專利名稱：一種蟲草素的發(fā)酵生產(chǎn)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種蟲草素的發(fā)酵生產(chǎn)方法，屬于生物發(fā)酵工程技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
蟲草菌素(cordyc印in)，即3’ -脫氧腺苷。它有多種生物學(xué)活性，如抗腫瘤、抗增殖、抗轉(zhuǎn)移、抗菌、抗病毒、免疫調(diào)節(jié)和抗炎等。在最近的十年間，以蟲草菌素作為治療藥物的靶向研究取得重大進展。這些研究包括蟲草菌素在各種癌癥上的應(yīng)用，特別是白血病(在美國已進入三期臨床)，還有非洲錐蟲病和血管成形術(shù)引起的再狹窄以及蟲草菌素衍生物體內(nèi)抗氧化的作用等。所以，蟲草菌素的合成技術(shù)是人們比較關(guān)心的研究課題。在日韓等國家一直有研究單位專業(yè)從事高純度蟲草菌素的制備、分離純化等工作，研究技術(shù)世界領(lǐng)先。日本學(xué)者Masuda等報道利用表面液體培養(yǎng)技術(shù)發(fā)酵C mi Ii tar is制備蟲草菌素，濃度達到0. 640g/L,生產(chǎn)效率為0. 032g/L/d。一年后，通過加入與嘌呤生物合成相關(guān)的化合物促進蟲草菌素的積累，濃度和生產(chǎn)效率分別提高至2. 5g/L和0. 19g/L/d。最近，他們又報道了一種通過離子束誘變獲得蟲草菌素高產(chǎn)菌的方法，蟲草菌素的表面液體發(fā)酵濃度達到6. 84g/L，是目前世界上文獻報道的最優(yōu)結(jié)果。雖然近年來我國也進行了大量的同類研究，但僅停留在蟲草菌絲體的人工培養(yǎng)及制劑的研究上，水平有限，技術(shù)含量不高，無法同國外同類產(chǎn)品競爭。2004年，鐘建江等人利用兩步溶氧控制液體深層發(fā)酵C mi Ii tar is制備蟲草菌素，積累濃度達到0. 201g/L，生產(chǎn)效率達到0. 016g/L/d。接著他們又優(yōu)化了碳源和碳氮比，積累濃度和生產(chǎn)效率分別提高到0. 345g/L和0. 019g/L/d。此后一年，他們又報道了銨離子對蟲草菌素積累的效應(yīng)，蟲草菌素的濃度達到0. 421g/L，生產(chǎn)效率達到0. 025g/L/d。因此，加速蟲草菌素制備、分離、純化及產(chǎn)業(yè)化的研究不僅能夠填補國內(nèi)主流醫(yī)藥市場的空白，占據(jù)國內(nèi)同類藥品的較大市場份額，而且有可能較快在國際同類藥品市場占有一席之地。目前蟲草的工業(yè)發(fā)酵中，主要采用固態(tài)發(fā)酵和深層液體發(fā)酵兩種。這兩種發(fā)酵方式各有利弊。對于不同的菌株采用獨特的發(fā)酵方式，才能獲得最佳的效果。Mao XB 等人的間歇性發(fā)酵工藝[Mao XB, Zhong JJ. Significant effect ofNH4+ on cordycepin production by submerged cultivation of medicinal mushroomCordyceps militaris. Enzyme Microb Tech 2006; 38:343-350.]，在常規(guī)發(fā)酵 7 天后，加入40mmol/L硫酸銨，再繼續(xù)發(fā)酵10天后，蟲草菌素濃度達到最大，為420. 4mg/L,生產(chǎn)效率為0. 025g/L/d。該工藝菌株生長緩慢導(dǎo)致發(fā)酵時間長，發(fā)酵得率不高，發(fā)酵產(chǎn)物濃度低。中國專利CN 1923998A公開了一種靜置發(fā)酵工藝，該工藝流程包括液體培養(yǎng)基配制，培養(yǎng)基的分裝、滅菌、接菌，菌絲體的靜置培養(yǎng)，菌絲體轉(zhuǎn)色、原基分化，子實體生長、采收、干制。裝有液體培養(yǎng)基的菌瓶接菌后，放入遮光、1纊20°C養(yǎng)菌室內(nèi)靜置培養(yǎng)，7 10天菌絲長滿液面，即得蛹蟲草菌；提高溫度2(T22°C，加強光照，8 10天后菌絲由白色專為桔黃色，菌絲扭結(jié)形成瘤突起物，分化形成原基；在封口膜上開透氣小孔，增大透氣量，蛹蟲草子實體逐漸伸長，頂部膨大，少量子囊孢子開始散出，開始采收；及時放入恒溫箱中，烘干即可。
