專利名稱：麻疹病毒和風疹病毒的特異性檢測用引物探針組合和試劑盒的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種采用熒光PCR技術，特異性檢測樣品中麻疹病毒和風疹病毒核酸存在的寡核苷酸序列組合，以及包括該組合的試劑盒。
背景技術：
麻疹是由麻疹病毒引起的全身發(fā)疹性急性呼吸道傳染病，傳染性強，易引起暴發(fā)流行，是危害兒童生命健康及其嚴重的傳染病之一。在疫苗可預防的疾病中，麻疹仍然是死亡例數(shù)最多的病種。WHO已將麻疹列為無脊灰地區(qū)下一個消除的疾病，WHO西太平洋地區(qū)所有成員國承諾2012年消除麻疹，我國衛(wèi)生部組織制定了《2006-2012年全國消除麻疹行動計劃》。近年來隨著計劃免疫工作的開展，在麻疹減毒活疫苗普遍應用后，不但存在癥狀典型的麻疹，還存在癥狀不典型的病人，后者需根據(jù)實驗室檢測做出診斷。風疹是由風疹病毒引起的急性呼吸道傳染病，可引起風疹和先天性風疹綜合癥(CRS)。風疹是干擾麻疹診斷的重要因素。有數(shù)據(jù)顯示，在麻疹陰性標本中風疹所占的比例超過了 40%。麻疹、風疹一年四季均可發(fā)生，但以冬末春初為多。自20世紀60年代麻疹疫苗及后來風疹疫苗使用以來，麻疹、風疹的流行規(guī)律發(fā)生了很大的變化，發(fā)病年齡后移，癥狀輕微或不典型，易與其它發(fā)熱出疹性疾病混淆，因此實驗室診斷成為科學鑒別麻疹、風疹的重要手段。麻疹、風疹都有很強的傳染性，為了有效的保護患者和易感人群。應做到早發(fā)現(xiàn)、早隔離、早診斷、早治療。這使麻疹與風疹的檢測方法顯得尤為重要。由于傳統(tǒng)的麻疹和風疹檢測方法如血清抗體ELISA法和細胞培養(yǎng)法，用于快速診斷低滴度病毒攜帶者存在一些缺陷。ELISA法檢測敏感度低，假陰性高，細胞培養(yǎng)費時費力，不利于快速檢測，并且涉及活病毒的培養(yǎng)，對于操作人員來說具備一定的危險性。近年來針對病毒核酸序列的PCR反應快速檢測技術開始出現(xiàn)。對于PCR檢測來說，引物的選擇至關重要，直接影響檢測的特異性。如果引物特異性不夠，則可能導致檢測的假陽性結果或者假陰性結果的出現(xiàn)。另外，我們針對病毒特異的靶序列設計Taqman探針，用于檢測病毒時很大程度上保證了結果的特異性。

發(fā)明內(nèi)容
為了更加準確地檢測樣品麻疹病毒和風疹病毒核酸存在，本發(fā)明提供一種特異性檢測樣品中麻疹病毒和風疹病毒的寡核苷酸序列組合和包含該組合的試劑盒，其特征在于序列組合或試劑盒的PCR反應液中用于核酸擴增的引物為Pl 5'-GAAAGGTCAGTTCCACATTGGC-3',P2 5'-AACCGCTCTACTGATCCTGTCC-3'，P3 5'-CGCCGCACGGACAACT-3'，P4:5'-CTGATTGCCGGTGTAATTCATAAT-3'。
引物的序列可分別向5'和3'端方向延伸5個核苷酸。Pl和P2為針對麻疹病毒基因組特異性序列設計并經(jīng)預實驗篩選出的特異性引物，P3和P4為針對風疹病毒基因組特異性序列設計并經(jīng)預實驗篩選出的特異性引物。本發(fā)明的特征還在于，序列組合或試劑盒的PCR反應液中用于熒光信號監(jiān)測的寡核苷酸探針為Probel 5' -XfGGATGCAAGGCTTGTTTCAGAGATTGC-YfS'，Probe2 :5' -X2-GAGGTCCAGGTCCCGCCCGAC_Y2-3'。X1和X2為熒光報告基團，Y1和Y2為熒光淬滅基團。Probel為針對麻疹病毒基因組特異性序列設計并經(jīng)預實驗篩選出的特異性探針，Probe2為針對風疹病毒基因組特異性序列設計并經(jīng)預實驗篩選出的特異性探針。本發(fā)明的特征還在于，試劑盒包括PCR反應液、酶混合液、陰性質(zhì)控品和陽性質(zhì)控品。