專利名稱：H1n1亞型禽流感病毒rt-lamp可視化檢測試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及HlNl亞型禽流感病毒RT-LAMP可視化檢測試劑盒。
背景技術(shù)：
禽流感(Avian Influenza，Al)是禽流行性感冒的簡稱，是由正粘病毒科流感病毒屬A型禽流感流行性感冒病毒引起的一種禽類(家禽和野禽)傳染病。根據(jù)A型流感病毒表面糖蛋白(Hemagglutinin, HA)和神經(jīng)氨酸酶(Neuraminidase, NA)的抗原性不同，禽流感病毒(AIV)可進一步分為不同的亞型，目前已發(fā)現(xiàn)有16種HA亞型和9種NA亞型。AIV是一種有包膜、單股負鏈、分節(jié)段的RNA病毒，病毒基因組由8個分節(jié)段負鏈RNA組成。AIV基因組的分節(jié)段特性使得兩種或兩種以上不同亞型流感病毒共同感染一個細胞時，子代病毒 在裝配時其核酸片段可能以同源交換的形式發(fā)生基因重排而導(dǎo)致抗原轉(zhuǎn)變，從而產(chǎn)生能引起大流行的新流行株。人類歷史上幾次大流感的流行毒株(H2N2、H3N2)均是禽流感病毒與人流感病毒發(fā)生基因重排而產(chǎn)生，而HlNl亞型AIV傳播給人直接導(dǎo)致了 1918年世界范圍內(nèi)的毀滅性人類大流感流行。當(dāng)前流行的甲型HlNl流感病毒的部分基因也來源于AIV。因此HlNl亞型AIV為低致病性AIV，但具有重要的公共衛(wèi)生學(xué)意義。加強HlNl亞型AIV的檢測和監(jiān)測，對保障人類健康意義重大，而快速簡便特異的檢測技術(shù)有助于HlNl亞型AIV的早期大規(guī)模診斷。目前禽流感病毒常采用的檢測方法包括病毒雞胚分離、酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)、免疫熒光技術(shù)(IFA)、逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)、實時熒光定量RT-PCR(RRT-PCR)、基因芯片(Gene chips)。傳統(tǒng)的病毒雞胚分離方法準(zhǔn)確、簡便，但耗時太長，通常需要兩天到一周的時間；IFA、ELISA快速但需要特殊試劑；RT-PCR、RRT-PCR、Genechips檢測技術(shù)快速、靈敏，但都需要特殊儀器和技術(shù)人員，且成本較高，不適合在基層推廣使用。環(huán)介導(dǎo)等溫擴增技術(shù)(loop-mediatedisothermal amplifi cation, LAMP)是利用一種具有鏈置換活性和瀑布式核酸擴增功能的Bst DNA聚合酶，在等溫條件下進行核酸的變性和自動循環(huán)的鏈置換核酸擴增反應(yīng)，整個反應(yīng)不需要特殊的儀器設(shè)備，僅在水浴鍋中就可完成。LAMP技術(shù)在目的基因保守區(qū)設(shè)計了針對8個特異區(qū)域的6條引物，使擴增反應(yīng)具有很高的特異性。LAMP反應(yīng)結(jié)果的觀察方法非常簡便，反應(yīng)結(jié)束后可通過肉眼在可見光或紫外線下直接觀察反應(yīng)液的顏色變化來判定結(jié)果。由于LAMP反應(yīng)的擴增效率很高，在少量cDNA存在的條件下就可進行核酸的大量擴增，所以只需要在LAMP反應(yīng)體系中加入反轉(zhuǎn)錄酶，通過逆轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)等溫擴增反應(yīng)(RT-LAMP)就可以完成RNA的檢測。RT-LAMP具有簡便、快速、靈敏、特異的優(yōu)勢，尤其適合在基層開展RT-LAMP試劑盒的應(yīng)用推廣。RT-LAMP技術(shù)中，引物是決定檢測結(jié)果靈敏度和特異性的關(guān)鍵因素。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的一個技術(shù)問題是提供一種檢測或輔助檢測HlNl亞型禽流感病毒的環(huán)介導(dǎo)等溫擴增成套引物。