專利名稱：檢測豬鏈球菌2型的基因芯片的制備及其應用方法
技術(shù)領域：
本發(fā)明涉及生物醫(yī)學領域，特別是一種用于檢測豬鏈球菌2型的基因芯片的制備及其應用方法。
背景技術(shù)：
現(xiàn)有的豬鏈球菌檢測方法有微生物學方法、血清學鑒定及PCR檢測等。微生物學檢測方法是根據(jù)細菌的形態(tài)、培養(yǎng)特性和生化特性等進行鑒定。鏈球菌在顯微鏡下呈圓形或卵圓形，直徑小于0. 2 i! m，常成雙排列或成鏈狀。革蘭氏染色陽性，除D群個別細菌外，均無鞭毛，多數(shù)有莢膜。血瓊脂平板上可長成直徑0.1 1. 0mm，灰白色、表面光滑、邊緣整齊的小菌落，多數(shù)致病菌株具有溶血能力，溶血環(huán)的大小和類型因菌株而異。血清學的鑒定方法包括酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)、協(xié)同凝集試驗、毛細沉淀或平板凝聚試驗，其中ELISA 與協(xié)同凝集試驗的應用最為廣泛。PCR檢測方法有很強的特異性和高度的敏感性。基因芯片作為檢測手段，有高靈敏性、高度精確性、高信息量等優(yōu)點，被應用于多種微生物的檢測中，已建立有針對豬病致病菌的基因芯片的檢測方法，但需要對已點樣的芯片進行水化和預雜交處理，且所需雜交探針的濃度較高，檢測成本高。

發(fā)明內(nèi)容
針對上述情況，為解決現(xiàn)有技術(shù)之缺陷，本發(fā)明的目的就是提供一種用于檢測豬鏈球菌2型的基因芯片的制備及其應用方法，可有效解決現(xiàn)有檢測設備及方法耗時長，投入大的問題。本發(fā)明的技術(shù)方案是設計并合成引物和探針，用滅菌水溶解合成好的探針，用基因芯片點樣儀按預先設定好的程序在醛基化基片(公知市售產(chǎn)品)上接觸式點樣，制備用于檢測豬鏈球菌2型的基因芯片。本發(fā)明還提供了用于檢測豬鏈球菌2型的基因芯片的使用方法，包括以下步驟提取待測豬鏈球菌2型細菌的基因組DNA，采用不對稱PCR制備雜交用PCR產(chǎn)物，與制備好的基因芯片雜交，經(jīng)洗滌與干燥后，將芯片置于激光共聚焦掃描儀上掃描，分析結(jié)果。本發(fā)明操作簡便易行，省去了已點樣芯片的水化處理和預雜交步驟，雜交只需半小時，大大節(jié)省了時間，達到了快速檢測的目的，采用5 y m/L的探針濃度就可以達到較高的信號強度，降低了檢測成本，可用于大規(guī)模檢測。


圖1為本發(fā)明2型豬鏈球菌基因芯片點樣示意圖。
具體實施例方式以下結(jié)合實施例對本發(fā)明具體實施方式
作進一步詳細說明。一種用于檢測豬鏈球菌2型的基因芯片的制備方法，其特征在于，包括以下步驟(1)設計引物和探針以豬鏈球菌2型(菌株號為S735，GenBank序列號為AFl 18389)的cps2J基因序列為靶序列，設計特異性引物和探針，上游引物5’ -TGGAATACGCA GAGCAAGAT-3，，下游引物5’Cy3-AGCAAGTAACCCTCCCGACA-3’，探針5’NH2-TTTTTTTTTTTTTTTT-ACGG TATCAAAAATAGCACAGCAAA-3 ’，在下游引物5 ’端用Cy3進行熒光標記，探針的5 ’端進行氨基化修飾，修飾氨基和探針之間加上16個T ;
(2)對引物和探針進行合成將步驟(I)所設計的引物和探針，交公司進行合成(這是公知的合成途徑);
(3)基因芯片的制備用滅菌水溶解合成好的探針，用基因芯片點樣儀按預先設定好的程序在醛基化基片(公知市售產(chǎn)品)上接觸式點樣，點樣完畢后將芯片靜置于25-30°C烘箱干燥過夜8-12小時。 一種用于檢測豬鏈球菌2型的基因芯片的使用方法，其特征在于，包括以下步驟(I)提取待測豬鏈球菌2型細菌的基因組DNA ；
