專利名稱：高產(chǎn)酯的東方伊薩酵母菌、其組合物和應(yīng)用的制作方法
高產(chǎn)酯的東方伊薩酵母菌、其組合物和應(yīng)用發(fā)明所屬領(lǐng)域
本發(fā)明屬于白酒釀造領(lǐng)域，具體地說(shuō)，本發(fā)明涉及高產(chǎn)酯的東方伊薩酵母菌、含該菌的釀酒菌劑組合物，及該酵母菌和其組合物在白酒釀造中的應(yīng)用
背景技術(shù)：
中國(guó)白酒香味物質(zhì)種類繁多，包括醇、醛、酮、酸、酯、縮醛、芳香族化合物、含氮化合物、 含硫化合物、醚類、內(nèi)酯類等化合物達(dá)數(shù)百種之多(莊名揚(yáng)，釀酒，2007，34 (2) :109-113)。 中國(guó)白酒風(fēng)味物質(zhì)的形成，是微生物代謝的產(chǎn)物，同時(shí)也是原料中基本組分及非基本組分， 在各類生物酶的直接或間接催化下的生物合成、非酶促化學(xué)反應(yīng)和熱降解反應(yīng)等多種因素共同作用結(jié)果。白酒的風(fēng)味與釀造微生物及釀造工藝也有直接關(guān)系。釀造基酒質(zhì)量的聞低對(duì)廣品的最終質(zhì)量的好壞起決定性的作用。白酒釀造中的生香酵母又稱產(chǎn)酯酵母，主要屬于產(chǎn)膜酵母和假絲酵母，大多為異型漢遜酵母及少數(shù)小圓型酵母屬，是白酒和黃酒發(fā)酵產(chǎn)香的重要菌種(熊子書，釀酒科技，2002，5 :19-21)。濃香型白酒以己酸乙酯為主的復(fù)合香，是由梭狀芽孢桿菌，俗稱己酸菌的作用，產(chǎn)于泥質(zhì)發(fā)酵老窖或人工培養(yǎng)泥窖中，發(fā)酵周期長(zhǎng)；清香型白酒以醋酸乙酯為主體香，在小曲、麩曲或液態(tài)法白酒中添加生香酵母，在發(fā)酵過(guò)程中生成醋酸及其乙酯。酒精發(fā)酵過(guò)程中酯的產(chǎn)生量與特殊的酵母菌種類有密切關(guān)系。白酒發(fā)酵要求釀酒菌劑具有產(chǎn)酯率高、產(chǎn)酒精率高并耐高溫。重量和質(zhì)量相同的原料使用不同的釀酒菌劑，形成不同的酒精產(chǎn)量和酯含量。好的釀酒菌劑使同樣的原料酒精產(chǎn)量高、富含酯類，并使白酒純香。但傳統(tǒng)大曲雖然產(chǎn)酯率高，產(chǎn)酒率卻較低，特別是大曲構(gòu)成成份復(fù)雜，使白酒質(zhì)量不穩(wěn)定；而單個(gè)酵母菌或釀酒菌劑組合物不耐高溫，雖發(fā)酵產(chǎn)酒率高但產(chǎn)酯率低，白酒品質(zhì)較差。酒精發(fā)酵過(guò)程中酯的產(chǎn)生量與特殊的酵母菌種類有密切關(guān)系。乙酸乙酯的產(chǎn)生量高低被普遍認(rèn)為是依賴于酯的合成和酯的水解之間的平衡。在最新審定通過(guò)的中國(guó)兼香型白酒國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)中，總酯含量(以乙酸乙酯計(jì))是劃分白酒等級(jí)的重要指標(biāo)，優(yōu)級(jí)酒總酯含量比一級(jí)酒高I倍(熊小毛等，2009)。如何提高白酒中總酯含量，提高白酒等級(jí)是白酒企業(yè)和研究者面對(duì)的技術(shù)難題。在中國(guó)專利CN201010520135. 2中公開了一株?yáng)|方伊薩酵母菌Z1，核菌耐42°C高溫，液體發(fā)酵乙酸乙酯產(chǎn)量達(dá)229. 06毫克/升，液體發(fā)酵產(chǎn)物酒精度可達(dá)5. 2%。但總酯含量和發(fā)酵產(chǎn)物酒精度仍然偏低，在品酒感覺中，采用100分制，品酒分?jǐn)?shù)在75-88，口感不甚
理相發(fā)明技術(shù)內(nèi)容
本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種新的高產(chǎn)酯東方伊薩酵母菌株，該菌株不但耐高溫，更重要的是高產(chǎn)酯和發(fā)酵產(chǎn)物酒精度高，使用該菌株發(fā)酵生產(chǎn)白酒，具有高產(chǎn)酯率和高酒精產(chǎn)率，品酒分?jǐn)?shù)在90-95，并形成濃醬兼香型白酒獨(dú)特風(fēng)味。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種含有東方伊薩酵母菌的釀酒菌劑組合物。