本實驗室對pH值的控制方式對蟲草素產(chǎn)量的影響進行了深入的研究。本發(fā)明在此基礎(chǔ)上進行補料分批發(fā)酵調(diào)控，即根據(jù)菌株生長和起始培養(yǎng)基的特點，在分批發(fā)酵的某階段適當補加能源和蟲草素前體，并同時維持PH值在最佳蟲草素合成條件下，使得菌株保持一定的菌體生長密度，使其代謝流不斷遷移，促進產(chǎn)物蟲草素的生成，補料分批發(fā)酵是介于分批發(fā)酵與連續(xù)發(fā)酵之間，兼有兩者的優(yōu)點，又克服了兩者的缺點，因此具有很好的發(fā)展前景。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種恒PH流加補料策略發(fā)酵生產(chǎn)蟲草素的方法，使菌種保持一定的菌體生長密度，又促使代謝流遷移，有利于蟲草素的生成。為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下
一種蟲草素的發(fā)酵生產(chǎn)方法，將活化后的菌株蛹蟲草Cbr辦⑶/ZS mi Ii tar is CICCNo. 14014 (中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心)以;Γ5%(ν/ν)的接種量接入到裝有發(fā)酵培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中，發(fā)酵溫度為2548°C，攪拌轉(zhuǎn)速為150-180rpm，流加氫氧化鈉溶液和鹽酸控制發(fā)酵液PH值保持在5. 5-6. 0 ；當碳源消耗完畢時，攪拌轉(zhuǎn)速降為60-80rpm，利用間歇流加的方式向發(fā)酵罐中補加含葡萄糖和腺苷的水溶液，整個發(fā)酵時間為200480h。其中，所述的菌株需先經(jīng)過活化，即將菌株轉(zhuǎn)入種子培養(yǎng)基活化兩次，每次25°C培養(yǎng)5天，其中，所述的種子培養(yǎng)基配方按如下方法制得取去皮的馬鈴薯200克，切成Icm見方小塊，加水1000毫升煮沸30分鐘，4層紗布濾去馬鈴薯塊，將濾液補足至1000毫升，加葡萄糖20克，KH2PO4 3克，MgS04_7H20 1.5克，維生素Bl 0. 2g，瓊脂15克，溶化后分裝，121 °C滅菌30分鐘。其中，所述的發(fā)酵培養(yǎng)基配方如下葡萄糖42g/L、酵母膏6g/L、蛋白胨10g/L、KH2PO4 0. 5g/L、K2HPO4 · 3H20 0. 5g/L、MgSO4 · 7H20 0. 5g/L，溶劑為水，ρΗ6· 0，121°C滅菌 20分鐘。其中，所述的氫氧化鈉溶液濃度為10%(w/w)，所述的鹽酸濃度為10%(w/w)。其中，所述間歇流加，流速為0. 6mL/h。其中，所述的含葡萄糖和腺苷的水溶液，其中葡萄糖的濃度為500g/L，腺苷的濃度為 3g/L。本發(fā)明的有益效果通過控制發(fā)酵過程的PH值并及時補加能源和蟲草素前體，使得發(fā)酵過程能夠得以保持在最佳環(huán)境下，有利于菌體的生長，且有利于代謝流的遷移，所以最終蟲草素產(chǎn)量可以達到10. Og/L(是現(xiàn)有工藝產(chǎn)量的M倍)，生產(chǎn)效率達到0. 25g/L/d(是現(xiàn)有工藝生產(chǎn)效率的34倍)，工藝簡單、環(huán)境污染小、操作方便、蟲草素的產(chǎn)量高。
具體實施例方式根據(jù)下述實施例，可以更好地理解本發(fā)明。然而，本領(lǐng)域的技術(shù)人員容易理解，實施例所描述的內(nèi)容僅用于說明本發(fā)明，而不應(yīng)當也不會限制權(quán)利要求書中所詳細描述的本發(fā)明。以下實施例中，蟲草菌素的HPLC檢測方法如下
采用島津LC-9A色譜工作站，色譜柱采用Ultimate AQ-C18柱，柱型(粒徑5 μ m，250X 4. 6 mm)。流動相為10 mmol/L KH2PO4溶液和甲醇，體積比為85 15。流速lml/min，柱溫30°C，檢測波長為260nm。實施例1