(2)雜交用PCR產(chǎn)物的制備采用不對稱PCR，先預混合反應體系中除下游引物以外的所有成份，最后在暗室中加入下游引物，混勻后置于PCR儀進行擴增，所述的反應體系為=IOXBuffer 為 2. 5 yl，上游引物(20 y M/L)為 0. 2 yl，下游引物(20 y M/L)為 0. 5 yl，dNTP(10mmol/u I)為 2. 0 y I，模板 DNA l.Ou l，ExTaq 酶為 0. 3u I, ddH20 為 18. 5 y 1，總體積為25 ill，PCR擴增反應條件為95°C預變性5 min ;95°C變性45，56°C退火45s，72 °C延伸I min，共35個循環(huán)；72°C延伸10 min ；
(3)雜交用PCR產(chǎn)物與權(quán)利要求1所述的基因芯片雜交將雜交用PCR擴增產(chǎn)物置于PCR儀上98°C變性IOmin后，立即取出冰浴5min，取PCR擴增產(chǎn)物20 U I和雜交緩沖液ISOul加于離心管中，混勻后取該混合液加到芯片的點樣區(qū)，盡量避免產(chǎn)生氣泡，將芯片放入雜交盒內(nèi)，置于42°C水浴鍋中避光雜交30min ；
(4)基因芯片的洗滌與干燥基因芯片的洗滌應在暗室中完成，雜交完畢的芯片放置在玻片架上,立即用洗液1、洗液2、洗液3各洗滌2min，離心干燥；
(5)基因芯片的結(jié)果分析將芯片置于激光共聚焦掃描儀上掃描，分析Cy3熒光信號的強度和比值。所述的引物濃度為20 U m/L。所述探針濃度為5 U m/L 一20 U m/L。點樣環(huán)境參數(shù)為相對濕度55-65%，溫度15-30°C，各探針點間距為1. 5mm,點樣陣列根據(jù)實驗要求設定。所述的雜交芯片洗滌所用洗液I為1XSSC/0. 2%SDS ;洗液2為0.1 X SSC/0. 2%SDS ;洗液 3 為 0.1 X SSC。所述的基因芯片雜交結(jié)果判定的依據(jù)如下
(1)模板DNA的PCR擴增效果良好；
(2)信號強度中位值>1000，結(jié)合雜交掃描圖像，雜交斑點清晰；
(3)檢測基因芯片雜交結(jié)果判斷時引入樣點信號閾值概念SNR，它是信號強度中位值與噪音中位值之比，當它們的比值大于或等于1. 5時，表明雜交信號良好，即SNR ^1. 5。經(jīng)試驗證明，此方法靈敏可靠。應用效果好，有關(guān)資料如下
I材料與方法1.1材料
1.1.1標準菌株來源
豬鏈球菌2型菌株(S735)由河南農(nóng)業(yè)大學惠贈。1.1. 2芯片材料
基因芯片基片采用醛基化載玻片，購自上海百傲生物科技有限公司。1.1. 3試驗儀器
基因芯片點樣儀美國Bio-Dot公司
MILIP0RE-21J0純水機美國MILIP0RE公司
YEAR2000 PCR 儀英國 Whatman Biometra 公司
DBT-07凝膠成像系統(tǒng)英國UVITEC公司
MLTRA PR080型超高速冷凍離心機德國HermLer公司
TGL-16C臺式高速低溫離心機德國Eppendorf公司
基因芯片掃描儀法國Innopsys公司
-80°C超低溫冰柜Thermo公司
UVI 紫外凝膠成像系統(tǒng)UVItec ST John’s innovation centre
YJ-875凈化工作臺蘇州凈化設備公司
SHA-C水浴恒溫振蕩器江蘇恒豐儀器廠
DYY-31A型穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀北京六一儀器廠
DBT-07凝膠成像系統(tǒng)英國UVITEC公司
PCR擴增儀Biometra公司1.1. 4主要試劑和溶液