本發(fā)明的再一個(gè)目的是提供制備釀酒菌劑組合物的方法。本發(fā)明的再一個(gè)目的是提供東方伊薩酵母菌株在白酒發(fā)酵中的應(yīng)用。本發(fā)明的再一個(gè)目的是提供釀酒菌劑組合物在白酒發(fā)酵中的應(yīng)用。本發(fā)明公開了一株新的高產(chǎn)酯東方伊薩酵母菌，其特征在于，該菌株為東方伊薩酵母Z19株(Issatchenkia orientalis Z19),保藏于湖北省武漢市武漢大學(xué)校內(nèi)的中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號(hào)為CCTCC M2011499，保藏日期是2011年12月31日。東方伊薩酵母Z19株從湖北白云邊酒池分離經(jīng)篩選獲得。該菌株有如下特征東方伊薩酵母Z19 株可耐42°C高溫，液體發(fā)酵乙酸乙酯產(chǎn)量高達(dá)270. 29毫克/升，液體發(fā)酵產(chǎn)物酒精度可達(dá)
5.98%。即東方伊薩酵母Z19株不但具有耐高溫性能，更具有乙酸乙酯產(chǎn)力強(qiáng)，且較強(qiáng)的產(chǎn)酒精能力。使用該菌株發(fā)酵生產(chǎn)白酒，具有高產(chǎn)酯率和高酒精產(chǎn)率，品酒分?jǐn)?shù)在90-95，并形成濃醬兼香型白酒獨(dú)特風(fēng)味。東方伊薩酵母Z19株形態(tài)特征是菌落乳白色、形狀為規(guī)則圓形、表面較平坦、干燥，培養(yǎng)較長(zhǎng)時(shí)間后，芽生孢子延長(zhǎng)呈梳妝交錯(cuò)，假菌絲分支分布，細(xì)胞呈圓形或橢圓形。東方伊薩酵母Z19株生化特征是可發(fā)酵利用果糖，蔗糖；不能發(fā)酵利用D-半乳糖，纖維二糖，綿子糖，D-阿拉伯糖，L-阿拉伯糖，D-海藻糖，L-鼠李糖，L-山梨糖和D-木糖。東方伊薩酵母Z19株耐高溫及生長(zhǎng)特征與Zl相似YPD平板上劃線接種，分別在 33°C至42°C下培養(yǎng)均生長(zhǎng)良好。在37°C培養(yǎng)時(shí)，菌株Z19在YPD培養(yǎng)基中延遲期明顯比生香產(chǎn)酯酵母菌短，在早期的生長(zhǎng)中具有明顯的優(yōu)勢(shì)，而市售生香產(chǎn)酯酵母菌一安琪生香活性干酵母具有較長(zhǎng)的延遲期。東方伊薩酵母Z19株耐酒精能力特征是接種菌種到酒精度0-14%的YPD液體培養(yǎng)基中，30°C搖床培養(yǎng)24小時(shí)，OD63tol測(cè)定酵母菌的生長(zhǎng)濃度，東方伊薩酵母Z19株最高耐受酒精度為10%，表明酵母菌Z19的耐酒精能力好。東方伊薩酵母Z19株26S rDNA D1/D2區(qū)域基因序列分析顯示東方伊薩酵母Z19 株與東方伊薩酵母NRRL Y-5396株的同源性超過(guò)99%。東方伊薩酵母Z19株可耐42°C高溫，液體發(fā)酵乙酸乙酯產(chǎn)量高達(dá)270. 29毫克/ 升，液體發(fā)酵產(chǎn)物酒精度可達(dá)5. 98%。本發(fā)明還公開了一種含東方伊薩酵母Z19株菌的釀酒菌劑組合物，該釀酒菌劑組合物主要成份是東方伊薩酵母Z19株及胞外產(chǎn)物。優(yōu)先地，本發(fā)明還公開了一種含東方伊薩酵母Z19株釀酒菌劑組合物，其特征在于它含有下列組份(體積比)
東方伊薩酵母Z1960%
酒精酵母40%
其中東方伊薩酵母為CCTCC M2011499，酒精酵母為AS2. 300。酒精酵母AS2. 300為常用普通微生物菌種，登載于中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心目錄，處于公開狀態(tài)，科學(xué)工作者可向中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心索取。本發(fā)明還公開了制備固態(tài)釀酒菌劑組合物的方法，該方法包括如下步驟
I)菌種活化分別接種東方伊薩酵母Z19株和酒精酵母AS2. 300于滅菌的糖度為12巴林的麥芽汁或米曲汁三角瓶培養(yǎng)基中，28 30°C搖床培養(yǎng)18-24天；2)固體培養(yǎng)固體培養(yǎng)的配料是麩皮70%、玉米面30%，用玉米糖化液潤(rùn)料，加1%濃硫fe，蒸煮冷散后，將I)中活化培養(yǎng)的2種酵母囷液按3 :2體積比混合接種后裝盒,保持室溫20 0C左右.品溫25 °C左右，培養(yǎng)發(fā)酵2天；
