專利名稱：一種大目、長(zhǎng)鰭、藍(lán)鰭金槍魚生魚片的鑒定方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于食品檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，具體地涉及一種大目、長(zhǎng)鰭、藍(lán)鰭金槍魚生魚片的鑒定方法。
背景技術(shù)：
從生物學(xué)分類上講，金槍魚指S盧形目(Perciformes)鯖科(Scombridae)金槍魚屬(Thunnus)的共計(jì)8種魚類。經(jīng)濟(jì)價(jià)值較大的種類包括藍(lán)鰭金槍魚(Thunnus maccoyii)、 大目金槍魚(Thunnus obesus)、黃鰭金槍魚(Thunnus albacares)、長(zhǎng)鰭金槍魚(Thunnusalalunga)等，其中大目金槍魚、長(zhǎng)鰭金槍魚、藍(lán)鰭金槍魚是國(guó)內(nèi)生魚片主要的原料魚。金槍魚是國(guó)際營(yíng)養(yǎng)學(xué)會(huì)推薦的三大營(yíng)養(yǎng)魚之一，具有肉質(zhì)柔嫩，高蛋白低脂肪，富含多種維生素和微量元素，尤其是DHA和EPA等不飽和脂肪酸含量非常豐富，DHA被人們稱為“腦黃金”，是人類大腦和中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育必需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，經(jīng)常食用金槍魚，有利于腦細(xì)胞的再生、促進(jìn)大腦發(fā)育、改善記憶力、提高學(xué)習(xí)能力、預(yù)防老年癡呆癥。EPA又稱0MEGA-3，是金槍魚所特有的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，可抑制膽固醇增加和防止動(dòng)脈硬化，對(duì)預(yù)防和治療心腦血管疾病有著特殊的作用。金槍魚肉中蛋白質(zhì)含量高，生物價(jià)高達(dá)90，是一種氨基酸配合優(yōu)越的蛋白質(zhì)，而且含有豐富的蛋氨酸及胱氨酸，有保護(hù)肝臟的功能。DHA、EPA均能減少血液中的中性脂肪，有利于肝細(xì)胞再生，而?；撬峋哂写龠M(jìn)肝臟排泄的作用，經(jīng)常食用金槍魚食品，能夠保護(hù)肝臟，提高肝臟的排泄功能，降低肝臟發(fā)病率。金槍魚中的EPA、蛋白質(zhì)、?；撬峋薪档湍懝檀嫉墓πВ?jīng)常食用，能有效地減少血液中的惡性膽固醇，增加良性膽固醇，從而能預(yù)防因膽固醇含量過高所引起的心血管疾病。鑒于金槍魚的上述種種優(yōu)點(diǎn)，目前金槍魚的消費(fèi)量逐年增大，其中生魚片是金槍魚的最重要的消費(fèi)方式。藍(lán)鰭金槍魚由于捕撈量稀少，因而其經(jīng)濟(jì)價(jià)值較高，藍(lán)鰭金槍魚是長(zhǎng)鰭金槍魚和大目金槍魚價(jià)格的兩倍之多，然而生魚片缺乏外部形態(tài)學(xué)特征，不易鑒定其真?zhèn)?，不法商家以次充好，甚至通過染色的方式，以低價(jià)值金槍魚生魚片冒充高價(jià)值金槍魚生魚片，獲取暴利，擾亂了市場(chǎng)秩序，破壞了商業(yè)誠(chéng)信，損害了消費(fèi)者利益，因此急需針對(duì)上述三種金槍魚生魚片建立快速、準(zhǔn)確的鑒定方法。分子生物學(xué)技術(shù)為金槍魚的真?zhèn)舞b定提供了可靠的理論和技術(shù)，其中線粒體DNA(mitochondrial, mtDNA)常常作為真?zhèn)舞b定研究的主要對(duì)象。mtDNA具有分子結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、母系遺傳進(jìn)化速率適中、無重組等優(yōu)點(diǎn)，比核DNA更容易檢測(cè)，采用mtDNA作為分子標(biāo)記的研究已經(jīng)廣泛展開，進(jìn)化關(guān)系相關(guān)或相近的物種都能得到區(qū)分和鑒定。而線粒體DNA中的細(xì)胞色素b (cytochrome b,cyt b)基因進(jìn)化速度適中，是分析種內(nèi)、種間遺傳多樣性和進(jìn)化關(guān)系的適當(dāng)?shù)腄NA標(biāo)記，通過PCR擴(kuò)增cytb基因片段，再通過測(cè)序進(jìn)行序列進(jìn)化分析，已經(jīng)廣泛用于生物的分類與鑒定研究。限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(restrictionfragment length polymorphism,RFLP)分析技術(shù)是分子生物學(xué)的重要分析方法之一，用于檢測(cè)DNA序列多態(tài)性。