其中PCR反應液主要含有上述的引物和探針、反應緩沖液、Mg2+和dNTP等，酶混合液主要含有熱啟動Taq酶和逆轉錄酶M-MLV，陰性質(zhì)控品為去離子水，陽性質(zhì)控品為含有檢測靶序列的核酸。本發(fā)明的一優(yōu)選實施方案為序列組合或試劑盒的PCR反應液中用于突光信號監(jiān)測的寡核苷酸探針的熒光基團分，其中Probel熒光報告基團X1為Fam，熒光淬滅基團Y1為Eclipse, Probe2熒光報告基團X2為Hex，熒光淬滅基團Y2為Eclipse。本發(fā)明的另一優(yōu)選實施方案為試劑盒的包含上述兩對特異性引物和兩條特異性探針，屬于實時熒光雙重PCR檢測，可在同一個反應體系中對麻疹病毒和風疹病毒核酸進行檢測和鑒別。本發(fā)明的另一優(yōu)選實施方案為試劑盒的PCR反應循環(huán)參數(shù)為42°C，IOmin ；95°C,IOsec ;進入循環(huán)階段95°C變性5s，60°C退火延伸lmin，共反應40個循環(huán)。本發(fā)明的另一優(yōu)選實施方案，試劑盒選用的PCR反應體系為20 iil，包括2 X PCR緩沖液 IOii l、10mmol/L dNTP l.Ou 1,25 u mo 1/L 引物各0. 5 y I、10 y mol/L探針各0. 2 y I、逆轉錄酶和熱啟動Taq酶混合液0. 8 ill、樣品DNA 2 U I，加滅菌水至終體系20 yl。本發(fā)明提供的試劑盒對麻疹病毒核酸的檢測下限為20個拷貝每反應體系；對風疹病毒核酸的檢測下限均為20個拷貝每反應體系。本發(fā)明分別根據(jù)麻疹病毒或風疹病毒基因組保守區(qū)分別設計特異性引物和探針，提供的試劑盒可以檢出麻疹病毒或風疹病毒的核酸，但不能檢出非麻疹病毒或風疹病毒病原體的核酸，說明試劑盒具有很好的特異性。本發(fā)明提供的試劑盒3小時內(nèi)即可完成檢測，雙重檢測可節(jié)省50%的檢測費用，可為麻疹病毒或風疹病毒的疾病監(jiān)測和臨床診斷提供實驗依據(jù)。



圖I為雙重實時熒光PCR檢測麻疹病毒核酸靈敏度的擴增曲線圖。從左至右的4條曲線分別為麻疹病毒體外轉錄RNA梯度稀釋(IO4-IO1)后擴增結果。橫坐標為反應循環(huán)數(shù)，縱坐標為不同循環(huán)數(shù)熒光檢測信號的ARn值。圖2為雙重實時熒光PCR檢測風疹病毒核酸靈敏度的擴增曲線圖。從左至右的4條曲線分別為風疹病毒體外轉錄RNA梯度稀釋(IO4-IO1)后擴增結果。橫坐標為反應循環(huán)數(shù)，縱坐標為不同循環(huán)數(shù)熒光檢測信號的ARn值。圖3為實時熒光雙重PCR檢測體系對麻疹病毒和風疹病毒核酸檢測特異性擴增曲線圖。麻疹病毒和風疹病毒均出現(xiàn)S型擴增曲線，而其他病原微生物質(zhì)控毒株均未出現(xiàn)S型擴增曲線。橫坐標為反應循環(huán)數(shù)，縱坐標為不同循環(huán)數(shù)熒光檢測信號的ARn值。
具體實施例方式下面結合具體實施例詳細說明本發(fā)明的優(yōu)選實施方式。需要指出的是，這里列出的實施例僅僅為示例性說明的目的，而不應將其解釋為對本發(fā)明范圍的任何限制。其中使用的試劑盒、緩沖液等試劑僅僅為該具體實施例中具體選擇的試劑，應理解，本領域技術人員可根據(jù)需要選擇其他公司的相應試劑以實現(xiàn)本發(fā)明的目的。I、引物和TaqMan探針的設計與合成利用Blast工具對Genbank和國內(nèi)外文獻中的所有的麻疹病毒和風疹病毒基因組序列進行分析，分別選擇其穩(wěn)定的保守區(qū)域作為檢測靶序列，并針對這兩個檢測靶序列設計和合成多套引物和探針(見表I)。引物和探針均由日本TaKaRa大連寶生物公司合成，其中麻疹病毒的檢測探針5’端標記FAM熒光基團，3’端標記Eclipse熒光淬滅基團，風疹病毒的檢測探針5’端標記Hex突光基團,3’端標記Eclipse突光淬滅基團。