本發(fā)明所提供的檢測或輔助檢測HlNl亞型禽流感病毒的環(huán)介導(dǎo)等溫擴增成套引物，由簡并引物FIP-H1、簡并引物BIP-H1、簡并引物F3-H1、簡并引物B3-H1、簡并引物L(fēng)F-H1、簡并引物L(fēng)B-H1、簡并引物FIP-N1、簡并引物BIP-N1、簡并引物F3-N1、簡并引物B3-N1、簡并引物L(fēng)F-Nl和簡并引物L(fēng)B-Nl組成，它們的核苷酸序列分別為序列表中的序列I、序列2、序列3、序列4、序列5、序列6、序列7、序列8、序列9、序列10、序列11和序列12。所述成套引物中，各簡并引物的摩爾比可為1.6レ!1101所述簡并引物？1 -!11、
I.6 μ mol所述簡并引物BIP-H1、0. 2ymol簡并引物F3_H1、0. 2 μ mol簡并引物B3-H1、
0.8 μ mol簡并引物L(fēng)F-H1、0. 8ymol簡并引物L(fēng)B-H1、I. 6 μ mol所述簡并引物FIP-N1、
1.6 μ mol所述簡并引物BIP-N1、0. 2ymol簡并引物F3_N1、0. 2 μ mol簡并引物B3-N1、
0.8 μ mol簡并引物L(fēng)F-Nl和0. 8 μ mol簡并引物L(fēng)B-N1。所述摩爾比是總摩爾數(shù)之比，所述總摩爾數(shù)是簡并引物中各種單鏈DNA摩爾數(shù)之和。本發(fā)明所要解決的另一個技術(shù)問題是提供ー種檢測或輔助檢測HlNl亞型禽流感病毒的逆轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)等溫擴增試劑。本發(fā)明所提供的檢測或輔助檢測HlNl亞型禽流感病毒的逆轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)等溫擴增試劑，包括鏈置換型DNA聚合酶、甜菜堿、dATP、dCTP、dGTP和dTTP、Mg2+、反轉(zhuǎn)錄酶和上述檢測或輔助檢測HlNl亞型禽流感病毒的環(huán)介導(dǎo)等溫擴增成套引物。所述檢測或輔助檢測HlNl亞型禽流感病毒的逆轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)等溫擴增試劑中，包括ニ套獨立包裝的試劑，分別為反應(yīng)試劑A和反應(yīng)試劑B ;所述反應(yīng)試劑A含有I. 6 μ mol所述簡并引物FIP-Hl、I. 6 μ mol所述簡并引物BIP-Hl、0. 2 μ mol所述簡并引物F3-H1、
0.2 μ mo I所述簡并引物B3-H1、0. 8 μ mo I所述簡并引物L(fēng)F-Hl、0. 8 μ mo I所述簡并引物L(fēng)B-Hl、Immol 所述 dATP、Immol 所述 dCTP、Immol 所述 dGTP、Immol 所述 dTTP、6mmol 所述 Mg2+和Immol所述甜菜堿；所述反應(yīng)試劑B含有I. 6 μ mol所述簡并引物FIP-Nl、I. 6 μ mol所述簡并引物ΒΙΡ-Ν1、0· 2μπιο1所述簡并引物F3-N1、0. 2ymol所述簡并引物Β3_Ν1、0· 8 μ mol所述簡并引物L(fēng)F-NUO. 8 μ mol所述簡并引物L(fēng)B-NlUmmol所述dATPUmmoI所述dCTP、lmmol所述dGTP、Immol所述dTTP、6mmol所述Mg2+和Immol所述甜菜喊。所述簡并引物的摩爾數(shù)均是指簡并引物中各種單鏈DNA的摩爾數(shù)之和。所述檢測或輔助檢測HlNl亞型禽流感病毒的逆轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)等溫擴增試劑中，所述鏈置換型DNA聚合酶為Bst DNA聚合酶大片段；所述反轉(zhuǎn)錄酶可為M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶。所述檢測或輔助檢測HlNl亞型禽流感病毒的逆轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)等溫擴增試劑還可包括突光顯色劑。進ー步，所述突光顯色劑可為姆4μ I試劑由I μ I濃度為625 μ mol/L的鈣黃綠素溶液、I μ I濃度為12. 5mmol/L的MnCl2溶液和2 μ I滅菌超純水組成。本發(fā)明所要解決的再一個技術(shù)問題是提供ー種檢測或輔助檢測HlNl亞型禽流感病毒的逆轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)等溫擴增試劑盒。本發(fā)明所提供的檢測或輔助檢測HlNl亞型禽流感病毒的逆轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)等溫擴增試劑盒，包括上述檢測或輔助檢測HlNl亞型禽流感病毒的環(huán)介導(dǎo)等溫擴增成套引物或上述檢測或輔助檢測HlNl亞型禽流感病毒的環(huán)介導(dǎo)等溫擴增試劑。進ー步，所述檢測或輔助檢測HlNl亞型禽流感病毒的環(huán)介導(dǎo)等溫擴增試劑盒還可包括陽性對照和陰性對照。其中，陽性對照可為HlNl亞型禽流感病毒RNA ;陰性對照可為滅菌超純水。另外，上述檢測或輔助檢測HlNl亞型禽流感病毒的環(huán)介導(dǎo)等溫擴增成套引物在制備檢測或輔助檢測HlNl亞型禽流感病毒的逆轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)等溫擴增試劑或試劑盒中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護范圍。上述檢測或輔助檢測HlNl亞型禽流感病毒的環(huán)介導(dǎo)等溫擴增成套引物，或上述檢測或輔助檢測HlNl亞型禽流感病毒的逆轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)等溫擴增試劑，或上述檢測或輔助檢測HlNl亞型禽流感病毒的逆轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)等溫擴增試劑盒均可采用下述I)或2)的方法進行制備I)所述成套引物或所述試劑或試劑盒的制備方法，均包括將所述成套引物中的所述簡并引物FIP-Hl、簡并引物BIP-Hl、簡并引物F3-H1、簡并引物B3-H1、簡并引物L(fēng)F-Hl^并引物L(fēng)B-Hl、簡并引物FIP-Nl、簡并引物BIP-Nl、簡并引物F3-N1、簡并引物B3-N1、簡并引物L(fēng)F-Nl和簡并引物L(fēng)B-Nl分別單獨包裝的步驟；
2)所述成套引物或所述試劑或試劑盒的制備方法，均包括制備如下2個單獨包裝的步驟a)將所述成套引物中的所述簡并引物FIP-H1、簡并引物BIP-H1、簡并引物F3-H1、簡并引物B3-H1、簡并引物L(fēng)F-H1、簡并引物L(fēng)B-Hl按照所述比例混合在一起得到一個單獨包裝；b)將所述成套引物中的所述簡并引物FIP-N1、簡并引物BIP-N1、簡并引物F3-N1、簡并引物B3-N1、簡并引物L(fēng)F-N1、簡并引物L(fēng)B-Nl按照所述比例混合在一起得到另一個單獨包裝。本發(fā)明所要解決的再一個技術(shù)問題是提供一種檢測或輔助檢測NI亞型禽流感病毒的環(huán)介導(dǎo)等溫擴增成套引物。本發(fā)明所提供的檢測或輔助檢測NI亞型禽流感病毒的環(huán)介導(dǎo)等溫擴增成套引物由簡并引物FIP-N1、簡并引物BIP-N1、簡并引物F3-N1、簡并引物B3-N1、簡并引物L(fēng)F-Nl和簡并引物L(fēng)B-Nl組成，它們的核苷酸序列分別為序列表中的序列7、序列8、序列9、序列10、序列11和序列12。所述成套引物中，各簡并引物的摩爾比可為^!!!!!(^所述簡并引物？^-^、
I.6 u mo I所述簡并引物BIP-NUO. 2iimol簡并引物F3_N1、0. 2 y mol簡并引物B3-N1、