TaKaRa Agarose Gel DNA Purification Kit Ver. 2. 0 大連寶生物工程有限公司
ExTaq 酶、DNA Marker DL2000大連寶生物工程有限公司
細菌基因組DNA提取試劑盒(離心柱型)北京索萊寶科技有限公司
Proteinase K， Tritirachium albumCALBIOCHEM
BIOffEST AGAROSESPECIFICATIONS
雜交緩沖液上海百傲生物科技有限公司LB增菌液(加有5%的小牛血清)、5X電泳儲存液(5XTBE)、1.0%瓊脂糖凝膠、100父06111^也、20\55(、10%505、基因芯片點樣緩沖液、洗脫液均由本實驗室配制，見附件
Io1. 2 方法1. 2.1細菌的培養(yǎng)
用接種環(huán)在無菌條件下取保存的細菌菌株，接種于綿羊血瓊脂平板上，37°C培養(yǎng)24小時，挑取血平板上的單個菌落接種于5ml加入5%小牛血清的LB液體培養(yǎng)基中，37°C，ISOrmpJjB^ 16小時；置于-4°C保存?zhèn)溆谩?. 2. 2細菌基因組DNA (即模板DNA)的提取及注意事項1. 2. 2.1提取細菌基因組DNA的步驟
對上述培養(yǎng)的細菌采用北京索萊寶科技有限公司的細菌基因組DNA提取(離心柱型)試劑盒提取，具體步驟如下(I)取細菌培養(yǎng)液1. 5ml, 12000rmp離心lmin，盡量吸盡上清。(2)向菌體沉淀中加入200ul溶液A，振蕩至菌體充分懸浮，或用加樣槍緩慢反復吹打數(shù)次，加入20ul終濃度為20mg/ml的溶菌酶，加入20ul 10mg/ml的RnaseA，37°C放置15min。(3)向管中加入20ul 10mg/ml的蛋白酶K，充分混勻，65°C消化30_60min，期間可顛倒離心管混勻數(shù)次，直至樣品消化完全為止。消化完全的標志是液體清亮及粘稠。(4)向管中加入200ul溶液B，充分混勻。如出現(xiàn)白色沉淀，可放65°C 15_30min，沉淀即會消失，不影響后續(xù)實驗。如溶液未變清亮，說明樣品消化不徹底，可能導致提取的DNA量少及不純，還有可能導致上柱后堵柱子。 (5)向管中加入200ul無水乙醇，顛倒混勻(此時可能會出現(xiàn)絮狀沉淀)，不影響DNA的提取，可將溶液和絮狀沉淀都加入吸附柱中，靜置2min。(6) 12000rmp離心2min，棄掉廢液，將吸附柱放入收集管中。(7)向吸附柱中加入700ul漂洗液(使用前請先檢查是否已加入無水乙醇！)，12000rmp離心lmin，棄掉廢液，將吸附柱放入收集管中。(8)向吸附柱中加入500ul漂洗液(使用前請先檢查是否已加入無水乙醇！)，12000rmp離心lmin，棄掉廢液，將吸附柱重新放入收集管中。(9) 12000rmp離心2min,將吸附柱置于室溫或50°C溫箱放置數(shù)分鐘，目的是將吸附柱中殘余的漂洗液去除，否則漂洗液中的乙醇會影響后續(xù)的實驗如酶切、PCR等。(10)將吸附柱放入一個干凈的離心管中，向吸附膜中央懸空滴加50_200ul經(jīng)65°C水浴預熱的洗脫液,室溫放置5min, 12000rmp離心2min。(11)將離心所得洗脫液重新加入離心吸附柱中，室溫放置2min，12000rmp離心2min，
即可得到高質(zhì)量的細菌基因組DNA。1. 2. 2. 2提取過程中的注意事項
(I)細菌培養(yǎng)液應避免反復凍融，最好用新培養(yǎng)的，否則會導致提取的DNA片段較小且提取量也下降。(2)若溶液A或溶液B中有沉淀，可在37°C水浴中重新溶解，不影響實驗結(jié)果。(3)如果菌體沉淀消化不徹底，后imd離心步驟中可能會出現(xiàn)堵柱子的現(xiàn)象，可適當延長離心時間。(4)洗脫緩沖液的體積最好不少于50ul，體積過小會影響回收效率；洗脫液的pH值對洗脫效率也有影響，若用水做洗脫液應保證其PH值在8. O左右(可用NaOH將水的pH值調(diào)至此范圍)，pH值低于7. O會降低洗脫效率；回收的DNA產(chǎn)物應保存在-20°C，以防DNA降解。1. 2. 3引物的設計與合成
