專利名稱：一種用于染色體整合、進(jìn)化的表達(dá)質(zhì)粒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物工程領(lǐng)域，具體涉及一種用于染色體整合、進(jìn)化的表達(dá)質(zhì)粒，以及其構(gòu)建方法。
背景技術(shù)：
利用基因工程微生物生產(chǎn)有用物質(zhì)已成為物質(zhì)制造的新的模式。目前，通常采用含目的基因的質(zhì)粒表達(dá)系統(tǒng)來構(gòu)建工程微生物。但是這種質(zhì)粒表達(dá)系統(tǒng)往往有存在質(zhì)粒易丟失、不穩(wěn)定、且質(zhì)粒的存在又將增加宿主菌的代謝負(fù)擔(dān)。更為嚴(yán)重的是質(zhì)粒往往又含有抗生素抗性篩選標(biāo)記，這將嚴(yán)重影響環(huán)境污染問題，導(dǎo)致環(huán)境中抗生素耐藥菌泛濫，從而限制了含質(zhì)粒的工程菌的工業(yè)化進(jìn)程。為了解決質(zhì)粒表達(dá)系統(tǒng)的上述缺陷，將目的基因整合到微生物染色體上是一個非常有效的方法。為此，許多科學(xué)家研發(fā)了許多質(zhì)粒來整合基因到染色體上。美國普渡大學(xué)Haldimarm and Wanner (2001)開發(fā)了一系列條件復(fù)制整合調(diào)節(jié)(CRIM)質(zhì)粒， 利用該質(zhì)?？蓪⑹孪冗B接到質(zhì)粒上的目的基因，通過簡單的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化，單拷貝地整合到大腸桿菌染色體上特定的噬菌體整合位點(diǎn)上(Haldimann，Α.，Wanner, B. L. Journal of Bacteriology. 2001,183 :6384-6393)。但是，利用這些質(zhì)粒整合基因到大腸桿菌的染色體上后，質(zhì)粒上的抗生素抗性篩選標(biāo)記和復(fù)制子仍然保留在染色體上。所構(gòu)建的工程菌仍然存在抗生素抗性篩選標(biāo)記導(dǎo)致環(huán)境中耐藥菌泛濫的問題。為克服他們的質(zhì)粒缺陷， 臺灣Chiang et al.在他們工作的基礎(chǔ)上有開發(fā)了一系列用于基因整合的質(zhì)粒，應(yīng)用這些質(zhì)粒同樣可將事先連接到質(zhì)粒上的目的基因，通過簡單的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化，單拷貝地整合到大腸桿菌染色體上特定的噬菌體整合位點(diǎn)上，而且所得到的工程菌不含抗生素抗性篩選標(biāo)記和復(fù)制子，可用于工業(yè)化生產(chǎn)(Chiang, C. -J.，Chen, P. Τ.，Chao, Y. P. Biotechnology Bioengineering 2008,101 :985-995)。但是，上述2個團(tuán)隊(duì)的質(zhì)粒都只能將目的基因單拷貝地整合到大腸桿菌的染色體上，而實(shí)際工作中往往需要整合多拷貝的基因以提高基因的表達(dá)水平，從而提高微生物的生產(chǎn)能力。為此，美國麻省理工學(xué)院Tyod et al.開發(fā)了一種可提高整合基因拷貝數(shù)的質(zhì)粒PTGD，利用λ hCh基因組整合技術(shù)，將質(zhì)粒上的目的基因整合到大腸桿菌染色體上后，因質(zhì)粒上攜帶了抗生素抗性基因(與目的基因串列在一起)， 可利用所謂的化學(xué)誘導(dǎo)染色體進(jìn)化技術(shù)，提高目的基因在染色體上的拷貝數(shù)(Tyo，K. Ε. J.， Ajikumar, P. K. ， Stephanopoulos, G. Nature Biotechnology 2009,27 :760_765) 。 #^111^ 得到的工程菌雖然基因的拷貝數(shù)因化學(xué)誘導(dǎo)染色體進(jìn)化得到了增加，但是他們使用的基因整合技術(shù)是λ InCh基因組整合技術(shù)，需要4個步驟，比較復(fù)雜，不利于工業(yè)應(yīng)用，而且工程菌仍然含有抗生素抗性篩選標(biāo)記，不適合于工業(yè)化生產(chǎn)。

發(fā)明內(nèi)容