0.8 u mo I簡并引物L(fēng)F-Nl和0.8iimol簡并引物L(fēng)B-N1。所述摩爾比是總摩爾數(shù)之比，所述總摩爾數(shù)是簡并引物中各種單鏈DNA摩爾數(shù)之和。本發(fā)明所要解決的另一個技術(shù)問題是提供一種檢測或輔助檢測NI亞型禽流感病毒的逆轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)等溫擴增試劑。本發(fā)明所提供的檢測或輔助檢測NI亞型禽流感病毒的逆轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)等溫擴增試齊U，包括鏈置換型DNA聚合酶、甜菜堿、dATP、dCTP、dGTP和dTTP、Mg2+、反轉(zhuǎn)錄酶和上述檢測或輔助檢測NI亞型禽流感病毒的環(huán)介導(dǎo)等溫擴增成套引物。所述檢測或輔助檢測NI亞型禽流感病毒的逆轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)等溫擴增試劑中，所述簡并引物FIP-Nl、簡并引物BIP-Nl、簡并引物F3-N1、簡并引物B3-N1、簡并引物L(fēng)F-Nl和簡并引物L(fēng)B-N1、所述dATP、dCTP、dGTP、dTTP、所述Mg2+、所述鏈置換型DNA聚合酶和所述甜菜堿在所述擴增試劑中的配比可為I. 6 μ mol所述簡并引物FIP-N1U. 6μπι01所述簡并引物BIP-NU0. 2ymol所述簡并引物F3_N1、0. 2 μ mol所述簡并引物Β3_Ν1、0· 8 μ mol所述簡并引物 LF-Nl、0. 8 μ mol 所述簡并引物 LB-Nl、Immol 所述 dATP、lmmol 所述 dCTP、lmmol 所述dGTP、Immol所述dTTP、6mmol所述Mg2+和Immol所述甜菜喊。所述簡并引物的摩爾數(shù)均是指簡并引物中各種單鏈DNA的摩爾數(shù)之和。所述檢測或輔助檢測NI亞型禽流感病毒的逆轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)等溫擴增試劑中，所述鏈置換型DNA聚合酶為Bst DNA聚合酶大片段；所述反轉(zhuǎn)錄酶可為M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶。所述檢測或輔助檢測NI亞型禽流感病毒的逆轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)等溫擴增試劑還可包括熒光顯色劑。進ー步，所述熒光顯色劑可為每4μ I試劑由1μ I濃度為625 μ mol/L鈣黃綠素溶液、I μ I濃度為12. 5mmol/L MnCl2溶液和2 μ I滅菌超純水組成。本發(fā)明所要解決的再一個技術(shù)問題是提供ー種檢測或輔助檢測NI亞型禽流感病毒的逆轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)等溫擴增試劑盒。本發(fā)明所提供的檢測或輔助檢測NI亞型禽流感病毒的逆轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)等溫擴增試劑盒，包括上述檢測或輔助檢測NI亞型禽流感病毒的環(huán)介導(dǎo)等溫擴增成套引物或上述檢測或輔助檢測NI亞型禽流感病毒的逆轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)等溫擴增試劑。進ー步，所述檢測或輔助檢測NI亞型禽流感病毒的逆轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)等溫擴增試劑盒還可包括陽性對照和陰性對照。其中，陽性對照可為HlNl亞型禽流感病毒RNA ;陰性對照可為滅菌超純水。另外，上述檢測或輔助檢測NI亞型禽流感病毒的環(huán)介導(dǎo)等溫擴增成套引物在制備檢測或輔助檢測HlNl亞型禽流感病毒或NI亞型禽流感病毒的逆轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)等溫擴增試劑或試劑盒中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護范圍。