專利名稱：褐牛蜘蛛腿綜合征致病位點(diǎn)pcr檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種褐牛疾病的分子檢測方法。
背景技術(shù)：
家畜遺傳疾病(Animal genetic disease)是指由遺傳物質(zhì)變異對家畜個(gè)體造成有害影響，表現(xiàn)為身體結(jié)構(gòu)缺陷或功能障礙，這種有害的遺傳信息按一定的遺傳方式在世代間垂直傳遞，在某些品種的家系內(nèi)呈現(xiàn)一定的表達(dá)方式，不會延伸到無親緣關(guān)系的個(gè)體 (張沅，2001)。動物遺傳疾病的爆發(fā)給畜牧育種和生產(chǎn)者造成巨大經(jīng)濟(jì)損失。由于奶牛和肉牛Al繁育體系的建立，種公牛的優(yōu)秀生產(chǎn)性能基因在全群內(nèi)的推廣傳播效率越來越高， 對全群奶牛的生產(chǎn)性能改良起到巨大的推動作用。奶牛和肉牛遺傳種質(zhì)資源(包括優(yōu)秀個(gè)體、公牛凍精、優(yōu)質(zhì)胚胎)世界范圍內(nèi)交換的日益頻繁，也加速了有害基因在世界牛群范圍內(nèi)的傳播擴(kuò)散。牛蜘蛛腿綜合征(ArachnomeliaSyndrome, AS ；0MIA phene ID 139, Group 000059) 是一種先天性致死性骨骼畸形遺傳病，患病個(gè)體出生時(shí)或出生不久后死亡。該病最早是于 1975年，由德國科學(xué)家Rieck和Schade報(bào)道的，現(xiàn)除了個(gè)別在荷斯坦牛群中散發(fā)的患病牛外，該病主要存在于德系西門塔爾牛和瑞士褐牛群體中。雖然在兩個(gè)品種中，AS癥狀相似，但遺傳基礎(chǔ)并不相同。在西門塔爾牛群中，該病是由MOCSl基因外顯子11的缺失突變 c. 1224 1225delCA引起的，該突變將造成移碼突變產(chǎn)生不成熟的短鏈蛋白，突變位點(diǎn)發(fā)生在一個(gè)該蛋白質(zhì)物種間共同的保守域前，突變導(dǎo)致MoC結(jié)構(gòu)域丟失，蛋白質(zhì)在二級結(jié)構(gòu)上也發(fā)生變異。(Buitkamp等,2011 ;焦士會,2011)在20世紀(jì)80年代，歐洲瑞士褐牛中大量報(bào)道了蜘蛛腿綜合征患病個(gè)體(K0nig 等，1987)，2004年，意大利也報(bào)道了 4頭AS瑞士褐犢牛，并詳細(xì)描述了其主要的臨床癥狀和病理特征(Testoni，2004)?？茖W(xué)家對歷經(jīng)20年時(shí)間收集到的15頭患病瑞士褐牛進(jìn)行
系譜分析，所有個(gè)體都能追溯到同一個(gè)祖先-來自美國Norvic Larry牛場的瑞士褐公
牛LILAS0N，并且推斷AS呈現(xiàn)簡單孟德爾隱性遺傳病特征(Dr0gemiiller等，2009)。瑞士褐牛群體有可能是由于大量使用這頭經(jīng)高度選育的公牛及其后代的凍精，從而引起該病致病基因的廣泛傳播，導(dǎo)致發(fā)病。2009年，Dr0gemiiller等對瑞士褐牛群AS進(jìn)行了研究，使用了覆蓋牛29對常染色體的240個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記，對15頭患病個(gè)體和36頭已知確認(rèn)的AS雜合子進(jìn)行全基因組掃描， 將基因定位在BTA5上3個(gè)連續(xù)標(biāo)記間。進(jìn)一步精細(xì)定位和單倍型分析的結(jié)果揭示導(dǎo)致瑞士褐牛蜘蛛腿綜合征的致病基因可能存在于BTA5上微衛(wèi)星標(biāo)記BMS490和DIK5248之間， 跨度約8cM，物理距離在7. 19Mb范圍內(nèi)。隨后，Dr0gemiiller等(2010)報(bào)道了瑞士褐牛AS 是由BTA5定位區(qū)間內(nèi)SUOX基因外顯子4上的一個(gè)G的插入c. 