針對現(xiàn)有技術(shù)中所存在的不足，本發(fā)明的目的是提供一種用于染色體整合、進(jìn)化的表達(dá)質(zhì)粒。該表達(dá)質(zhì)?？梢酝ㄟ^直接質(zhì)粒轉(zhuǎn)化將目的基因插入工程菌的染色體中，并可以通過化學(xué)誘導(dǎo)提高目的基因在染色體上的拷貝數(shù)。本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是一種用于染色體整合、進(jìn)化的表達(dá)質(zhì)粒，含有2個FRT位點(diǎn)(可被FLP重組酶識別)、抗性篩選基因a、復(fù)制子、噬菌體整合位點(diǎn)(attP)、啟動子(P)及其后面的多克隆位點(diǎn) (MCS)、終止子(TTR)、用于誘導(dǎo)染色體進(jìn)化過程的抗性篩選基因β、及啟動子與抗性篩選基因β兩側(cè)連接的2個異源的核苷酸序列相同片段Al和Α2，抗性篩選基因a與抗性篩選基因β為不同的抗性基因。優(yōu)選的，所述質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)為在兩個FRT位點(diǎn)的一側(cè)按順時針方向依次含有片段 Al、啟動子(P)及其后面的多克隆位點(diǎn)(MCS)、終止子(TTR)、用于誘導(dǎo)染色體進(jìn)化過程的抗性篩選基因β、片段Α2、噬菌體整合位點(diǎn)(attP)，在兩個FRT位點(diǎn)的另一側(cè)則含有抗性篩選基因a和復(fù)制子(如圖1所示)。優(yōu)選的，所述抗性篩選基因a為卡那霉素抗性基因(kan)。優(yōu)選的，所述復(fù)制子為大腸桿菌的條件復(fù)制子(ori Ry)0優(yōu)選的，所述噬菌體整合位點(diǎn)(attP)為attPp attPP21、attPA、attP$80 和 attPP22 中的任一種。優(yōu)選的，所述啟動子為 PT5、PT7、Ptac、Ptrc、Plac、ΡβΑ 、FVtet、^Vlac 等啟動子中的任一種。優(yōu)選的，所述用于誘導(dǎo)染色體進(jìn)化過程的抗性篩選基因β為三氯生抗性基因 (fabl)、氯霉素抗性基因(cat)、氨芐青霉素抗性基因(b/a)、慶大霉素抗性基因(gen)、甲氧芐氨嘧啶抗性基因(dhfr)、壯觀霉素抗性基因(aadA)、鏈霉素抗性基因(aadA)、四環(huán)素抗性基因(tetA)、乳酸菌素抗性基因中的任一種。進(jìn)一步優(yōu)選的，所述用于誘導(dǎo)染色體進(jìn)化過程的抗性篩選基因β為三氯生抗性基因(fabl)，由于fabl基因是大腸桿菌本身編碼編碼烯酰-乙?；d體蛋白還原酶的基因，因此本質(zhì)粒轉(zhuǎn)化得到的基因工程菌不會引起環(huán)境中抗生素耐藥菌泛濫，適合于工業(yè)化生產(chǎn)。優(yōu)選的，所述Al、A2片段為來自于除大腸桿菌外的異源片段，在大腸桿菌中的同源性低且不表達(dá)，大小為800 12001Λρ，可來自于除大腸桿菌外的任何生物。優(yōu)選的，以上所述表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的宿主菌為大腸桿菌(Escherichia coli)。本發(fā)明的有益效果在于(1)應(yīng)用本發(fā)明的質(zhì)?？赏ㄟ^質(zhì)粒轉(zhuǎn)化將基因整合到大腸桿菌染色體上特定的噬菌體整合位點(diǎn)，然后在化學(xué)誘導(dǎo)下進(jìn)行染色體進(jìn)化，以提高整合基因在染色體上的拷貝數(shù)，從而構(gòu)建無質(zhì)粒甚至無抗生素抗性篩選標(biāo)記、多拷貝數(shù)的重組大腸桿菌，以生產(chǎn)有用物質(zhì)；(2)應(yīng)用本發(fā)明的質(zhì)粒的基因整合步驟簡單、效率高。所構(gòu)建的工程菌因目的基因整合到染色體上，傳代過程中不會丟失，遺傳穩(wěn)定性高，從而導(dǎo)致生產(chǎn)性能穩(wěn)定；(3)應(yīng)用三氯生誘導(dǎo)染色體進(jìn)化質(zhì)粒pXKF3I^b所構(gòu)建的工程菌不含抗生素抗性標(biāo)記，不會引起環(huán)境中抗生素耐藥菌泛濫的問題，適于工業(yè)化生產(chǎn)，生產(chǎn)的產(chǎn)品安全。


圖1是本發(fā)明用于染色體整合、進(jìn)化的表達(dá)質(zhì)粒的物理圖譜；
圖2是實(shí)施例1用于染色體整合、氯霉素誘導(dǎo)染色體進(jìn)化的質(zhì)粒pXKF3I^b的物理圖譜；圖3是實(shí)施例2用于基因整合、三氯生誘導(dǎo)染色體進(jìn)化的質(zhì)粒pXKF3I^b的物理圖譜。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步的說明，但并不局限于此。以下實(shí)施例中所采用的分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)包括PCR擴(kuò)增、質(zhì)粒提取、質(zhì)粒轉(zhuǎn)化、 DNA片段連接、酶切、凝膠電泳等都采用常規(guī)的方法，具體可參見《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》(第三版)(Sambrook J, Russell Dff, Janssen K, Argentine J.黃培堂等譯，2002，北京科學(xué)出版社)。以下實(shí)施例中所用到的引物見表1。表 權(quán)利要求