參照文獻，以豬鏈球菌2型(菌株號為S735，GenBank序列號為AF118389)的cps2J基因序列為祀序列，利用Primer Premier 5. O軟件設計特異性引物和探針。上游引物5’ -TGGAATACGCAGAGCAAGAT-3’，下游引物5’ Cy3_AGCAAGTAACCCTCCCGACA_3’ ；探針5’ NH2_TTTTTTTTTTTTTTTT_ACGGTATCAAAAATAGCACAGCAAA_3,。在下游引物 5’端用 Cy3 進行熒光標記，探針的5’端進行氨基化修飾，修飾氨基和探針之間加上16個T。引物和探針均由上海生工公司合成。先用滅菌水將合成好的凍干引物稀釋成IOOil M/L的母液，再稀釋為20 u M/L的濃度置于_20°C凍存?zhèn)溆谩?. 2. 4基因芯片的制備
先用滅菌水將合成好的凍干探針稀釋成100um/L的母液，再依次稀釋成5um/L (5ul探針+45ul滅菌水+50ul點樣緩沖液)、10um/L(10ul探針+40ul滅菌水+50ul點樣緩沖液)、20um/L (20ul探針+30ul滅菌水+50ul點樣緩沖液)。在96孔U形板的Al孔加入IOOul點樣緩沖液作空白對照，B1、Cl、Dl孔分別加入IOOul 5um/L、10um/L、20um/L的探針，使用美國Bio-Dot公司的AD1500基因芯片點樣儀按預先設定好的程序在醛基化基片上接觸式點樣。點樣環(huán)境參數(shù)為相對濕度55-65%，溫度15-30°C，各探針點間距為1. 5mm，點樣陣列根據(jù)實驗要求設定為四個矩陣，每個矩陣點樣為7X3，點樣完畢的芯片靜置于30°C烘箱干燥過夜備用。芯片點樣示意圖見圖1;1. 2. 5雜交用PCR產(chǎn)物的制備與鑒定 對反應條件和參數(shù)逐個進行優(yōu)化，確立最佳濃度和擴增反應條件，雜交用產(chǎn)物需采用不對稱PCR。反應總體積為25ul，其組成如下
IOXBuffer2. 5ul
dNTP(10mmol/ul)2. Oul
上游引物(20 ii M/L)0. 2ul
下游引物(20 ii M/L)0. 5ul
模板 DNA1. Oul
ExTaq 酶0. 3ul
ddH2018. 5ul
Total25.Oul
試驗時先預混合上述反應體系中除下游引物以外的所有成份，最后在暗室中加入下游引物，混勻后置于PCR儀進行擴增。PCR擴增反應條件為95°C預變性5 min，(95°C變性45s，56°C退火45s，72°C延伸I min,共35個循環(huán))72°C延伸10 min。取PCR擴增產(chǎn)物5ul與Iul 6 X Lording Buffer，用IOul移液器混合均勻后，將槍頭小心深入到加樣孔中，注意不要伸到孔底部，以免穿透加樣孔而導致樣品外溢，緩慢推出使樣品垂直落入加樣孔中。加樣結(jié)束后,蓋上電泳槽蓋,調(diào)節(jié)電壓為5v/cm(80v),關(guān)閉電泳室燈光,避光電泳20min。待電泳結(jié)束后，小心取出凝膠放置于UVI凝膠成像系統(tǒng)中，觀察結(jié)果并拍照保存。1. 2. 6基因芯片的雜交
將PCR擴增產(chǎn)物置于PCR儀上98°C變性IOmin后，立即取出冰浴5min，取PCR擴增產(chǎn)物20ul和雜交緩沖液ISOul加于離心管中，混勻后取該混合液加到芯片的點樣區(qū)，盡量避免產(chǎn)生氣泡，將芯片放入雜交盒內(nèi)，置于42°C水浴鍋中避光雜交30min。1.2.7基因芯片的洗滌和干燥