2、檢測菌種的準備本實施例中所使用的麻疹病毒、風疹病毒以及其他陰性對照質(zhì)控毒株(鼻病毒、甲型流感病毒、乙型流感病毒、人偏肺病毒、呼吸道合胞病毒、腮腺炎病毒、人副流感病毒)均由朝陽醫(yī)院檢驗科惠贈。。3、菌株DNA的抽提選用Qiagen 公司 QIAamp Viral RNA Mini Kit (貨號52906)提取病毒 RNA。具體步驟試劑盒參考操作說明書。4、引物和探針的篩選采用設計的多套引物和探針分別檢測提取的麻疹病毒、風疹病毒和陰性對照質(zhì)控毒株的核酸，經(jīng)反復實驗，篩選出靈敏度、特異性和重復性最佳的引物探針組合。(見序列表，麻疹病毒正向引物pl、反向引物P2和探針probl ;風疹病毒正向引物P 3、反向引物p4和探針probe2)5、標準品的構建與制備分別利用pi、p2和p 3、p4引物，RT-PCR擴增麻疹病毒與風疹病毒特異性基因片段，回收PCR產(chǎn)物，并克隆至含有17啟動子序列的質(zhì)粒GBpGEM-Teasy vector)，使用大連寶生物公司的RNA Polymerase，合成RNA，加入無RNA酶的胰DNA酶I以終止體外轉錄反應，通過用酚氯仿抽提純化RNA。利用紫外可見分光光度計分別測定在波長260nm處、280nm處的吸光率，然后計算RNA濃度與純度，然后10倍梯度稀釋至10個拷貝每微升。6、反應條件優(yōu)化對引物、探針、酶等要素逐一優(yōu)化，確定的反應體系為2XPCR緩沖液10iU、IOmmoI/L dNTP I. 0 y 1、25 y mol/L 引物各 0. 5 y I、10 y mol/L 探針各 0. 2 y l、Takara 逆轉錄酶和DNA聚合酶混合物0. 8 ii I、模板2ul，加滅菌水至終體系20 yl。根據(jù)擴增片段長、引物和探針的退火溫度以及酶的特性，主要對反應退火溫度和延伸時間進行了優(yōu)化，最終確定的循環(huán)參數(shù)為逆轉錄42°C，IOmin ；95°C, IOsec ;進入循環(huán)階段95°C變性5s，60°C退火延伸lmin，共反應40個循環(huán)。每個循環(huán)在退火及延伸階段采
集突光信號。在擴增結束后按同一條件分析數(shù)據(jù)，確定各樣品的Ct值。7、檢測限的評價取體外轉錄RNA標準品，進行10倍梯度稀釋，每個反應體系加入2X104至2X101拷貝的模板，評價了雙重實時熒光PCR檢測體系的檢測敏感性。本發(fā)明提供 的試劑盒對麻疹病毒核酸的檢測下限為20個拷貝每反應體系；對風疹病毒核酸的檢測下限均為20個拷貝每反應體系。8、檢測特異性的評價以上述2中的菌株DNA為模板評價了本試劑盒的特異性。對麻疹病毒和風疹病毒核酸進行檢測時均可見明確的擴增曲線，對上述7種其他咽部常見病原微生物檢測時，未產(chǎn)生陽性擴增曲線，說明我們使用的探針和引物與我們選定的其他毒株之間不存在交叉反應。盡管上文中以優(yōu)選的方式，通過具體實施例示例性說明了本發(fā)明的某些實施方式，但是本領域技術人員應了解，本發(fā)明并不限于上面所公開的實施方式，而是可以根據(jù)本發(fā)明所屬技術領域的知識對其進行修改，所作修改不會超出本發(fā)明要求保護的范圍。例如，本發(fā)明所使用的熒光實時PCR也可以根據(jù)需要采用說明書中所列出的實施例中指出的熒光基團和熒光淬滅基團以外的標記物質(zhì)，如Tet、FAM、HEX、TAMRA, ROX, Cy3、TxRd、JOE等標記物；或使用Taqman技術之外的其他標記體系,例如MGB探針、分子信標MB探針、蝎形探針、熒光雙雜交探針等熒光探針標記技術；或使用染料嵌合法如SYBR Green I等不飽和染料與LC Green等飽和染料，只要其使用了本發(fā)明所述的特異性引物序列，即可定性或定量檢測目的基因的存在，進而特異性地檢測麻疹病毒和風疹病毒的存在。所以，這些本領域技術人員所了解的改變和慣用手段的替換也落入本發(fā)明的保護范圍內(nèi)。本發(fā)明的保護范圍應由所附的權利要求書所限定。