其中，所述檢測或輔助檢測HlNl亞型禽流感病毒或NI亞型禽流感病毒的逆轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)等溫擴增試劑或試劑盒具體可為上述檢測或輔助檢測HlNl亞型禽流感病毒的逆轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)等溫擴增試劑或試劑盒，或為上述檢測或輔助檢測NI亞型禽流感病毒的逆轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)等溫擴增試劑或試劑盒。上述檢測或輔助檢測NI亞型禽流感病毒的環(huán)介導(dǎo)等溫擴增成套引物和上述檢測或輔助檢測NI亞型禽流感病毒的逆轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)等溫擴增試劑和檢測或輔助檢測NI亞型禽流感病毒的逆轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)等溫擴增試劑盒中，所述簡并引物FIP-N1、簡并引物ΒΙΡ-Ν1、簡并引物F3-N1、簡并引物Β3-Ν1、簡并引物L(fēng)F-Nl和簡并引物L(fēng)B-Nl可分別單獨包裝或按照所述比例混合在一起。上述NI亞型禽流感病毒具體可為HlNl亞型禽流感病毒。本發(fā)明通過比較分析大量的Hl亞型AIV-HA基因序列、NI亞型AIV-NA基因序列，設(shè)計了 6對特異性引物，TRIZOL法或用RNA提取試劑盒提取感染家禽喉氣管、泄殖腔棉拭子及組織樣品的總RNA，在反轉(zhuǎn)錄酶和Bst DNA聚合酶作用下，于水浴鍋63°C反應(yīng)45分鐘，一步法進行反轉(zhuǎn)錄和環(huán)介導(dǎo)等溫擴增，80°C作用5min終止反應(yīng)。本發(fā)明在反應(yīng)前向反應(yīng)試劑中添加入熒光試劑(Calcein和MnCl2的混合液)，反應(yīng)結(jié)束后可直接通過肉眼在可見光或365nm波長紫外線照射下觀察反應(yīng)液的顏色變化來判定結(jié)果，實現(xiàn)了 RT-LAMP反應(yīng)結(jié)果的可視化觀察同時也避免了打開反應(yīng)管蓋后引起環(huán)境污染而造成下次實驗的假陽性結(jié)果。 反應(yīng)開始之前鈣黃綠素(Calcein)與熒光淬滅劑錳離子結(jié)合而不發(fā)熒光，反應(yīng)液為淺桔色。隨著反應(yīng)的擴增，產(chǎn)生大量的焦磷酸根離子，而焦磷酸根離子更易與錳離子結(jié)合從而釋放了鈣黃綠素。游離的鈣黃綠素就可自發(fā)熒光，鎂離子還可以加強這種熒光效果，陽性反應(yīng)液肉眼可見顏色變綠，在紫外線照射下可激發(fā)綠色熒光。實驗證明，本發(fā)明的檢測或輔助檢測NI亞型禽流感病毒、或HlNl亞型禽流感病毒的環(huán)介導(dǎo)等溫擴增成套引物、試劑和試劑盒可特異性地檢測NI亞型或HlNl亞型禽流感病毒，而對其它亞型禽流感病毒和呼吸道病原體無交叉反應(yīng)，針對Hl亞型禽流感病毒HA基因的RT-LAMP方法最少可以檢測到IOfg的禽流感病毒總RNA，靈敏度是常規(guī)RT-PCR方法的1000倍，針對HlNl亞型禽流感病毒NA基因的RT-LAMP方法最少可以檢測到IOOfg的禽流感病毒總RNA，靈敏度是常規(guī)RT-PCR方法的100倍。RT-LAMP方法對臨床樣品的檢出率與經(jīng)典的雞胚分離方法一致，但略高于常規(guī)RT-PCR方法。本發(fā)明特異性強、靈敏度高、儀器設(shè)備及操作簡單、結(jié)果便于觀察，尤其適合在基層獸醫(yī)站、養(yǎng)殖場及邊境口岸進行Hl亞型和HlNl禽流感病毒的快速診斷和早期篩查。