3)真空干燥對(duì)發(fā)酵后的固體樣品在45°C進(jìn)行真空干燥處理，樣品含水率低于10%后真空包裝。在對(duì)產(chǎn)品進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)時(shí)，東方伊薩酵母Z19株和酒精酵母AS2. 300的比例是3 : 2。本發(fā)明還公開了新的高產(chǎn)酯東方伊薩酵母菌Z19株在白酒釀造中的應(yīng)用。本發(fā)明還公開了釀酒菌劑組合物在白酒釀造中的應(yīng)用。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)
I、本發(fā)明提供的東方伊薩酵母Z19株是一株新的菌株，該菌株不但可耐42°C高溫，液體發(fā)酵乙酸乙酯產(chǎn)量高達(dá)270. 29毫克/升，液體發(fā)酵產(chǎn)物酒精度可達(dá)5. 98%，分別比東方伊薩酵母Zl提高18 %和15%，即東方伊薩酵母Z19株不但耐42°C高溫，更具有高乙酸乙酯產(chǎn)力和較強(qiáng)的產(chǎn)酒精能力。2)使用東方伊薩酵母Z19株發(fā)酵生產(chǎn)白酒，通過(guò)品酒，品酒分?jǐn)?shù)在90-95，較高于東方伊薩酵母Zl的75-88，并形成濃醬兼香型白酒獨(dú)特風(fēng)味，優(yōu)級(jí)酒率達(dá)到100%
3、東方伊薩酵母Z19株與酒精酵母混合制備釀酒菌劑，在目前通用的白酒固態(tài)發(fā)酵物料中添加釀酒菌劑進(jìn)行發(fā)酵制酒，與東方伊薩酵母Zl株制備釀酒菌劑對(duì)比出酒率提高了 I. 4%,同時(shí)原酒中總酯的含量增加了 4. 4%，改善口感作用明顯。


圖I是東方伊薩酵母菌Z19株26S rDNA D1/D2區(qū)序列系統(tǒng)發(fā)育樹圖
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體的實(shí)施例來(lái)進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)當(dāng)理解，這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明，而不能限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。在本發(fā)明中涉及的微生物菌種情況如下
東方伊薩酵母Z19株orientalis Z19),保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號(hào)為CCTCC M2011499
對(duì)照菌株?yáng)|方伊薩酵母Zl株，在中國(guó)專利CN201010520135. 2中進(jìn)行了公開，
公開日2011年6月22日，任何符合要求的研究者可從保藏機(jī)構(gòu)索取。酒精酵母AS2. 300為常用普通微生物菌種，登載于中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心目錄，處于公開狀態(tài)，科學(xué)工作者可向中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心索取。 安琪耐高溫釀酒酵母TRADY為市場(chǎng)流通商品。東方伊薩酵母Issatchenkia orientalis NRRL Y-5396 和釀酒酵母 Saccharomyces cerevisiae CCTCC AY92003為常用普通微生物菌種,分別登載于美國(guó)農(nóng)業(yè)部菌種保藏中心和中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心目錄，處于公開狀態(tài)，科學(xué)工作者可向保藏中心索取。實(shí)施例實(shí)施例I 東方伊薩酵母Z19的分離與鑒定 I. I樣品、培養(yǎng)基與試劑
樣品白云邊酒廠釀造車間已經(jīng)高溫堆積，即將入池的酒醅。培養(yǎng)基 I曲汁培養(yǎng)基。配制方法，以配制200 mL曲汁培養(yǎng)基為例)取酒醅20 g,加水200 mL，煮沸30 min,過(guò)濾,補(bǔ)水定容至200 mL，加鹿糖4 g，115°C滅菌30 min。( !
牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基(YPD)。如配固體培養(yǎng)基則另外添加總重I. 5%的瓊脂粉。Taq DNA聚合酶和dNTP購(gòu)自上海申能博彩公司。DL2000 marker購(gòu)自大連寶生物公司。PCR引物16S-27F，16S-1492R委托北京奧科生物技術(shù)公司合成。I. 2東方伊薩酵母Z19株的分離從白云邊酒廠堆積發(fā)酵料，包括堆積后高溫酒醅、剛混合的酒醅和堆積后中等溫度的酒醅中取樣，將樣品活化后加入到PH4. 5-5. O的YPD 液體培養(yǎng)基中，轉(zhuǎn)速200rpm，溫度30°C時(shí)富集培養(yǎng)48小時(shí)，然后取100 μ I經(jīng)過(guò)一定梯度稀釋后的培養(yǎng)液涂布到Y(jié)PD培養(yǎng)基固體平板上，30°C培養(yǎng)48小時(shí)后，挑取典型酵母形態(tài)的單菌落，再在相同培養(yǎng)基固體平板上重復(fù)劃線純化三次后，4°C保存。然后通過(guò)糧食水解液發(fā)酵實(shí)驗(yàn)檢驗(yàn)這些分離出來(lái)的菌株在發(fā)酵過(guò)程中的乙醇產(chǎn)率、乙酸乙酯產(chǎn)率，最后根據(jù)發(fā)酵試驗(yàn)結(jié)果篩選出產(chǎn)酒精能力和產(chǎn)酯率均較高的菌株25株。本發(fā)明人將分離的一株新的東方伊薩酵母菌Z19株(Issatchenkia orientalis Z19)保藏于湖北省武漢市武漢大學(xué)校內(nèi)的中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號(hào)為CCTCC M2011499。保藏日為2011年12月31日。I. 3 東方伊薩酵母菌Z19株的鑒定通過(guò)形態(tài)特征觀察、生理生化測(cè)定及26S rDNA D1/D2區(qū)域基因序列分析結(jié)果對(duì)Z19進(jìn)行鑒定。在鑒定中，本實(shí)驗(yàn)選擇安琪耐高溫釀酒酵母 TRADY、東方伊薩酵母orientalis NRRL Y-5396，和 AS2. 300 菌株作為對(duì)照菌株。安琪耐高溫釀酒酵母TRADY為市場(chǎng)流通商品；東方伊薩酵母 orientalis NRRL Y-5396和釀酒酵母AS2. 300為常用普通微生物菌種，分別登載于美國(guó)農(nóng)業(yè)部菌種保藏中心和中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心索取目錄，處于公開狀態(tài)，科學(xué)工作者可向保藏中心索取。I. 3. I東方伊薩酵母菌Z19株形態(tài)特征觀察菌落乳白色、形狀為規(guī)則圓形、表面較平坦、干燥，培養(yǎng)較長(zhǎng)時(shí)間后，芽生孢子延長(zhǎng)呈梳妝交錯(cuò)，假菌絲分支分布，細(xì)胞呈圓形或橢圓形。I. 3. 2通過(guò)26S rDNA D1/D2區(qū)域序列分析進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育地位鑒定
用酵母菌基因組DNA提取試劑盒(BioFlux杭州博日科技有限公司提供)提取Z19的全DNA，然后以提取出來(lái)的全DNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，正向引物NLl 5’ -GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG-3’，反向引物 NL4 :5’ - GGTCCGTGTTTCAAGACGG-3’。按以下的反應(yīng)條件共進(jìn)行30個(gè)循環(huán)94°C預(yù)變性5 min,94°C變性I min, 59°C退火I min, 72°C延伸I min，30個(gè)循環(huán)后，72°C延伸5 min。