權利要求
1.一種用于特異性檢測樣品中麻疹病毒和風疹病毒核酸的引物組合，這套序列組合特征在于包括下列引物Pl 5'-GAAAGGTCAGTTCCACATTGGC-3'，P2 5'-AACCGCTCTACTGATCCTGTCC-3',P3 5'-CGCCGCACGGACAACT-3'，P4 5'-CTGATTGCCGGTGTAATTCATAAT-3'。
2.一種用于特異性檢測樣品中麻疹病毒和風疹病毒核酸的引物和寡核苷酸探針組合，其中引物為權利要求I所述的引物，寡核苷酸探針為Probel :5'-XfGGATGCAAGGCTTGTTTCAGAGATTGC-YfS'，Probe2 5' -X2-GAGGTCCAGGTCCCGCCCGAC-Y2-3'。
X1和X2為熒光報告基團，Y1和Y2為熒光淬滅基團。
3.如權利要求2所述，這套序列組合特征還在于，其中Probel熒光報告基團X1為Fam，熒光淬滅基團Y1為Eclipse，Probe2熒光報告基團X2為Hex，熒光淬滅基團Y2為Eclipse。
4.如權利要求2所述，這套序列組合特征還在于，可用于雙重實時熒光聚合酶鏈反應檢測，即一個反應體系可同時檢測和鑒別麻疹病毒和風疹病毒核酸。
5.一種用于特異性檢測樣品中麻疹病毒和風疹病毒核酸的試劑盒，其中包括PCR反應液、酶混合液、陰性質(zhì)控品和陽性質(zhì)控品。其特征在于PCR反應液中用于核酸擴增反應的引物序列如下Pl 5'-GAAAGGTCAGTTCCACATTGGC-3'，P2 5'-AACCGCTCTACTGATCCTGTCC-3',P3 5'-CGCCGCACGGACAACT-3'，P4 5'-CTGATTGCCGGTGTAATTCATAAT-3'。
6.如權利要求5所述的試劑盒,其特征在于PCR反應液中用于突光信號監(jiān)測的寡核苷酸探針的序列如下Probel :5'-XfGGATGCAAGGCTTGTTTCAGAGATTGC-YfS'，Probe2 5' -X2-GAGGTCCAGGTCCCGCCCGAC-Y2-3'。
X1和X2為熒光報告基團，Y1和Y2為熒光淬滅基團。
7.如權利要求5所述的的試劑盒，其特征還在于PCR反應液中用于熒光信號監(jiān)測的寡核苷酸探針其中Probel熒光報告基團X1為Fam，熒光淬滅基團Y1為Eclipse，Probe2熒光報告基團X2為Hex，熒光淬滅基團Y2為Eclipse。
8.如權利要求5所述的的試劑盒，其特征還在于PCR反應體系為20μ 1，包括2XPCR緩沖液 10 μ lUOmmol/L dNTP I. O μ l、25ymol/L 引物各 0. 5 μ I、10 μ mol/L 探針各 O. 2 μ I、逆轉錄酶和熱啟動Taq酶混合液O. 8 μ I、樣品DNA 2 U I，加滅菌水至終體系20 μ I。
9.如權利要求5所述的的試劑盒，其特征還在于PCR反應循環(huán)參數(shù)為 逆轉錄42°C，IOmin ；95°C, IOsec ;進入循環(huán)階段95°C變性5s，60°C退火延伸Imin,共反應40個循環(huán)。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種采用熒光PCR技術，特異性檢測樣品中麻疹病毒和風疹病毒核酸存在的寡核苷酸序列組合，以及包括該組合的試劑盒。該試劑盒能夠靈敏地檢測并鑒別樣品中存在的麻疹病毒和風疹病毒核酸，其檢測下限均為20拷貝每反應體系，在疾病監(jiān)測、臨床診斷等領域具有重要的應用價值。
文檔編號C12R1/93GK102634610SQ201210137060
公開日2012年8月15日 申請日期2012年5月7日 優(yōu)先權日2012年5月7日
發(fā)明者文鋒 申請人:鎮(zhèn)江和創(chuàng)生物科技有限公司