圖I為RT-LAMP和RT-PCR方法檢測Hl亞型AIV-HA基因的靈敏度比較。圖中，M:100bp DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)；其它從左至右分別為加入AIV總RNA含量為lng/2 u 1,100pg/2 u 1,10pg/2 u I, lpg/2 u I, IOOfg/2 u I, IOfg/2 u I 和 lfg/2 u I 的管、陰性對照(NC)。其中A圖為可見光下RT-LAMP反應(yīng)結(jié)果，B圖為365nm波長紫外線照射下RT-LAMP反應(yīng)結(jié)果，C圖為RT-PCR的1%瓊脂糖凝膠電泳圖。 圖2為RT-LAMP和RT-PCR方法檢測HlNl亞型AIV-NA基因的靈敏度比較。圖中，M:100bp DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)；其它從左至右分別為加入AIV總RNA含量為lng/2 u I、100pg/2 u I、10pg/2 u I、lpg/2 u I、100fg/2 u I、10fg/2 u I 和 lfg/2 u I 的 AIV 總RNA的管、陰性對照(NC)。其中A圖為可見光下RT-LAMP反應(yīng)結(jié)果，B圖為365nm波長紫外線照射下RT-LAMP反應(yīng)結(jié)果，C圖為RT-PCR的1%瓊脂糖凝膠電泳圖。圖3為檢測HlNl亞型AIV-HA基因的RT-LAMP引物在模板基因(A/Duck/Guangxi/030D/2009 (HlNl) HA 基因)的具體位置。其中 Flc-HU LF-HU B2-H1、B3-H1 引物序列與模板基因序列反向互補。FIP-Hl引物由Flc-Hl和F2-H1引物組成，BIP-Hl引物由Blc-Hl和B2-H1引物組成。圖4為檢測HlNl亞型AIV-NA基因的RT-LAMP引物在模板基因(A/Duck/Guangxi/030D/2009 (HlNl) NA 基因)的具體位置。其中 Flc-NU LF-NU B2-N1、B3-N1 引物序列與模板基因序列反向互補。FIP-Nl引物由Flc-Nl和F2-N1引物組成，BIP-Nl引物由Blc-Nl和B2-N1引物組成。
具體實施例方式下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中的毒株或毒株核酸樣品公眾均可從廣西壯族自治區(qū)獸醫(yī)研究所獲得，除A/Duck/Guangxi/D/2011(H1N2)記載在GenBank外(登錄號JQ904458,在該登錄號中的名稱為A/duck/Guangxi/D/2011 (H1N2),其它均記載在如下文獻中Yi Peng, et al. Visual detectionof H3 subtype avian influenza viruses by reverse transcription loop-mediatedisothermal amplification assay. Virology Journal, 2011，8:337。實施例I、成套引物本實施例的檢測或輔助檢測HlNl亞型禽流感病毒的環(huán)介導(dǎo)等溫擴增成套引物，由檢測或輔助檢測Hl亞型禽流感病毒的環(huán)介導(dǎo)等溫擴增成套引物和檢測或輔助檢測NI亞型禽流感病毒的環(huán)介導(dǎo)等溫擴增成套引物組成。其中，檢測或輔助檢測Hl亞型禽流感病毒的環(huán)介導(dǎo)等溫擴增成套引物，由簡并引物FIP-H1、簡并引物BIP-H1、簡并引物F3-H1、簡并引物B3-H1、簡并引物L(fēng)F-Hl和簡并引物L(fēng)B-Hl組成，它們的核苷酸序列分別為序列表中的序列I、序列2、序列3、序列4、序列5和序列6 (表I)。其中，F(xiàn)3-H1和B3-H1為外引物，F(xiàn)IP-Hl和BIP-Hl為內(nèi)引物，LF-Hl和LB-Hl為環(huán)引物。各引物在HlNl亞型禽流感病毒A/Duck/Guangxi/030D/2009 (HlNl) HA 基因中的位置見圖 3。檢測或輔助檢測NI亞型禽流感病毒的環(huán)介導(dǎo)等溫擴增成套引物，由簡并引物FIP-N1、簡并引物BIP-N1、簡并引物F3-N1、簡并引物B3-N1、簡并引物L(fēng)F-Nl和簡并引物L(fēng)B-Nl組成，它們的核苷酸序列分別為序列表 中的序列7、序列8、序列9、序列10、序列11和序列12 (表I)。其中，F(xiàn)3-N1和B3-N1為外引物，F(xiàn)IP-Nl和BIP-Nl為內(nèi)引物，LF-Nl和LB-Nl為環(huán)引物。各引物在HlNl亞型禽流感病毒A/Duck/Guangxi/030D/2009(H1N1)NA基因中的具體位置見圖4。表IRT-LAMP引物序列
