專(zhuān)利名稱(chēng)：一種利用堿蓬細(xì)胞懸浮培養(yǎng)生產(chǎn)脯氨酸的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明專(zhuān)利屬于生物技術(shù)和生物工程領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
利用微生物發(fā)酵工程生產(chǎn)脯氨酸是目前較常用的一種方法。經(jīng)過(guò)多年的研發(fā)，脯氨酸產(chǎn)量有所提高，但進(jìn)一步提升，難度會(huì)越來(lái)越大。為探究脯氨酸生產(chǎn)新途徑，本發(fā)明，以鹽地堿蓬為發(fā)酵生物，利用細(xì)胞懸浮培養(yǎng)大規(guī)模生產(chǎn)脯氨酸就是本發(fā)明的目的。為了利用植物懸浮細(xì)胞培養(yǎng)工業(yè)化生產(chǎn)脯氨酸，本實(shí)驗(yàn)以鹽地堿蓬為研究對(duì)象，應(yīng)用單因素試驗(yàn)和主要因子的正交試驗(yàn)等方法對(duì)鹽地堿蓬的愈傷組織誘導(dǎo)、懸浮體系建立和細(xì)胞懸浮培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件優(yōu)化等方面進(jìn)行了研究。

發(fā)明內(nèi)容
I消毒種子、無(wú)菌培養(yǎng)制備堿蓬無(wú)菌苗；2以無(wú)菌堿蓬的子葉為外植體在脫分化培養(yǎng)基中誘導(dǎo)愈傷組織；愈傷組織經(jīng)過(guò)多次固體培養(yǎng)基的繼代培養(yǎng)獲得更為松散的愈傷組織；3松散型愈傷組織經(jīng)液體培養(yǎng)基在無(wú)菌條件下振蕩培養(yǎng)制備懸浮細(xì)胞體系；過(guò)篩后液體培養(yǎng)基中繼代培養(yǎng)獲得穩(wěn)定的懸浮細(xì)胞系；、4經(jīng)愈傷組織誘導(dǎo)的看護(hù)培養(yǎng)篩選出快速生長(zhǎng)的細(xì)胞系；繼續(xù)進(jìn)行細(xì)胞的懸浮培養(yǎng)獲得發(fā)酵種子細(xì)胞；5確定堿蓬懸浮細(xì)胞積累脯氨酸的NaCl添加時(shí)期和添加量等；6堿蓬的懸浮培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件的優(yōu)化，獲得植物細(xì)胞生長(zhǎng)和產(chǎn)物積累的最適碳氮源、pH、溫度、溶氧量、和最佳接種量等發(fā)酵工藝參數(shù)，為大規(guī)模堿蓬細(xì)胞懸浮培養(yǎng)生產(chǎn)脯氨酸奠定基礎(chǔ)。主要用途本發(fā)明專(zhuān)利，通過(guò)細(xì)胞脫分化和發(fā)酵工程途徑，利用堿蓬細(xì)胞的大規(guī)模懸浮培養(yǎng)
生產(chǎn)脯氨酸。
具體實(shí)施例方式I制備無(wú)菌苗選取無(wú)病植株，在冬季采摘其種子；用無(wú)菌水清洗種子后，分別用質(zhì)量百分比為70%酒精和10%次氯酸鈉消毒Imin和15min，再用無(wú)菌水多次清洗；將種子接種在滅菌的MS培養(yǎng)基中，在自然光照、室溫、無(wú)菌條件下培養(yǎng)5 20天，獲得無(wú)菌苗。2愈傷組織的誘導(dǎo)切下無(wú)菌苗的子葉，將子葉切成O. 