1.一種用于染色體整合、進(jìn)化的表達(dá)質(zhì)粒，含有2個FRT位點(diǎn)、抗性篩選基因a、復(fù)制子、啟動子(P)及其后面的多克隆位點(diǎn)(MCS)、終止子(TTR)、用于誘導(dǎo)染色體進(jìn)化過程的抗性篩選基因β、噬菌體整合位點(diǎn)fei^)、及啟動子與抗性篩選基因β兩側(cè)連接的2個異源的核苷酸序列相同片段Al和Α2，抗性篩選基因a與抗性篩選基因β為不同的抗性基因。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的表達(dá)質(zhì)粒，其特征在于，在兩個FRT位點(diǎn)的一側(cè)按順時針方向依次含有片段Al、啟動子(P)及其后面的多克隆位點(diǎn)(MCS)、終止子(TTR)、用于誘導(dǎo)染色體進(jìn)化過程的抗性篩選基因β、片段Α2、噬菌體整合位點(diǎn)似爐)，在兩個FRT位點(diǎn)的另一側(cè)則含有抗性篩選基因a和復(fù)制子。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的表達(dá)質(zhì)粒，其特征在于，所述抗性篩選基因a為卡那霉素抗性基因(kan)。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的表達(dá)質(zhì)粒，其特征在于，所述復(fù)制子為大腸桿菌的條件復(fù)制子{ori Ry)。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的表達(dá)質(zhì)粒，其特征在于，所述噬菌體整合位點(diǎn)、attP、為 attPm,attP 2l、attJ\ WttPw^l attP 22 中的任一禾中。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的表達(dá)質(zhì)粒，其特征在于，所述啟動子為P 、P 、P&、Pirc、Pla。、 ΡβΑΒ、^Ltet Λ fVlac 等啟動子中的任一種。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的表達(dá)質(zhì)粒，其特征在于，所述用于誘導(dǎo)染色體進(jìn)化過程的抗性篩選基因β為三氯生抗性基因(/ 力/人氯霉素抗性基因(⑵ 人氨芐青霉素抗性基因(力&)、慶大霉素抗性基因(^/？)、甲氧芐氨嘧啶抗性基因(逾/r)、壯觀霉素抗性基因 Ca3說)、鏈霉素抗性基因Caa說)、四環(huán)素抗性基因(teM)、乳酸菌素抗性基因中的任一種。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的表達(dá)質(zhì)粒，其特征在于，所述Al、A2片段為來自于除大腸桿菌外的其他生物的異源片段，在大腸桿菌中的同源性低且不表達(dá)，大小為80(Γ 2001Λρ。
9.根據(jù)權(quán)利要求廣8任一項(xiàng)所述的表達(dá)質(zhì)粒，其特征在于，所述表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的宿主菌為大腸桿菌(Escherichia coli)。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種用于染色體整合、進(jìn)化的表達(dá)質(zhì)粒，其含有2個FRT位點(diǎn)、抗性篩選基因a、復(fù)制子、噬菌體整合位點(diǎn)(attP)、啟動子(P)及其后面的多克隆位點(diǎn)(MCS)、終止子(TTR)、用于誘導(dǎo)染色體進(jìn)化過程的抗性篩選基因β、及啟動子與抗性篩選基因β兩側(cè)連接的2個異源的核苷酸序列相同片段A1和A2，抗性篩選基因a與抗性篩選基因β為不同的抗性基因。該表達(dá)質(zhì)?？梢酝ㄟ^簡單的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化將目的基因插入工程菌的染色體中，并可以通過化學(xué)誘導(dǎo)提高目的基因在染色體上的拷貝數(shù)，且操作簡單，大大提高了目標(biāo)產(chǎn)物的生產(chǎn)效率，適合于工業(yè)化生產(chǎn)。另外，所構(gòu)建的工程菌因目的基因整合到染色體上，傳代過程中不會丟失，遺傳穩(wěn)定性高，生產(chǎn)性能穩(wěn)定。
文檔編號C12N15/63GK102559729SQ20121006004
公開日2012年7月11日 申請日期2012年3月8日 優(yōu)先權(quán)日2012年3月8日
發(fā)明者劉建忠, 崔艷艷, 陳韻妍, 黃明濤 申請人:中山大學(xué)