芯片的洗滌應在暗室中完成。雜交完畢的芯片放置在玻片架上，立即用洗液1、洗液2、洗液3各洗滌2min，離心干燥后即可用于掃描分析。1. 2. 8基因芯片的掃描及掃描結(jié)果分析將芯片置于InnoScan 700A高性能激光共聚焦掃描儀上掃描，如果背景較高可用洗液3 (I X SSC)再洗滌一次，以TIF格式保存圖像，然后再另存為為JPG格式圖片。用MAPIX軟件分析Cy3熒光信號的強度和比值，用以下三個條件作為基因芯片雜交結(jié)果判定的依據(jù)
(1)模板DNA的PCR擴增效果良好；
(2)信號強度中位值>1000，結(jié)合雜交掃描圖像，雜交斑點清晰(清晰程度和雜交條件有很大關(guān)系)；
(3)檢測基因芯片雜交結(jié)果判斷時引入樣點信號閾值概念SNR，它是信號強度中位值與噪音中位值之比，當它們的比值大于或等于1. 5時，表明雜交信號良好，即SNR ^1. 5。
·
本發(fā)明工藝簡單，能對豬鏈球菌2型進行快速、靈敏的檢測，經(jīng)試驗取得了滿意的效果，有關(guān)試驗結(jié)果如下1、PCR擴增結(jié)果
以2型豬鏈球菌基因組DNA為模板，與其特異性引物進行不對稱PCR擴增，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分析擴增片段大小約為209bp，與預計目的片段相同，特異性較好。2.2基因芯片雜交結(jié)果
不對稱PCR擴增產(chǎn)物置于PCR儀上95°C變性IOmin后，立即冰浴5min，取該產(chǎn)物20ul和雜交緩沖液ISOul加于離心管中充分混合均勻，將該混合液全部加到芯片點樣區(qū)，將芯片放入雜交盒內(nèi)，置于42°C水浴鍋避光雜交30min。雜交結(jié)果經(jīng)掃描儀掃描，各雜交斑點的SNR值均大于1. 5。結(jié)果表明，采用m/L的探針濃度就可以達到較高的信號強度，從而降低了檢測成本，可用于大規(guī)模檢測。本發(fā)明操作簡便易行，省去了已點樣芯片的水化處理和預雜交步驟，雜交只需半小時，大大節(jié)省了時間，達到了快速檢測的目的，采用5 y m/L的探針濃度就可以達到較高的信號強度，降低了檢測成本，可用于大規(guī)模檢測。
權(quán)利要求
1.一種用于檢測豬鏈球菌2型的基因芯片的制備方法，其特征在于，包括以下步驟(1)設計引物和探針以豬鏈球菌2型的CPS2J基因序列為靶序列，設計特異性引物和探針，上游引物5’ -TGGAATACGCAGAGCAAGAT-3’，下游引物5’ Cy3_AGCAAGTAACCCTCCCG ACA-3’，探針5’ NH2-mmTTITnTTTT-ACGGTATCAAAAATAGCACAGCAAA-3’，在下游引物 5’ 端用Cy3進行熒光標記，探針的5’端進行氨基化修飾，修飾氨基和探針之間加上16個T ;(2)按常規(guī)方法對引物和探針進行合成；(3)基因芯片的制備用滅菌水溶解合成好的探針，用基因芯片點樣儀(按預先設定好的程序)在醛基化基片上接觸式點樣，點樣完畢后將芯片靜置于25-30°C烘箱干燥過夜8-12 小時。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于檢測豬鏈球菌2型的基因芯片的制備方法，其特征在于， 所述的引物濃度為20yM/L。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于檢測豬鏈球菌2型的基因芯片的制備方法，其特征在于， 所述探針濃度為5 μ M/L — 20 μ M/L。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于檢測豬鏈球菌2型的基因芯片的制備方法，其特征在于， 點樣環(huán)境參數(shù)為相對濕度55-65%，溫度15-30°C，各探針點間距為1. 5mm,點樣陣列根據(jù)實驗要求設定。