權(quán)利要求
1.檢測或輔助檢測H1N1亞型禽流感病毒的環(huán)介導(dǎo)等溫擴增成套引物，由簡并引物 FIP-H1、簡并引物BIP-H1、簡并引物F3-H1、簡并引物B3-H1、簡并引物L(fēng)F-H1、簡并引物 LB-H1、簡并引物FIP-N1、簡并引物BIP-N1、簡并引物F3-N1、簡并引物B3-N1、簡并引物 LF-N1和簡并引物L(fēng)B-N1組成，它們的核苷酸序列分別為序列表中的序列1、序列2、序列3、 序列4、序列5、序列6、序列7、序列8、序列9、序列10、序列11和序列12。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的成套引物，其特征在于所述成套引物中，各簡并引物的 摩爾比為1.6umol所述簡并引物FIP-Hl、1.6iimol所述簡并引物BIP_H1、0. 2 y mol簡 并引物F3-H1、0. 2iimol簡并引物B3_H1、0. 8 y mol簡并引物L(fēng)F_H1、0. 8 y mol簡并引物 LB-H1、L 6iimol所述簡并引物FIP-NUl. 6iimol所述簡并引物BIP-N1、0. 2iimol簡并引物 F3-NU0. 2umol 簡并引物 B3-NU0. 8umol 簡并引物 LF-N1 和 0. 8umol 簡并引物 LB-N1。
3.檢測或輔助檢測H1N1亞型禽流感病毒的逆轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)等溫擴增試劑或試劑盒，其 特征在于所述試劑或試劑盒均包括甜菜堿、dATP、dCTP、dGTP和dTTP、Mg2+和權(quán)利要求1 或2所述的成套引物。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的試劑或試劑盒，其特征在于所述試劑或試劑盒中包括二套 獨立包裝的試劑，分別為反應(yīng)試劑A和反應(yīng)試劑B ；所述反應(yīng)試劑A含有1. 6 ii mol所述簡并引物FIP-H1、1. 6 ii mol所述簡并引物BIP-H1、 0. 2 y mo 1所述簡并引物F3-H1、0. 2 y mo 1所述簡并引物B3-H1、0. 8 y mo 1所述簡并引物 LF-HK0. 8 u mol 所述簡并引物 LB-H1、lmmol 所述 dATP、lmmol 所述 dCTP、lmmol 所述 dGTP、 lmmol所述dTTP、6mmol所述Mg2+和lmmol所述甜菜喊；所述反應(yīng)試劑8含有1.61111101所述簡并引物？1 41、1.61111101所述簡并引物81 41、 0. 2 u mol所述簡并引物F3-N1、0. 2 nmol所述簡并引物B3_N1、0. 8 u mol所述簡并引物 LF-NK0. 8 u mol 所述簡并引物 LB-N1、lmmol 所述 dATP、lmmol 所述 dCTP、lmmol 所述 dGTP、 lmmol所述dTTP、6mmol所述Mg2+和lmmol所述甜菜喊。
5.權(quán)利要求1或2所述成套引物在制備檢測或輔助檢測H1N1亞型禽流感病毒的環(huán)介 導(dǎo)等溫擴增試劑或試劑盒中的應(yīng)用；進一步，所述檢測或輔助檢測H1N1亞型禽流感病毒的 環(huán)介導(dǎo)等溫擴增試劑或試劑盒具體可為權(quán)利要求3或4所述的試劑或試劑盒。
