專利名稱：一種多重競爭性pcr檢測拷貝數(shù)變異的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種基于熒光通用引物的多重競爭性PCR檢測拷貝數(shù)變異的方法，應(yīng)用于生物科學(xué)研究與臨床分子診斷。
背景技術(shù)：
拷貝數(shù)變異(copy number variations,CNVs)是近年來發(fā)現(xiàn)的基因組多樣性的新形式，它是指與參考序列相比，基因組中Ikb 3Mb的DNA片段的結(jié)構(gòu)變異現(xiàn)象。CNVs廣泛存于基因組中，與一些遺傳性疾病的發(fā)生相關(guān)，對人類抗病性和易感性表型等變異有重要影響。這就要求建立一種快速、準(zhǔn)確和低成本的CNVs分型檢測技術(shù)。隨著生物技術(shù)的發(fā)展，不同的研究小組相繼開發(fā)了許多的檢測方法，主要包括以雜交為基礎(chǔ)和以PCR為基礎(chǔ)的檢測技術(shù)。前者可以在全基因組水平上對CNVs進(jìn)行檢測， 代表技術(shù)有微陣列比較基因雜交(SolinasToldo，Lampel et al. 1997)、全基因組SNP芯片(Irving, Bloodworth et al. 2005)、代表性寡核苷酸微陣列技術(shù)(Lucito, Healy et al. 2003)等，其優(yōu)點是通量高且易于實現(xiàn)自動化，但是普遍存在分辨率低、成本高和周期長的缺點。后者主要是針對具體的目標(biāo)位點進(jìn)行檢測，代表性的技術(shù)有實時熒光定量PCR、 多重連接探針擴增技術(shù)(MLPA) (Schouten, McElgunn et al. 2002)和多重可擴增探針雜交 (MAPH) (Armour, Sismani et al. 2000)等。實時突光定量技術(shù)有操作簡單、重復(fù)性好、實驗周期短等優(yōu)點，但是檢測通量較??；與實時熒光定量PCR相比，MLPA和MAPH的檢測通量有了很大提高，不過PCR微環(huán)境的變化會導(dǎo)致不同位點不能完全同步擴增，而且PCR的平臺效應(yīng)也會影響檢測結(jié)果。以PCR為基礎(chǔ)的檢測技術(shù)存在一個共同的缺陷就是待測樣本和對照樣本是分開檢測的，這樣兩者PCR效率的差異會引起檢測結(jié)果的偏差。競爭性PCR克服了這個缺陷，實現(xiàn)CNVs的快速、準(zhǔn)確、經(jīng)濟(jì)的檢測。在PCR擴增過程中，PCR產(chǎn)物的量可以用公式Y(jié) = A (1+R)n來表示，其Y表示PCR產(chǎn)物的量，A表示初始模板的量，R表示PCR的擴增效率，η表示PCR的循環(huán)數(shù)，當(dāng)PCR擴增效率相同時，PCR產(chǎn)物的量與初始模板的量成正比。競爭性PCR利用了這一原理，在同一 PCR反應(yīng)體系中涉及兩組模板，一組是待測樣本，另一組是合成的一段核酸序列，用作內(nèi)對照，兩組模板僅在目標(biāo)序列長度上(存在一些堿基的插入或缺失)存在一些差異，其他反應(yīng)條件一致，因此兩者擴增效率接近一致，兩種擴增產(chǎn)物量的比直觀的反映了初始模板(待測樣本和內(nèi)對照不存在拷貝數(shù)差異)量的比，可以根據(jù)內(nèi)對照的初始模板的量來計算樣本的濃度。在檢測拷貝數(shù)變異時，當(dāng)兩模板具有相同的濃度或削除了濃度差異帶來的影響時，PCR產(chǎn)物量的比值就反映模板拷貝數(shù)的差異。PRT 法(Paralogue Ratio Test) (Armour,Palla et al. 2007)是基于競爭性PCR的一種檢測CVNs的一種方法，此方法的優(yōu)點是待測位點和內(nèi)對照共存于基因組序列中，但是缺點也是很明顯的，只能針對有限的基因位點進(jìn)行檢測，而且針對不同檢測位點都要設(shè)計一對熒光引物，加大了實驗成本。內(nèi)對照可以采用人工合成的方法，還有其他的一些制備方法(Zentilin and Giacca 2007),不過這種方法設(shè)計的內(nèi)對照序列較待測位點的序列不一致，導(dǎo)致兩者PCR擴增效率差異大，最終影響拷貝數(shù)的檢測。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是克服現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，提供一種成本低、通量較高、樣本需求低、檢測靈敏性高的CNVs檢測方法。