯的鹽單胞菌中的與丙酸代謝途徑相關(guān)的ー個或多個基因為刪除各種所述基因的全部編碼框。
4.ー種構(gòu)建權(quán)利要求1-3任一所述重組菌的方法，包括如下步驟失活生產(chǎn)聚羥基脂肪酸酯的鹽單胞菌中的所述與丙酸代謝途徑相關(guān)的ー個或多個基因，得到的重組菌； 所述失活生產(chǎn)聚羥基脂肪酸酯的鹽單胞菌中的所述與丙酸代謝途徑相關(guān)的ー個或多個基因具體通過同源重組實現(xiàn)。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于所述同源重組包括如下步驟 1)將含有待敲除基因同源臂的DNA分子插入自殺質(zhì)粒中，得到重組自殺質(zhì)粒； 所述含有待敲除基因同源臂的DNA分子由在所述生產(chǎn)聚羥基脂肪酸酯的鹽單胞菌基因組中待敲除基因的上下游兩條同源臂組成； 2)將所述重組自殺質(zhì)粒導(dǎo)入出發(fā)菌中，得到同源重組菌I; 3)將誘導(dǎo)質(zhì)粒導(dǎo)入所述同源重組菌I中，即得到所述重組菌。
6.根據(jù)權(quán)利要求4或5所述的方法，其特征在于 在上述方法的步驟3)中，還包括將誘導(dǎo)質(zhì)粒導(dǎo)入所述同源重組菌I中得到的陽性克隆進行阿拉伯糖誘導(dǎo)，得到所述重組菌的步驟； 所述生產(chǎn)聚輕基脂肪酸酯的鹽單胞菌為Halomonas sp. TDO I,保藏號為CGMCCNo. 4353 ； 所述自殺質(zhì)粒為帶有6個I-SceI位點的自殺質(zhì)粒pRE112-phaABC-6IsceI ； 所述誘導(dǎo)質(zhì)粒為表達歸位內(nèi)切酶I-SceI的質(zhì)粒pMCSl-Spe-araC-IScel。
7.根據(jù)權(quán)利要求5或6所述的方法，其特征在于 所述同源重組中，步驟I)的所述待敲除基因為2-甲基檸檬酸合成酶編碼基因，步驟2)的出發(fā)菌為所述生產(chǎn)聚羥基脂肪酸酯的鹽單胞菌，步驟3)得到重組菌A。
8.根據(jù)權(quán)利要求5或6所述的方法，其特征在于 所述同源重組中，步驟I)的所述待敲除基因為PHA降解酶I編碼基因，步驟2)的出發(fā)菌為所述生產(chǎn)聚羥基脂肪酸酷的鹽單胞菌，步驟3)得到重組菌B。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于對所述重組菌B進行權(quán)利要求5或6所述的方法中的同源重組，步驟I)的所述待敲除基因為PHA降解酶2編碼基因，步驟2)的出發(fā)菌為所述重組菌B，步驟3)得到重組菌C。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于對所述重組菌C進行權(quán)利要求5或6所述的方法中的同源重組，步驟I)的所述待敲除基因為PHA降解酶3編碼基因，步驟2)的出發(fā)菌為所述重組菌C，步驟3)得到重組菌D。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法，其特征在于對所述重組菌D進行權(quán)利要求5或6所述的方法中的同源重組，步驟I)的所述待敲除基因為2-甲基檸檬酸合成酶編碼基因，步驟2)的出發(fā)菌為所述重組菌D，步驟3)得到重組菌E。
12.權(quán)利要求1-3中任一所述的重組菌在制備聚羥基丁酸戊酸共聚酯中的應(yīng)用。
13.權(quán)利要求1-3中任一所述的重組菌在提高聚羥基丁酸戊酸共聚酯中3-羥基戊酸單體所占的摩爾百分比中的應(yīng)用。
14.一種制備聚羥基丁酸戊酸共聚酯的方法，包括如下步驟在含有丙酸的發(fā)酵培養(yǎng)基中發(fā)酵培養(yǎng)權(quán)利要求1-3中任一所述的重組菌，收集菌體，即得到聚羥基丁酸戊酸共聚酷。
15.權(quán)利要求14所述的方法，其特征在于所述發(fā)酵培養(yǎng)基中的丙酸終濃度為0.5g/L-lg/L，所述發(fā)酵培養(yǎng)基中的丙酸終濃度具體為0. 5g/L。
16.權(quán)利要求14或15所述的方法，其特征在于 所述發(fā)酵培養(yǎng)基中含有氯化鈉，所述氯化鈉的濃度為250g/L以下，所述發(fā)酵培養(yǎng)基中氯化鈉的濃度具體為60g/L。
全文摘要
本發(fā)明公開了一株鹽單胞菌多基因敲除株的構(gòu)建和應(yīng)用。本發(fā)明提供了一種重組菌，為失活生產(chǎn)聚羥基脂肪酸酯的鹽單胞菌中的與丙酸代謝途徑相關(guān)的一個或多個基因后得到的重組菌；所述與丙酸代謝途徑相關(guān)的一個或多個基因為2-甲基檸檬酸合成酶編碼基因、PHA降解酶1編碼基因、PHA降解酶2編碼基因和PHA降解酶3編碼基因中的至少一種。本發(fā)明的實驗證明，本發(fā)明通過對鹽單胞菌Halomonas sp.TD01進行分子改造，敲除2-甲基檸檬酸合成酶PrpC及3個PHA降解酶得到新的重組菌，可高效的利用丙酸生產(chǎn)材料性能更加優(yōu)良的PHBV，大大提高了生產(chǎn)出的聚羥基丁酸戊酸共聚酯中3-羥基戊酸單體的比例及底物丙酸的轉(zhuǎn)化率。
文檔編號C12R1/01GK102816729SQ201210258589
公開日2012年12月12日 申請日期2012年7月24日 優(yōu)先權(quán)日2012年7月24日
發(fā)明者陳國強, 譚丹, 李騰 申請人:清華大學(xué)