363_364insG突變所致。經(jīng)預(yù)測，插入突變c. 363-364insG會導(dǎo)致SO蛋白的氨基酸序列從124位置發(fā)生移碼突變并且會由于移碼提前產(chǎn)生終止密碼子，最終導(dǎo)致發(fā)病。在我國，新疆褐牛(Xinjiang Brown)是經(jīng)長期選育培育出來的優(yōu)秀的乳肉兼用型品種，于1983年通過新疆自治區(qū)畜牧廳組織品種審定。新疆褐牛最初是以當(dāng)?shù)毓_克牛為母本，引入瑞士褐牛、阿拉托烏牛及少量的科斯特羅姆牛與之雜交改良經(jīng)長期選育形成。 19世紀(jì)70年代至今，我國曾大量引入西德、奧地利褐牛和美國瑞士褐牛及其遺傳物質(zhì)(包括凍精及活體胚胎等)進(jìn)行新疆褐牛優(yōu)良遺傳品質(zhì)及生產(chǎn)性能的鞏固和提高(鄭丕留等， 1998)。大量外血的引入對新疆褐牛的生產(chǎn)性能提高發(fā)揮了重要作用，然而也可能將一些不利的致病基因引入。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，瑞士和奧地利的瑞士褐牛群體中AS致病等位基因估計(jì)頻率為O. 16(Dr0gemiiller等，2010)，但該致病突變是否已存在于我國新疆褐牛群體中尚處于未知狀態(tài)。因此，建立褐牛AS致病位點(diǎn)檢測方法具有重要意義。PCR產(chǎn)物測序的方法對于尋找DNA序列上的突變是一種準(zhǔn)確性最高的檢測方法。 使用PCR產(chǎn)物測序的方法，比對測序結(jié)果與參考序列能夠快速確定測序個(gè)體DNA序列與參考序列的差異。熒光自動化檢測分析方法其基本原理就是，通過在引物上標(biāo)記I個(gè)熒光發(fā)色基團(tuán)，經(jīng)PCR擴(kuò)增后，再采用毛細(xì)管電泳或聚丙烯酰胺凝膠電泳技術(shù)進(jìn)行產(chǎn)物分離，利用基于熒光掃描技術(shù)的遺傳分析儀，結(jié)合分子量標(biāo)準(zhǔn)自動計(jì)算PCR產(chǎn)物長度大小，是一種常見的用于檢測長度多態(tài)的技術(shù)手段。此法通過直接判定擴(kuò)增片段的長度，能夠?qū)崿F(xiàn)高通量和自動化的分型。另外，該技術(shù)具有靈敏度高、特異性和可靠性更強(qiáng)、檢測實(shí)現(xiàn)高通量分型、自動化程度高、無污染性、具實(shí)時(shí)性、快捷性和準(zhǔn)確性等特點(diǎn)，此外，該方法還能夠與其他位點(diǎn)檢測進(jìn)行組合，如擴(kuò)增片段長度不同或者攜帶不同的熒光發(fā)色基團(tuán)，目前已廣泛應(yīng)用于分子生物學(xué)研究和醫(yī)學(xué)研究等領(lǐng)域。

發(fā)明內(nèi)容
為了解決上述問題，本發(fā)明的目的在于提供一種褐牛蜘蛛腿綜合征(AS)致病位點(diǎn)的快速檢測方法。為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明提供的一種褐牛蜘蛛腿綜合征(AS)致病位點(diǎn)PCR檢測用引物，其核苷酸序列如下5，-CTCAAGAGTCACCACGCAGAT-3，，5，-ATGGAGGGTGCCTTGTCGTC-3，。上述引物配合使用的熒光標(biāo)記引物，其熒光染料為FAM、HEX、TET等。本發(fā)明還提供含有上述引物的檢測試劑盒，其還包括DNA裂解液、陰性模板和/ 或陽性模板。