本發(fā)明的目的通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)技術(shù)方案之一是提供一種基于熒光通用引物的多重競爭性PCR檢測拷貝數(shù)變異的方法，包括以下步驟(I)提供多重競爭性PCR引物，由至少一對通用熒光引物、至少一對位于待測基因上下游的嵌合特異引物和至少三對參照引物組成所述通用熒光引物長度范圍為10 25bp，5’端用熒光標(biāo)記，TM值彡57°C值，且通用引物對待測基因組具有特異性；所述嵌合特異引物和所述參照引物針對參照區(qū)段和檢測區(qū)段設(shè)計，TM值> 62°C， 長度范圍為28 50bp，3’端為18 25bp的特異引物序列，5’端為所述通用引物序列，所述3’端和5’端的序列之間插入兩個堿基的固定組合；所有嵌合引物之間的TM值的差異不超過3°C ;所述三對參照引物設(shè)計在相同或不同的參照區(qū)段上，且與待測基因無特異性匹配；所述多重競爭性PCR引物所產(chǎn)生的不同擴增產(chǎn)物片段之間有可檢出的長度差異；(2)定量合成內(nèi)對照DNA片段針對每一個待測區(qū)段和每一個參照區(qū)段的擴增產(chǎn)物片段，合成相對應(yīng)的內(nèi)對照序列，并進(jìn)行精確定量；所述內(nèi)對照序列與所述待測區(qū)段和參照區(qū)段的擴增產(chǎn)物片段相比插入或缺失2 3bp的DNA片段；(3)多重競爭性PCR的反應(yīng)過程(a)將含待測區(qū)段和參照區(qū)段的待測樣本和對照樣本分別與相等或整數(shù)倍mol數(shù)的內(nèi)對照DNA片段混合在一起，然后進(jìn)行PCR，前3 16個循環(huán)，退火溫度高于所述通用熒光引物的退火溫度，用于所述嵌合特異引物引導(dǎo)的擴增，后17 20個循環(huán)，退火溫度低于所述通用熒光引物的退火溫度，用于所述通用引物引導(dǎo)的擴增，兩組退火溫度的差距 ^ 5 0C ；(b)根據(jù)熒光標(biāo)記PCR擴增產(chǎn)物長度不同，對擴增產(chǎn)物片段進(jìn)行檢測，獲得待測樣本中待測區(qū)段和參照區(qū)段以及內(nèi)對照擴增產(chǎn)物片段的長度信息與相應(yīng)的熒光強度信息；⑷數(shù)據(jù)分析i.計算每個待測區(qū)段和參照區(qū)段的樣本峰高和/或峰面積(S)和內(nèi)對照的峰高和或峰面積(I)，得到每個待測區(qū)段和參照區(qū)段的比值(S/I)；ii.以一個參照區(qū)段的比值為標(biāo)準(zhǔn)，將所有待測區(qū)段和參照區(qū)段的比值同其作比， 進(jìn)行數(shù)據(jù)內(nèi)部標(biāo)化；iii.按照i和ii的步驟將對照樣本進(jìn)行數(shù)據(jù)內(nèi)部標(biāo)化；iv.將待測樣本和對照樣本的內(nèi)部標(biāo)化值作比，獲得待測樣本與對照樣本的比值， 該比值乘以對照樣本的拷貝數(shù)，得到待測樣本的拷貝數(shù)。上述技術(shù)方案的優(yōu)選方式之一為，所述通用突光引物長度范圍為18 20bp。上述技術(shù)方案的優(yōu)選方式之二為，所述嵌合特異引物和所述參照引物的長度范圍為 38 45bp。
上述技術(shù)方案的優(yōu)選方式之三為，所述多重PCR引物對應(yīng)的擴增產(chǎn)物的長度范圍為120 350bp，不同擴增產(chǎn)物片段的長度差異為8 50bp。上述技術(shù)方案的優(yōu)選方式之四為，所述嵌合特異引物和所述參照引物的3’端的特異引物序列段長度為18 20bp。上述技術(shù)方案的優(yōu)選方式之五為，所述的多重競爭性PCR引物由一到四對不同熒光標(biāo)記的通用熒光引物、一到二十五對針對相同或不同待測基因的嵌合特異引物和三到六對針對相同或不同基因的參照引物組成?；蛘咦鳛榱硪环N優(yōu)選方式，所述的多重競爭性PCR 引物由一對通用熒光引物、一到五對針對不同待測基因的嵌合特異引物和三到五對參照引物組成。上述技術(shù)方案的優(yōu)選方式之六為，所述的三到六對參照引物中至少兩對設(shè)計在常染色體上，至少一對設(shè)計在X染色體上。本發(fā)明的技術(shù)方案之二是提供上述的分析方法在檢測基因拷貝數(shù)變異中的應(yīng)用。