所得PCR產(chǎn)物由北京奧科生物技術(shù)公司進(jìn)行純化及序列測(cè)定。將測(cè)定出來(lái)的Z19的26S rDNA D1/D2區(qū)域與GenBank核酸序列數(shù)據(jù)庫(kù)中的序列進(jìn)行比對(duì)，采用ClustalX軟件進(jìn)行匹配排列(align)，用MEGA4. O軟件中的neighbor-joining分析法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，并進(jìn)行1000次Bootstraps檢驗(yàn)，最后用 TreeView軟件顯示系統(tǒng)樹。
實(shí)驗(yàn)得到570bp的基因序列，在Genbank核酸序列數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行同源序列搜索， TYQ 與Issatchenkia orientalis NRRL Y-5396 的同源性超過(guò) 99%,符合Kuttzman&Robnett 所定的同種內(nèi)不同菌株見差異不超過(guò)1%的標(biāo)準(zhǔn)。I. 3. 3 :東方伊薩酵母菌Z19株的生理生化實(shí)驗(yàn)測(cè)定結(jié)果
(I)發(fā)酵試驗(yàn)
權(quán)利要求
1.一株高產(chǎn)酯的東方伊薩酵母菌，，其特征在于，該菌株為東方伊薩酵母Z19株 (Jssatchenkia oriental is Z19),保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心,保藏編號(hào)為CCTCC M2011499。
2.一種含權(quán)利要求I中所述菌株的釀酒菌劑組合物。
3.根據(jù)權(quán)利要求2中所述的釀酒菌劑組合物，其特征在于它含有下列組份(活菌數(shù)比)東方伊薩酵母Z19 60%酒精酵母40%其中東方伊薩酵母為CCTCC M2011499，酒精酵母為AS2. 300。
4.制備權(quán)利要求4中所述的固態(tài)釀酒菌劑組合物的方法，包括如下步驟菌種活化分別接種東方伊薩酵母Z19株和酒精酵母AS2. 300于滅菌的糖度為12巴林的麥芽汁或米曲汁三角瓶培養(yǎng)基中，28 30°C搖床培養(yǎng)18-24天；固體培養(yǎng)固體培養(yǎng)的配料是麩皮70%、玉米面30%，用玉米糖化液潤(rùn)料，加1%濃硫酸，蒸煮冷散后，將活化培養(yǎng)2種酵母菌液按3 2體積比混合接種后裝盒，保持室溫20°C左右.品溫25 °C左右，培養(yǎng)發(fā)酵2天；真空干燥對(duì)發(fā)酵后的固體樣品在45°C進(jìn)行真空干燥處理，樣品含水率低于10%后真空包裝。
5.權(quán)利要求I所述的東方伊薩酵母Z19株在白酒釀造上的應(yīng)用。
6.權(quán)利要求2或3中所述的任何一種釀酒菌劑組合物在白酒釀造上的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一株新的高產(chǎn)酯東方伊薩酵母菌，含該菌的釀酒菌劑組合物以及高產(chǎn)酯東方伊薩酵母菌及釀酒菌劑組合物在白酒釀造中的應(yīng)用。本發(fā)明還提供制備釀酒菌劑組合物的方法。本發(fā)明公開的高產(chǎn)酯東方伊薩酵母菌不但耐高溫，更重要的是具有高產(chǎn)酯率和高酒精產(chǎn)率。品酒分?jǐn)?shù)在90-95。采用該菌株發(fā)酵可形成白酒獨(dú)特風(fēng)味。
文檔編號(hào)C12G3/02GK102586125SQ20121003924
公開日2012年7月18日 申請(qǐng)日期2012年2月21日 優(yōu)先權(quán)日2012年2月21日
發(fā)明者劉婷婷, 宋瑤, 張明春, 曾馳, 楊團(tuán)元, 熊小毛, 繆禮鴻 申請(qǐng)人:武漢工業(yè)學(xué)院, 湖北白云邊酒業(yè)股份有限公司