而PCR-RFLP是將PCR技術(shù)、RFLP分析與電泳方法聯(lián)合應(yīng)用，先將待測(cè)的靶DNA片段進(jìn)行PCR擴(kuò)增，然后應(yīng)用DNA限制性內(nèi)切酶對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行酶切，最后經(jīng)電泳分析靶DNA片段的酶切圖譜進(jìn)行分型、分類的一種方法，具有簡(jiǎn)便快捷、分辨率高、無需測(cè)序的優(yōu)點(diǎn)，在水產(chǎn)品真?zhèn)舞b定中具有重要的應(yīng)用價(jià)值。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種用于大目、長(zhǎng)鰭、藍(lán)鰭金槍魚生魚片來源魚品種的鑒定方法，針對(duì)目前市場(chǎng)上以長(zhǎng)鰭金槍魚和大目金槍魚生魚片假冒藍(lán)鰭金槍魚生魚片的行為，解決金槍魚生魚片來源魚的品種真?zhèn)坞y以鑒別的問題。本發(fā)明在cyt b基因PCR擴(kuò)增的基礎(chǔ)上，通過大量DNA序列數(shù)據(jù)模擬與實(shí)際樣本分析，確定了上述三種金槍魚cytb基因中的物種特異性酶切位點(diǎn)，從而為大目、長(zhǎng)鰭、藍(lán)鰭三種金槍魚生魚片的鑒別提供了快速準(zhǔn)確的方法。本發(fā)明是通過如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的 一種用于大目、長(zhǎng)鰭、藍(lán)鰭金槍魚生魚片來源魚品種的鑒定方法，包括以下步驟
I)提取金槍魚生魚片DNA ；2)以提取的DNA為模板，以F1/F2為引物，PCR擴(kuò)增cytb基因片段，其中F I 5-CCATCCAACATCTCAGCATGATGAAA-3 ；F2 5-CCCCTCAGAATGATATTTGTCCTCA-3 ；3)純化PCR產(chǎn)物，通過限制性內(nèi)切酶Fok I與Stu I將純化后的PCR產(chǎn)物分別進(jìn)行酶切處理；4)瓊脂糖凝膠電泳分析PCR的酶切產(chǎn)物；進(jìn)一步，所述的PCR反應(yīng)條件為
權(quán)利要求
1.一種大目、長(zhǎng)鰭和藍(lán)鰭金槍魚生魚片的鑒定方法，其特征在于包括以下步驟 1)提取金槍魚生魚片DNA； 2)以提取的DNA為模板，以F1/F2為引物，PCR擴(kuò)增cytb基因片段，其中Fl:5-CCATCCAACATCTCAGCATGATGAAA-3 ；F2 5-CCCCTCAGAATGATATTTGTCCTCA-3 ； 3)純化PCR產(chǎn)物，通過限制性內(nèi)切酶FokI與StuI將純化后的PCR產(chǎn)物分別進(jìn)行酶切處理； 4)瓊脂糖凝膠電泳分析PCR的酶切產(chǎn)物。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于所述的PCR反應(yīng)條件為
3.根據(jù)權(quán)利要求I或2所述的方法，其特征在于所述的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)所用的凝膠濃度為1.5%。
4.根據(jù)權(quán)利要求I或2所述的方法，其特征在于所述的FokI酶切反應(yīng)體系為 PCR 純化產(chǎn)物5. 0-10. OuL FokI LOuL IOX限制性內(nèi)切酶緩沖液2. 0 ii L 、0. I % BSA 2. Oii L ddH20 補(bǔ)足至 20. O ii L 所述的FokI酶切反應(yīng)體系為 PCR 純化產(chǎn)物5. 0-10. OuL StuI LOuL IOX限制性內(nèi)切酶緩沖液2. O i! L ddH20 補(bǔ)足至 20. O ii L 混勻后于37°C孵育I. O 2. O小時(shí)。
全文摘要
一種大目、藍(lán)鰭、和長(zhǎng)鰭金槍魚生魚片的鑒定方法，屬于食品檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，包括以下步驟金槍魚生魚片DNA的提取，以提取DNA為模板，以F1/F2為引物，PCR擴(kuò)增cytb基因片段，電泳檢測(cè)擴(kuò)增片段，純化后將PCR產(chǎn)物用限制性內(nèi)切酶FokI和Stu I進(jìn)行酶切，通過瓊脂糖凝膠電泳分析酶切圖譜對(duì)上述3種金槍魚魚片進(jìn)行原料魚真?zhèn)舞b別。本發(fā)明從分子水平上對(duì)金槍魚生魚片的來源魚品種進(jìn)行鑒定，能夠準(zhǔn)確區(qū)分金槍魚生魚片的來源，對(duì)規(guī)范金槍魚生魚片市場(chǎng)具有重要意義。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK102732630SQ20121022841
公開日2012年10月17日 申請(qǐng)日期2012年7月4日 優(yōu)先權(quán)日2012年7月4日
發(fā)明者姚琳, 宋春麗, 朱文嘉, 李曉慶, 李青嬌, 江艷華, 王聯(lián)珠, 翟毓秀 申請(qǐng)人:中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所