本發(fā)明的技術(shù)方案之二是一種基于上述的分析方法的試劑盒，提供通用熒光引物、嵌合特異引物、參照引物和定量的內(nèi)對照DNAjP /或多重競爭性PCR的反應(yīng)的試劑。本發(fā)明在總結(jié)現(xiàn)有技術(shù)中各種檢測方法的優(yōu)缺點基礎(chǔ)上，經(jīng)過自主創(chuàng)新研發(fā)，成功地試用于應(yīng)用于生物科學(xué)研究與臨床分子診斷等領(lǐng)域，并且有廣泛的潛在應(yīng)用市場。本發(fā)明令人驚奇地發(fā)現(xiàn)具有以下優(yōu)點I、成本低。針對所有的檢測位點，應(yīng)用了通用熒光引物，并采用同一的參照區(qū)段， 這些措施都大大降低了實驗成本。2、實驗周期短。相對于MLPA技術(shù)(需要兩天)來講，一天內(nèi)就可以得到實驗結(jié)果。 可對少量樣本多個基因進(jìn)行同時檢測，大大縮短了實驗周期，提高了實驗效率。3、數(shù)據(jù)更準(zhǔn)確。本發(fā)明中使用了通用熒光引物，而引物的3’端統(tǒng)一為Ct兩個堿基，保證了不同位點擴增的同步性和起始效率的一致性。


圖I為一個參照區(qū)段和三個目標(biāo)區(qū)段的多重PCR的試驗結(jié)果。圖2為圖I的多重PCR的試驗的原理示意圖(分析過程中涉及兩組引物一組是多重上下游嵌合特異引物；另一組是熒光通用引物)。圖3為實施例I中樣本檢測結(jié)果示意圖。
具體實施例方式下面結(jié)合具體實施例，進(jìn)一步闡明本發(fā)明，應(yīng)理解，實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明講授的內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價形式有同樣落于本申請所附權(quán)利要求書所限定的范圍。實施例I利用本發(fā)明所述的方法對3個轉(zhuǎn)基因小鼠(ZYJ-1、ZJY-2、ZJY_3)進(jìn)行了拷貝數(shù)的檢測，另外還包括2只C57BL/6小鼠(其中一只為雌性B6F，一只為雄性B6M)為對照樣本。實驗步驟
1、通用引物、嵌合特異引物的設(shè)計通用引物的設(shè)計設(shè)計原則保證上下游引物的TM值彡57°C，且差距不超過3°C，針對小鼠和人基因組特異，引物相互作用小，上游通用引5’端用Fam熒光標(biāo)記。通用引物序列為上游5’ -TTCATCCGTTCGTCCTAC-3’ ；下游5’ -ACAGCGTCAATCTCGTTC-3’。嵌合特異引物的設(shè)計根據(jù)小鼠轉(zhuǎn)基因的區(qū)段，我們選擇了 3個目標(biāo)基因和5個參基因區(qū)段(其中3個位于常染色個上，2個位于X染色體上)，共設(shè)計了 8對特異引物，并與通用引物組合成特異引物，且在通用引物的3’端插入ct兩個堿基，要求TM值>62°C，擴增產(chǎn)物的長度在120 350bp之間，相鄰產(chǎn)物長度的差至少為8bp。所有的引物均經(jīng)過Blast 和Oligo mask軟件的分析,從而減少非特異擴增和引物二聚體。表一目標(biāo)區(qū)段和參照區(qū)段的嵌合特異引物序列
權(quán)利要求
1. 一種基于熒光通用引物的多重競爭性PCR檢測拷貝數(shù)變異的方法，包括以下步驟(1)提供多重競爭性PCR引物，由至少一對通用熒光引物、至少一對位于待測基因上下游的嵌合特異引物和至少三對參照引物組成所述通用熒光引物長度范圍為10 25bp，5 ’端用熒光標(biāo)記，TM值彡57 °C值，且通用弓丨物對待測基因組具有特異性；所述嵌合特異引物和所述參照引物針對檢測區(qū)段和參照區(qū)段設(shè)計，TM值> 62°C，長度范圍為28 50bp，3’端為18 25bp的特異引物序列，5’端為所述通用引物序列，所述3’ 端和5’端的序列之間插入兩個堿基的固定組合；所有嵌合引物之間的TM值的差異不超過 3°C ;所述三對參照引物設(shè)計在相同或不同的參照區(qū)段上，且與待測基因無特異性匹配；所述多重競爭性PCR引物所產(chǎn)生的不同擴增產(chǎn)物片段之間有可檢出的長度差異；(2)定量合成內(nèi)對照DNA片段針對每一個待測區(qū)段和每一個參照區(qū)段的擴增產(chǎn)物片段，合成相對應(yīng)的內(nèi)對照序列，并進(jìn)行精確定量；所述內(nèi)對照序列與所述待測區(qū)段和參照區(qū)段的擴增產(chǎn)物片段相比插入或缺失2 