5cm長(zhǎng)的小片段接種到含有植物激素組合(2，4-Dlmg/L和6-BAO. 5mg/L)的培養(yǎng)基中，其光照條件為光照16小時(shí)、黑暗8小時(shí)，光照強(qiáng)度約200 ΙΟΟΟμπιοΙ/m/s，在室溫下培養(yǎng)20天左右；在形成的愈傷組織中，選擇顏色為白色或淡黃色、質(zhì)地較為松散的愈傷組織，在含同樣植物激素組合的新的的培養(yǎng)基中進(jìn)行繼代培養(yǎng)，直到獲得生長(zhǎng)旺盛、松散良好的愈傷組織為止。3制備懸浮細(xì)胞將松散型愈傷組織置入含植物激素液體MS培養(yǎng)基中2，4_D0. I 4mg/L和6-BA0. I 2. Omg/L或ΚΤ0. I I. Omg/L，振蕩、光照培養(yǎng)10 15天;考察細(xì)胞密度、脯氨酸含量和還原糖消耗量。結(jié)果表明，2，4-D1.0mg/L和6-BA或KTO. lmg/L的激素組合細(xì)胞密度和脯氨酸含量最高。液體培養(yǎng)基經(jīng)3次繼代培養(yǎng)，接種時(shí)間為5 10天；生長(zhǎng)穩(wěn)定期的細(xì)胞或小細(xì)胞團(tuán)分散度均勻穩(wěn)定，細(xì)胞密度每毫升達(dá)到3 X IO6個(gè)。4高產(chǎn)細(xì)胞系篩選利用無(wú)菌苗的子葉制備新鮮堿蓬愈傷組織，繼代I次；在第二次繼代培養(yǎng)第6天時(shí)，用滅菌鑷子將密布的愈傷組織弄平；然后輕輕在其表面覆蓋滅菌的濾紙；最后將密度 已稀釋到每毫升IXIO3個(gè)的懸浮細(xì)胞涂布在濾紙表面進(jìn)行培養(yǎng)；通過(guò)比較小愈傷組織的大小和形態(tài)篩選出快速生長(zhǎng)的細(xì)胞系；繼續(xù)進(jìn)行細(xì)胞懸浮培養(yǎng)獲得發(fā)酵種子細(xì)胞；其時(shí)，獲得的20個(gè)細(xì)胞系，其懸浮細(xì)胞生長(zhǎng)曲線表明，生長(zhǎng)周期平均為15. 6天，細(xì)胞倍增時(shí)間平均為11個(gè)小時(shí)。5培養(yǎng)基中NaCl添加時(shí)期和添加量的確定采用完全設(shè)計(jì)手段，在高產(chǎn)細(xì)胞系懸浮培養(yǎng)基中和不同培養(yǎng)時(shí)間添加O 2. 5%NaCl，通過(guò)制備的細(xì)胞干重生長(zhǎng)曲線和脯氨酸含量變化曲線以確定堿蓬細(xì)胞懸培養(yǎng)基的NaCl添加時(shí)期和添加量等。結(jié)果表明，當(dāng)初始階段NaCl添加量為O. 5%時(shí)，細(xì)胞干重最高；后期的添加量為2. 0%時(shí)，脯氨酸的積累濃度達(dá)到最高值，為2516. 32μ g/mL，為對(duì)照的2倍以上。6懸浮細(xì)胞培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件優(yōu)化通過(guò)單因子分析和正交設(shè)計(jì)對(duì)堿蓬的懸浮培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件的優(yōu)化，獲得植物細(xì)胞生長(zhǎng)和產(chǎn)物積累的最佳植物激素組合、最適碳氮源、pH、溫度、溶氧量、和最佳接種量等發(fā)酵工藝參數(shù)，為大規(guī)模堿蓬細(xì)胞懸浮培養(yǎng)生產(chǎn)脯氨酸奠定基礎(chǔ)。表I 4為影響堿蓬細(xì)胞懸浮培養(yǎng)的四個(gè)最重要的因子正交設(shè)計(jì)及其結(jié)果植物激素組合、接種量、搖床轉(zhuǎn)速和無(wú)機(jī)氮源。由表可知，四因子的顯著性順序?yàn)榈?gt;激素水平>接種量>搖床轉(zhuǎn)速，其中氮源達(dá)到了極顯著水平。因素最佳水平為A1B2C3D2,即培養(yǎng)基中添加激素(2，4-D2mg/L，6-BAlmg/U，接種量為1/4，搖床轉(zhuǎn)速120r/min，硝酸鉀為氮源。驗(yàn)證試驗(yàn)的平均產(chǎn)酸為1074. 50 μ g/