菌種-.Cordyceps mi Ii tar is CICC No. 14014 (中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心)。保藏培養(yǎng)基和種子培養(yǎng)基按如下方法制備取去皮的馬鈴薯200克，切成Icm見方小塊，加水1000毫升煮沸30分鐘，4層紗布濾去馬鈴薯塊，將濾液補足至1000毫升，加葡萄糖20克，KH2PO4 3克，MgSO4 7H20 1. 5克，維生素Bl 0. 2g，瓊脂15克，溶化后分裝，121 °C滅菌30分鐘。發(fā)酵培養(yǎng)基配方如下葡萄糖42g/L、酵母膏6g/L、蛋白胨10g/L、KH2PO4 0. 5g/L、K2HPO4 · 3H20 0. 5g/L、MgSO4 · 7H20 0. 5g/L，溶劑為水，ρΗ6· 0，121°C滅菌 20 分鐘。菌種保藏所用菌種保藏在保藏培養(yǎng)基斜面上，4°C保存，兩月轉(zhuǎn)接一次。種子培養(yǎng)從保藏培養(yǎng)基上轉(zhuǎn)入種子培養(yǎng)基需活化兩次，每次25°C培養(yǎng)5天。液體培養(yǎng)菌株以3%(v/v)的接種量接入5L的發(fā)酵罐中，裝液量為3L，25°C發(fā)酵，攪拌轉(zhuǎn)速為150rpm，流加10%(w/w)氫氧化鈉溶液和10%(w/w)鹽酸，控制pH在5. 5 ；當葡萄糖消耗完畢時(可利用3，5- 二硝基水楊酸法測定發(fā)酵液中葡萄糖的含量，大約90h消耗完畢)，攪拌轉(zhuǎn)速降為80rpm，向發(fā)酵罐中補加含500g/L葡萄糖和3g/L腺苷的水溶液，流速0. 6mL/h,培養(yǎng)至^Oh后結(jié)束發(fā)酵，蟲草素產(chǎn)量為10. Og/L,生產(chǎn)效率達到0. 86g/L/d。實施例2
菌種-.Cordyceps mi Ii tar is CICC No. 14014 (中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心)。保藏培養(yǎng)基和種子培養(yǎng)基按如下方法制備取去皮的馬鈴薯200克，切成Icm見方小塊，加水1000毫升煮沸30分鐘，4層紗布濾去馬鈴薯塊，將濾液補足至1000毫升，加葡萄糖20克，KH2PO4 3克，MgSO4 7H20 1. 5克，維生素Bl 0. 2g，瓊脂15克，溶化后分裝，121 °C滅菌30分鐘。發(fā)酵培養(yǎng)基配方如下葡萄糖42g/L、酵母膏6g/L、蛋白胨10g/L、KH2PO4 0. 5g/L、K2HPO4 · 3H20 0. 5g/L、MgSO4 · 7H20 0. 5g/L，溶劑為水，ρΗ6· 0，121°C滅菌 20 分鐘。菌種保藏所用菌種保藏在保藏培養(yǎng)基斜面上，4°C保存，兩月轉(zhuǎn)接一次。種子培養(yǎng)從保藏培養(yǎng)基上轉(zhuǎn)入種子培養(yǎng)基需活化兩次，每次25°C培養(yǎng)5天。液體培養(yǎng)菌株以5%(v/v)的接種量接入5L的發(fā)酵罐中，裝液量為3. 5LJ8°C發(fā)酵，攪拌轉(zhuǎn)速為180rpm，流加10%(w/w)氫氧化鈉溶液和10%(w/w)鹽酸，控制pH在6. 0 ；當葡萄糖消耗完畢時(可利用3，5- 二硝基水楊酸法測定發(fā)酵液中葡萄糖的含量，大約90h消耗完畢)，攪拌轉(zhuǎn)速降為60rpm，向發(fā)酵罐中補加含500g/L葡萄糖和3g/L腺苷的水溶液，流速0. 6mL/h,培養(yǎng)至200h后結(jié)束發(fā)酵，蟲草素產(chǎn)量為7. 2g/L，生產(chǎn)效率達到0. 86g/L/d。對比例1
與實施例1相同，所不同的是液體培養(yǎng)。液體培養(yǎng)菌株以5%(v/v)的接種量接入5L的發(fā)酵罐中，裝液量為3. 5L，25°C發(fā)酵，攪拌轉(zhuǎn)速為180rpm，發(fā)酵至200h后結(jié)束發(fā)酵，蟲草素產(chǎn)量為2. lg/L，生產(chǎn)效率達到0.21g/L/d。對比例2:
與實施例1相同，所不同的是液體培養(yǎng)。液體培養(yǎng)菌株以5%(v/v)的接種量接入5L的發(fā)酵罐中，裝液量為3. 5L，25°C發(fā)酵，攪拌轉(zhuǎn)速為180rpm，流加10%(w/w)氫氧化鈉溶液和10%(w/w)鹽酸，控制pH在6. 0發(fā)酵至200h后結(jié)束發(fā)酵，蟲草素產(chǎn)量為4. 2g/L，生產(chǎn)效率達到0. 42g/L/d。對比例3:
與實施例1相同，所不同的是液體培養(yǎng)。液體培養(yǎng)菌株以5%(v/v)的接種量接入5L的發(fā)酵罐中，裝液量為3. 5L，25°C發(fā)酵，攪拌轉(zhuǎn)速為ISOrpm ；當葡萄糖消耗完畢時(約90h)，攪拌轉(zhuǎn)速降為60rpm，向發(fā)酵罐中補加含500g/L葡萄糖和3g/L腺苷的水溶液，流速0. 6mL/h,培養(yǎng)至200h后結(jié)束發(fā)酵，蟲草素產(chǎn)量為4. lg/L，生產(chǎn)效率達到0. 41g/L/d。
權(quán)利要求
1.一種蟲草素的發(fā)酵生產(chǎn)方法，其特征在于，將活化后的菌株蛹蟲草Cbr辦⑶/ZS mi Ii tar is CICC No. 14014以;Γ5% (ν/ν)的接種量接入到裝有發(fā)酵培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中，發(fā)酵溫度為2548°C，攪拌轉(zhuǎn)速為150-180rpm，流加氫氧化鈉溶液和鹽酸控制發(fā)酵液pH值保持在5. 5-6. 0 ；當碳源消耗完畢時，攪拌轉(zhuǎn)速降為60-80rpm，利用間歇流加的方式向發(fā)酵罐中補加含葡萄糖和腺苷的水溶液，整個發(fā)酵時間為200480h。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的蟲草素的發(fā)酵生產(chǎn)方法，其特征在于，所述的菌株需先經(jīng)過活化，即將菌株轉(zhuǎn)入種子培養(yǎng)基活化兩次，每次25°C培養(yǎng)5天，其中，所述的種子培養(yǎng)基配方按如下方法制得取去皮的馬鈴薯200克，切成Icm見方小塊，加水1000毫升煮沸 30分鐘，4層紗布濾去馬鈴薯塊，將濾液補足至1000毫升，加葡萄糖20克，KH2PO4 3克， MgSO4IH2O 1.5克，維生素Bl 0. 2g，瓊脂15克，溶化后分裝，121°C滅菌30分鐘。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的蟲草素的發(fā)酵生產(chǎn)方法，其特征在于，所述的發(fā)酵培養(yǎng)基配方如下葡萄糖 42g/L、酵母膏 6g/L、蛋白胨 10g/L、KH2PO4 0. 5g/L、K2HPO4 · 3H20 0. 5g/L、 MgSO4 · 7H20 0. 5g/L，溶劑為水，ρΗ6· 0，121°C滅菌 20 分鐘。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的蟲草素的發(fā)酵生產(chǎn)方法，其特征在于，所述的氫氧化鈉溶液濃度為10%(w/w)，所述的鹽酸濃度為10%(w/w)。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的蟲草素的發(fā)酵生產(chǎn)方法，其特征在于，所述間歇流加，流速為 0. 6mL/h。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的蟲草素的發(fā)酵生產(chǎn)方法，其特征在于，所述的含葡萄糖和腺苷的水溶液，其中葡萄糖的濃度為500g/L，腺苷的濃度為3g/L。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種蟲草素的發(fā)酵生產(chǎn)方法，將活化后的菌株蛹蟲草接入到裝有發(fā)酵培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中，發(fā)酵溫度為25-28℃，攪拌轉(zhuǎn)速為150-180rpm，流加氫氧化鈉溶液和鹽酸控制發(fā)酵液pH值保持在5.5-6.0；當碳源消耗完畢時，攪拌轉(zhuǎn)速降為60-80rpm，利用間歇流加的方式向發(fā)酵罐中補加含葡萄糖和腺苷的水溶液，整個發(fā)酵時間為200-280h。本發(fā)明通過控制發(fā)酵過程的pH值并及時補加能源和蟲草素前體，使得發(fā)酵過程能夠得以保持在最佳環(huán)境下，有利于菌體的生長，且有利于代謝流的遷移，所以最終蟲草素產(chǎn)量可以達到10.0g/L，生產(chǎn)效率達到0.25g/L/d，工藝簡單、環(huán)境污染小、操作方便、蟲草素的產(chǎn)量高。
文檔編號C12P19/40GK102559815SQ20121006843
公開日2012年7月11日 申請日期2012年3月15日 優(yōu)先權(quán)日2012年3月15日
發(fā)明者姜正林, 朱俐, 湯佳鵬, 葛彥 申請人:南通大學(xué)