3bp的DNA片段；(3)多重競爭性PCR的反應(yīng)過程(a)將含待測區(qū)段和參照區(qū)段的待測樣本和對照樣本分別與相等或整數(shù)倍mol數(shù)的內(nèi)對照DNA片段混合在一起，然后進(jìn)行PCR，前3 16個循環(huán)，退火溫度高于所述通用熒光引物的退火溫度，用于所述嵌合特異引物引導(dǎo)的擴增，后17 20個循環(huán)，退火溫度低于所述通用熒光引物的退火溫度，用于所述通用引物引導(dǎo)的擴增，兩組退火溫度的差距彡5°C ；(b)根據(jù)熒光標(biāo)記PCR擴增產(chǎn)物長度不同，對擴增產(chǎn)物片段進(jìn)行檢測，獲得待測樣本中待測區(qū)段和參照區(qū)段以及內(nèi)對照擴增產(chǎn)物片段的長度信息與相應(yīng)的熒光強度信息；(4)數(shù)據(jù)分析1.計算每個待測區(qū)段和參照區(qū)段的樣本峰高和/或峰面積(S)和內(nèi)對照的峰高和或峰面積(I)，得到每個待測區(qū)段和參照區(qū)段的比值(S/I)；ii.以一個參照區(qū)段的比值為標(biāo)準(zhǔn)，將所有待測區(qū)段和參照區(qū)段的比值同其作比，進(jìn)行數(shù)據(jù)內(nèi)部標(biāo)化；iii.按照i和ii的步驟將對照樣本進(jìn)行數(shù)據(jù)內(nèi)部標(biāo)化；iv.將待測樣本和對照樣本的內(nèi)部標(biāo)化值作比,獲得待測樣本與對照樣本的比值,該比值乘以對照樣本的拷貝數(shù)，得到待測樣本的拷貝數(shù)。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的分析方法，其特征在于，所述通用熒光引物長度范圍為18 20bp。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的分析方法，其特征在于，所述嵌合特異引物和所述參照引物的長度范圍為38 45bp。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的分析方法，其特征在于，所述多重PCR引物對應(yīng)的擴增產(chǎn)物的長度范圍為120 350bp，不同擴增產(chǎn)物片段的長度差異為8 50bp。
5.根據(jù)權(quán)利要求I所述的分析方法，其特征在于，所述嵌合特異引物和所述參照引物的3’端的特異引物序列段長度為18 20bp。
6.根據(jù)權(quán)利要求I所述的分析方法，其特征在于，所述的多重競爭性PCR引物由一到四對不同熒光標(biāo)記的通用熒光引物、一到二十五對針對相同或不同待測基因的嵌合特異引物和三到六對針對相同或不同基因的參照引物組成。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的分析方法，其特征在于，所述的多重競爭性PCR引物由一對通用熒光引物、一到五對針對不同待測基因的嵌合特異引物和三到五對參照引物組成。
8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的分析方法，其特征在于，所述的三到六對參照引物中至少兩對設(shè)計在常染色體上，至少一對設(shè)計在X染色體上。
9.權(quán)利要求I所述的分析方法在檢測基因拷貝數(shù)變異中的應(yīng)用。
10.一種基于權(quán)利要求I所述的分析方法的試劑盒，提供通用熒光引物、嵌合特異引物、參照引物和定量的內(nèi)對照DNAjP /或多重競爭性PCR的反應(yīng)的試劑。
全文摘要
本發(fā)明涉及基于通用熒光引物的多重競爭性PCR檢測拷貝數(shù)變異的方法，包括下列步驟(1)提供多重競爭性PCR引物，由至少一對通用熒光引物、至少一對位于待測基因上下游的嵌合特異引物和至少三對參照引物組成；(2)定量合成內(nèi)對照DNA片段；(3)多重競爭性PCR反應(yīng)過程；和(4)數(shù)據(jù)分析。本發(fā)明還提供基于以上分析方法的試劑盒，適用于5～28個基因/反應(yīng)的拷貝數(shù)變異的檢測，是一種快速、中通量、經(jīng)濟(jì)的拷貝數(shù)變異檢測方案。
文檔編號C12Q1/68GK102586456SQ20121006653
公開日2012年7月18日 申請日期2012年3月14日 優(yōu)先權(quán)日2012年3月14日
發(fā)明者李鵬翔, 肖君華, 陸炯, 陳燁, 陳軼群 申請人:上海翼和應(yīng)用生物技術(shù)有限公司