本發(fā)明進(jìn)一步提供利用上述引物或試劑盒檢測褐牛蜘蛛腿綜合征的方法，包括以下步驟I)目的基因的擴(kuò)增以褐牛組織細(xì)胞DNA為模板，利用上述引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，回收PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；2)基因分型對上述PCR擴(kuò)增產(chǎn)物直接測序或者利用熒光毛細(xì)管電泳或者熒光聚丙烯酰胺凝膠電泳分型。所述PCR擴(kuò)增條件優(yōu)選為95°C預(yù)變性5min，然后95°C變性30s、63°C退火30s、 72°C延伸30s，共35個(gè)循環(huán)，72°C最終延伸IOmin。所述引物用量為I. 5 μ L，引物的終濃度為10 μ Μ。
本發(fā)明還提供了上述方法在牛抗病育種中的應(yīng)用，所述牛為褐牛該檢測方法是在已知SUOX基因的c. 363_364insG證位點(diǎn)為褐牛蜘蛛腿綜合征 (AS)致病位點(diǎn)的基礎(chǔ)上，結(jié)合PCR直接測序方法或者熒光引物PCR后電泳檢測方法，設(shè)計(jì)的一種快速準(zhǔn)確遺傳致病基因檢測的方法。對褐牛AS致病突變位點(diǎn)準(zhǔn)確有效的分子檢測方法的建立，目的在于篩選出我國牛群中的突變攜帶者個(gè)體，進(jìn)行不利基因的篩查和剔除，對我國進(jìn)口的褐牛種用動物及遺傳物質(zhì)(冷凍精液，胚胎等)，以及我國褐牛群體和含有褐牛血緣的群體進(jìn)行檢測，防止AS在我國牛群中的傳播，對我國牛的遺傳改良提供保障。本發(fā)明褐牛蜘蛛腿綜合征致病位點(diǎn)PCR檢測用引物及其試劑盒，檢測結(jié)果穩(wěn)定， 成本低，準(zhǔn)確可靠，可實(shí)現(xiàn)高通量檢測，對褐牛AS致病位點(diǎn)可以進(jìn)行準(zhǔn)確的分型，能及時(shí)發(fā)現(xiàn)褐牛蜘蛛腿綜合征攜帶者個(gè)體。


圖I為本發(fā)明凍精中提取公牛基因組I %瓊脂糖凝膠檢測結(jié)果；圖2為本發(fā)明不同引物、相同樣品PCR擴(kuò)增產(chǎn)物2%瓊脂糖凝膠檢測結(jié)果；其中 泳道1-12為引物MOCS擴(kuò)增產(chǎn)物；泳道19-30為引物SUOX I擴(kuò)增產(chǎn)物；泳道13-18，31-36 為引物SUOX 2擴(kuò)增產(chǎn)物；M為IOObp ladder ；圖3為本發(fā)明中PCR產(chǎn)物突變位點(diǎn)附近測序結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道的測序結(jié)果比較；其中a為本研究測序結(jié)果；b、c為文獻(xiàn)報(bào)道的歐洲瑞士褐牛PCR產(chǎn)物測序結(jié)果，黑色箭頭位置為報(bào)道的瑞士褐牛AS致病突變位點(diǎn)c. 363-364insG ；圖4為本發(fā)明被檢測個(gè)體PCR產(chǎn)物測序序列與基因參考序列進(jìn)行多重比對的結(jié)果；其中前5行序列分別為本研究中檢測個(gè)體；第6行序列為參考序列(NCBI Gene ID 509837)；圖5為本發(fā)明使用熒光自動化判型法進(jìn)行SUOX基因突變位點(diǎn)新疆褐?；蛐蜋z測結(jié)果；圖6 為本發(fā)明 SUOX 基因 c. 363-364insG 和 MOCSl 基因 c. dell224_1225CA 位點(diǎn)同時(shí)檢測結(jié)果；其中黑色箭頭指示峰圖為250bp內(nèi)標(biāo)。