5.一種用于檢測豬鏈球菌2型的基因芯片的應用方法，其特征在于，包括以下步驟(1)提取待測豬鏈球菌2型細菌的基因組DNA；(2)雜交用PCR產(chǎn)物的制備采用不對稱PCR，先預混合反應體系中除下游引物以外的所有成份，最后在暗室中加入下游引物，混勻后置于PCR儀進行擴增，所述的反應體系為10XBuffer 為 2. 5 μ 1，上游引物(20 μ M/L)為 O. 2 μ 1，下游引物(20 μ M/L)為 O. 5 μ 1， dNTP(10mmol/y I)為 2. O μ I，模板 DNA1. O μ l，ExTaq 酶為 O. 3 μ LddH2O^ 18. 5 μ I,PCR 擴增反應條件為95°C預變性5 min ;95°C變性45，56°C退火45s，72。。延伸I min，共35個循環(huán)；72°C延伸10 min ；(3)雜交用PCR產(chǎn)物與權(quán)利要求1所述的基因芯片雜交將雜交用PCR擴增產(chǎn)物置于PCR儀上98°C變性IOmin后，立即取出冰浴5min，取PCR擴增產(chǎn)物20 μ I和雜交緩沖液 180 μ I加于離心管中，混勻后取該混合液加到芯片的點樣區(qū)，盡量避免產(chǎn)生氣泡，將芯片放入雜交盒內(nèi)，置于42°C水浴鍋中避光雜交30min ；(4)基因芯片的洗滌與干燥基因芯片的洗滌應在暗室中完成，雜交完畢的芯片放置在玻片架上,立即用洗液1、洗液2、洗液3各洗滌2min，離心干燥；(5)基因芯片的結(jié)果分析將芯片置于激光共聚焦掃描儀上掃描，分析Cy3熒光信號的強度和比值，基因芯片雜交結(jié)果判定的依據(jù)如下模板DNA的PCR擴增效果良好；信號強度中位值> 1000，結(jié)合雜交掃描圖像，雜交斑點清晰；檢測基因芯片雜交結(jié)果判斷時引入樣點信號閾值概念SNR，它是信號強度中位值與噪音中位值之比，當它們的比值大于或等于1.5時，表明雜交信號良好，即SNR彡1.5。
6.根據(jù)權(quán)利要求2所述的用于檢測豬鏈球菌2型的基因芯片的使用方法，其特征在于， 所述的雜交芯片洗滌所用洗液I為I X SSC和O. 2%SDS ;洗液2為O.1 X SSC和O. 2%SDS ;洗液 3 為 O.1XSSC0
全文摘要
本發(fā)明涉及用于檢測豬鏈球菌2型的基因芯片的制備及其應用方法，可有效解決現(xiàn)有檢測設備及方法耗時長，投入大的問題，其技術(shù)方案是設計并合成引物和探針，用滅菌水溶解合成好的探針，用基因芯片點樣儀按預先設定好的程序在醛基化基片上接觸式點樣，制備用于檢測豬鏈球菌2型的基因芯片，其使用方法是，提取待測豬鏈球菌2型細菌的基因組DNA，采用不對稱PCR制備雜交用PCR產(chǎn)物，與制備好的基因芯片雜交，經(jīng)洗滌與干燥后，將芯片置于激光共聚焦掃描儀上掃描，分析結(jié)果，本發(fā)明操作簡便易行，省去了已點樣芯片的水化處理和預雜交步驟，雜交只需半小時，大大節(jié)省了時間，采用5μm/L的探針濃度就可以達到信號強度，檢測成本低，可用于大規(guī)模檢測。
文檔編號C12Q1/68GK103014144SQ20121006468
公開日2013年4月3日 申請日期2012年3月13日 優(yōu)先權(quán)日2012年3月13日
發(fā)明者李文剛, 劉玲玲, 唐桂芬, 張春霞, 吳鳳筍, 程亞樓 申請人:鄭州牧業(yè)工程高等專科學校