mLo表I正交實(shí)驗(yàn)因素水平的設(shè)計(jì)
權(quán)利要求
1.一種利用堿蓬細(xì)胞懸浮培養(yǎng)生產(chǎn)脯氨酸的方法。其特征是在MS基本培養(yǎng)基+2，4-D0.I 3. 5mg/L+6-BAlmg/L和光照條件下以子葉為外植體誘導(dǎo)愈傷組織、繼代培養(yǎng)獲得松散型愈傷組織；在液體培養(yǎng)基中進(jìn)行振蕩培養(yǎng)制備堿蓬懸浮細(xì)胞體系；繼代培養(yǎng)的最佳接種時(shí)間為5 10天和繼代時(shí)間為8 16天，獲得分散度較好的細(xì)胞系或小細(xì)胞團(tuán)。
2.利用看護(hù)培養(yǎng)的手段篩選出高產(chǎn)細(xì)胞系。
3.在堿蓬細(xì)胞懸浮培養(yǎng)的早期添加O.2 I. O %氯化鈉促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)；在后期添加·O.5 2. 5%氯化鈉促進(jìn)脯氨酸的積累。
4.對(duì)堿蓬細(xì)胞懸浮培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件的優(yōu)化，培養(yǎng)基與培養(yǎng)條件為MS培養(yǎng)基添加激素為2，4-D0. I 3. 5mg/L+6-BA0. 5 I. 5mg/L，接種量為10 30%，添加碳源和氮源分別為山梨醇和硝酸鉀，搖床轉(zhuǎn)速和培養(yǎng)溫度分別為60 ISOrpm和20 35°C，光照條件下培養(yǎng)。
全文摘要
一種利用堿蓬細(xì)胞懸浮培養(yǎng)生產(chǎn)脯氨酸的方法，屬于生物技術(shù)和生物工程領(lǐng)域。為適應(yīng)鹽堿環(huán)境堿蓬細(xì)胞分泌脯氨酸，以此細(xì)胞為發(fā)酵生物，可以進(jìn)行大規(guī)模懸浮培養(yǎng)生產(chǎn)脯氨酸。首先，制備堿蓬無(wú)菌苗，用其子葉誘導(dǎo)愈傷組織，并經(jīng)過(guò)繼代培養(yǎng)獲得松散型愈傷組織；然后，用松散型愈傷組織進(jìn)行振蕩培養(yǎng)制備懸浮細(xì)胞體系；過(guò)篩后繼代培養(yǎng)獲得穩(wěn)定的、分散度好的懸浮細(xì)胞系；經(jīng)過(guò)看護(hù)培養(yǎng)篩選高產(chǎn)細(xì)胞系；再次，確定堿蓬細(xì)胞積累脯氨酸的NaCl添加時(shí)期和添加量；最后，優(yōu)化其懸浮細(xì)胞培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件，獲得其細(xì)胞生長(zhǎng)和脯氨酸積累的最適碳氮源、pH、溫度、溶氧量、和最佳植物激素組合和接種量等主要發(fā)酵工藝參數(shù)，為大規(guī)模細(xì)胞懸浮培養(yǎng)提供依據(jù)。本發(fā)明為堿蓬細(xì)胞懸浮培養(yǎng)生產(chǎn)脯氨酸提供了工藝流程。
文檔編號(hào)C12N5/02GK102719503SQ20121022984
公開(kāi)日2012年10月10日 申請(qǐng)日期2012年7月5日 優(yōu)先權(quán)日2012年7月5日
發(fā)明者周鑫, 崔興華, 張黎明, 曹愛(ài)佳, 李興林, 滿(mǎn)淑麗, 王丹丹, 趙俊, 韓楊, 高文遠(yuǎn) 申請(qǐng)人:天津科技大學(xué)