6.權(quán)利要求1或2所述成套引物、權(quán)利要求3或4所述的試劑或試劑盒的制備方法為 下述1)或2).1)權(quán)利要求1或2所述成套引物或權(quán)利要求3或4所述的試劑或試劑盒的制備方法， 均包括將權(quán)利要求1或2所述成套引物中的所述簡并引物FIP-H1、簡并引物BIP-H1、簡并 引物F3-H1、簡并引物B3-H1、簡并引物L(fēng)F-H1、簡并引物L(fēng)B-H1、簡并引物FIP-N1、簡并引物 BIP-N1、簡并引物F3-N1、簡并引物B3-N1、簡并引物L(fēng)F-N1和簡并引物L(fēng)B-N1分別單獨包裝 的步驟；.2)權(quán)利要求1或2所述成套引物或權(quán)利要求3或4所述的試劑或試劑盒的制備方法， 均包括制備如下2個單獨包裝的步驟a)將權(quán)利要求1或2所述成套引物中的所述簡并引物FIP-H1、簡并引物BIP-H1、簡并 引物F3-H1、簡并引物B3-H1、簡并引物L(fēng)F-H1、簡并引物L(fēng)B-H1按照所述比例混合在一起得 到一個單獨包裝；b)將權(quán)利要求1或2所述成套引物中的所述簡并引物FIP-N1、簡并引物BIP-N1、簡并引物F3-N1、簡并引物B3-N1、簡并引物L(fēng)F-N1、簡并引物L(fēng)B-N1按照所述比例混合在一起得 到另一個單獨包裝。
7.檢測或輔助檢測N1亞型禽流感病毒的環(huán)介導(dǎo)等溫擴增成套引物，由簡并引物 FIP-N1、簡并引物BIP-N1、簡并引物F3-N1、簡并引物B3-N1、簡并引物L(fēng)F-N1和簡并引物 LB-N1組成，它們的核苷酸序列分別為序列表中的序列7、序列8、序列9、序列10、序列11和 序列12。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的成套引物，其特征在于所述成套引物中，各簡并引物的摩爾 比為1.6u mol所述簡并引物FIP-N1U. 6 u mol所述簡并引物BIP-NU0. 2 u mol簡并引物 F3-NU0. 2umol 簡并引物 B3_N1、0. 8 y mol 簡并引物 LF-N1 和 0. 8umol 簡并引物 LB-N1。
9.檢測或輔助檢測N1亞型禽流感病毒的逆轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)等溫擴增試劑或試劑盒，其特 征在于所述試劑或試劑盒均包括鏈置換型DNA聚合酶、甜菜堿、dATP、dCTP、dGTP和dTTP、 Mg2+、反轉(zhuǎn)錄酶和權(quán)利要求7或8所述的成套引物。
10.權(quán)利要求7或8所述成套引物在制備檢測或輔助檢測H1N1亞型禽流感病毒或N1 亞型禽流感病毒的環(huán)介導(dǎo)等溫擴增試劑或試劑盒中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種H1N1亞型禽流感病毒RT-LAMP可視化檢測試劑盒。該試劑盒包括檢測或輔助檢測H1亞型和N1亞型禽流感病毒的環(huán)介導(dǎo)等溫擴增成套引物，該成套引物由簡并引物FIP-H1、簡并引物BIP-H1、簡并引物F3-H1、簡并引物B3-H1、簡并引物L(fēng)F-H1、簡并引物L(fēng)B-H1、簡并引物FIP-N1、簡并引物BIP-N1、簡并引物F3-N1、簡并引物B3-N1、簡并引物L(fēng)F-N1和簡并引物L(fēng)B-N1組成，它們的核苷酸序列分別為序列表中的序列1、序列2、序列3、序列4、序列5、序列6、序列7、序列8、序列9、序列10、序列11和序列12。本發(fā)明特異性強、靈敏度高、儀器設(shè)備及操作簡單、結(jié)果便于觀察，尤其適合在基層獸醫(yī)站、養(yǎng)殖場及邊境口岸進行H1亞型和H1N1亞型禽流感病毒的快速診斷和早期篩查。
文檔編號C12R1/93GK102649984SQ20121014756
公開日2012年8月29日 申請日期2012年5月14日 優(yōu)先權(quán)日2012年5月14日
發(fā)明者劉加波, 龐耀珊, 彭宜, 范晴, 謝麗基, 謝志勤, 謝芝勛, 鄧顯文 申請人:廣西壯族自治區(qū)獸醫(yī)研究所