具體實(shí)施例方式以下實(shí)施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。在不背離本發(fā)明精神和實(shí)質(zhì)的情況下，對本發(fā)明方法、步驟或條件所作的修改或替換，均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。若未特別指明，實(shí)施例中所用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段。實(shí)施例I試驗(yàn)材料的準(zhǔn)備和DNA的提取本研究采用的試驗(yàn)材料來自兩個(gè)部分，一部分是我國新疆地區(qū)現(xiàn)在推廣使用的55 頭褐牛公牛，其中50頭公牛的凍精來自天山畜牧種公牛站，另外5頭來自新疆畜禽繁殖改良總站，共55支細(xì)管冷配精液。系譜分析顯示55頭褐牛公牛不同程度的含有歐洲及美國褐牛血緣(表I)。表155頭褐牛種公牛含美國及歐洲瑞士褐牛外血情況
權(quán)利要求
1.一種褐牛蜘蛛腿綜合征致病位點(diǎn)PCR檢測用引物，其核苷酸序列如下5， -CTCAAGAGTCACCACGCAGAT-3，，5’ -ATGGAGGGTGCCTTGTCGTC-3’。
2.如權(quán)利要求I所述引物，其特征在于，還包括與引物配合使用的熒光染料。
3.如權(quán)利要求I所述的引物，其特征在于，所述染料為FAM、HEX或TET。
4.含權(quán)利要求I 3任意一項(xiàng)所述引物的檢測試劑盒。
5.如權(quán)利要求4所述的試劑盒，其特征在于，其還包括DNA裂解液、陰性模板和/或陽性模板。
6.一種檢測褐牛蜘蛛腿綜合征致病位點(diǎn)方法，其特征在于，其具體包括以下步驟1)目的基因的擴(kuò)增以褐牛組織細(xì)胞DNA為模板，利用權(quán)利要求I所述引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，回收PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；2)基因分型對上述PCR擴(kuò)增產(chǎn)物直接測序或者利用熒光毛細(xì)管電泳或者熒光聚丙烯酰胺凝膠電泳分型。
7.如權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，所述PCR擴(kuò)增條件為95°C預(yù)變性5min，然后 95°C變性30s、63°C退火30s、72°C延伸30s，共35個(gè)循環(huán)，72°C最終延伸IOmin。
8.如權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，所述引物用量為I.5 μ L，引物的終濃度為 10 μ Μ。
9.權(quán)利要求6 8任意一項(xiàng)所述方法在?？共∮N中的應(yīng)用。
10.如權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于，所述牛為褐牛。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種褐牛蜘蛛腿綜合征致病位點(diǎn)PCR檢測用引物，其核苷酸序列如下5’-CTCAAGAGTCACCACGCAGAT-3’，5’-ATGGAGGGTGCCTTGTCGTC-3’。本發(fā)明還涉及PCR檢測試劑盒及其檢測方法和應(yīng)用。本發(fā)明褐牛蜘蛛腿綜合征致病位點(diǎn)PCR檢測用引物及其試劑盒，檢測結(jié)果穩(wěn)定，成本低，準(zhǔn)確可靠，可實(shí)現(xiàn)高通量檢測，對褐牛AS致病位點(diǎn)可以進(jìn)行準(zhǔn)確的分型，能及時(shí)發(fā)現(xiàn)褐牛蜘蛛腿綜合征攜帶者個(gè)體。
文檔編號C12Q1/68GK102586464SQ20121007691
公開日2012年7月18日 申請日期2012年3月21日 優(yōu)先權(quán)日2012年3月21日
發(fā)明者俞英, 初芹, 孫東曉, 張毅, 張沅, 張勝利, 焦士會, 王雅春 申請人:中國農(nóng)業(yè)大學(xué)