專(zhuān)利名稱(chēng)：一種用于從孢子捕捉器的捕捉帶上提取小麥白粉菌dna的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明“一種用于從孢子捕捉器的捕捉帶上提取小麥白粉菌DNA的方法”可用于提取經(jīng)孢子捕捉器收集到的白粉菌分生孢子的DNA，屬于植物病害領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
由專(zhuān)性寄生真菌Blumeria graminis f.sp.tritici引起的小麥白粉病是我國(guó)小麥生產(chǎn)上的重要病害之一，提高此病害的預(yù)測(cè)水平可以有效地控制病害流行和減少農(nóng)藥的使用。小麥白粉病作為一種典型的氣傳性真菌病害，空氣中白粉菌分生孢子的數(shù)量或密度是該病害發(fā)生和流行的一個(gè)重要驅(qū)動(dòng)變量，病原菌的侵染能力、生存力、傳播能力與病害的流行速度、流行長(zhǎng)短及分布有很重要的關(guān)系。小麥白粉病春季一般可發(fā)生再侵染5 6代，白粉菌分生孢子的傳播是引起該病害再侵染的基礎(chǔ)，明確病害發(fā)生的初侵染菌量或再侵染菌量，對(duì)于認(rèn)識(shí)病害的流行規(guī)律和提高病害的預(yù)測(cè)預(yù)報(bào)水平有十分重要的作用。種植抗病品種和使用化學(xué)農(nóng)藥是防治小麥白粉病的的兩個(gè)主要措施，了解病原菌的抗藥性現(xiàn)狀可以有效地指導(dǎo)農(nóng)藥的合理使用，所有這些都需要實(shí)現(xiàn)對(duì)病原菌的采樣。利用孢子捕捉器可以實(shí)現(xiàn)對(duì)空氣中病原菌孢子的連續(xù)采樣，收集到的病原菌孢子不僅可以用來(lái)明確病害發(fā)生的初侵染菌量或再侵染菌量，預(yù)測(cè)病害的發(fā)生和流行，而且還可用于病原菌的抗藥性監(jiān)測(cè)。但常規(guī)的病菌孢子種類(lèi)鑒定和計(jì)數(shù)方法是在顯微鏡下根據(jù)孢子的形態(tài)特征來(lái)判 斷，僅根據(jù)形態(tài)特征來(lái)判斷容易產(chǎn)生誤判，不能滿(mǎn)足病害監(jiān)測(cè)中準(zhǔn)確和快速的要求。加上小麥白粉病菌是一種專(zhuān)性寄生真菌，只能在活體小麥上保存和培養(yǎng)，因此通過(guò)孢子捕捉器收集的小麥白粉菌分生孢子不能用于白粉菌的抗藥性監(jiān)測(cè)。Real-timePCR定量技術(shù)可以較好地解決這些問(wèn)題，并且在病原菌定量和抗藥性監(jiān)測(cè)等方面已經(jīng)應(yīng)用比較廣泛，在該技術(shù)體系中，如何從樣本中提取靶標(biāo)生物的DNA是基礎(chǔ)，而利用孢子捕捉器搜集到的孢子往往被吸附在捕捉帶上，首先需要將其從捕捉帶上洗脫和破壁后才能進(jìn)行DNA的提取。目前還未見(jiàn)有從孢子捕捉器的捕捉帶上提取小麥白粉菌分生孢子DNA的研究報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
技術(shù)問(wèn)題利用孢子捕捉器可以連續(xù)收集空氣中小麥白粉菌的分生孢子，但是如何準(zhǔn)確、快速的實(shí)現(xiàn)對(duì)病原菌孢子的識(shí)別和定量檢測(cè)及擴(kuò)大該類(lèi)儀器在病害研究中的應(yīng)用，本研究發(fā)明的目的是提供用于從孢子捕捉器的捕捉帶上提取白粉菌孢子DNA的方法，從而為利用分子生物學(xué)技術(shù)明確病害發(fā)生的初侵染菌量或再侵染菌量及抗藥性監(jiān)測(cè)提供基礎(chǔ)。技術(shù)方案一種用于從孢子捕捉器的捕捉帶上提取白粉菌DNA的方法，包括:I)樣品制備
將至于田間的孢子捕捉器捕捉帶剪成48mm長(zhǎng)的片段，每段代表I天。2)捕捉帶上白粉菌分生孢子的洗脫和破壁將捕捉帶剪成6段，放入2ml離心管中，加入400 μ I Nonidet Ρ-40和0.2g直徑為400-600 μ m的玻璃珠，在65°C下溫育30min。在Fast-Prep 儀器上以6m/s震蕩40s 2次后在冰上放置2min，然后再以6m/s震蕩40s 2次，可把捕捉帶洗脫白粉菌分生孢子洗脫下來(lái)，并得到破壁的病菌孢子懸浮液。3) DNA的提取和純化將洗脫和破壁的孢子懸浮液轉(zhuǎn)入另一離心管中，按常規(guī)方法加提取緩沖液進(jìn)行DNA提取和純化或按試劑盒的提取方法進(jìn)行DNA的提取和純化。4)提取結(jié)果評(píng)價(jià)以純化好的DNA為模板，以小麥白粉菌的特異性引物5’ -AAGCTATGCGGAACTTCGITT-3’ ；5’ -TAAGGAGITTTGGCAAGTCCC-3’ 進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增，根據(jù)擴(kuò)增產(chǎn)物的大小和有無(wú)來(lái)判定結(jié)果。有益效果本發(fā)明一種用于從孢子捕捉器的捕捉帶上提取白粉菌DNA的方法，可用來(lái)提取由孢子捕捉器收集到的小麥白粉菌分生孢子的DNA，與國(guó)內(nèi)外現(xiàn)有方法相比，本發(fā)明具有以下的技術(shù)優(yōu)勢(shì):I)結(jié)果準(zhǔn)確。和傳統(tǒng)的病原菌識(shí)別方法相比，PCR技術(shù)根據(jù)擴(kuò)增產(chǎn)物的有無(wú)來(lái)直接判斷病原菌是否屬于本種，結(jié)果客觀，不代表任何主觀性，也不會(huì)因病原菌形態(tài)特征相似發(fā)生誤判。由于時(shí)間限制，傳統(tǒng)的在顯微鏡下只能對(duì)捕捉帶的部分區(qū)域進(jìn)行觀察，只能獲得觀察部分的信息，而本發(fā)明可以獲得捕捉帶上的全部信息。2)效率高。本發(fā)明一次可以同時(shí)對(duì)多臺(tái)儀器和多個(gè)時(shí)間段的樣本進(jìn)行處理，提高了效率。3)用途廣。利用本發(fā)明提取小麥白粉菌分生孢子的DNA后，不僅可用于病害識(shí)別和病害發(fā)生和流行定量監(jiān)測(cè)，還可直接用于病原菌群體的抗藥性監(jiān)測(cè)等研究工作。因此本方法實(shí)用性強(qiáng)，可滿(mǎn)足病害檢測(cè)、監(jiān)測(cè)及研究的需要。


圖1:CTAB法提取孢子捕捉器捕捉帶上小麥白粉菌DNA后的PCR擴(kuò)增結(jié)果M:分子量標(biāo)準(zhǔn)DGL100 ；1:陽(yáng)性對(duì)照；2:捕捉帶上分生孢子數(shù)78 ；3:捕捉帶上分生孢子數(shù)8 ；4:捕捉帶上分生孢子數(shù)54 ；5:捕捉帶上分生孢子數(shù)108 ；6:捕捉帶上分生孢子數(shù)83 ；7:捕捉帶上分生孢子數(shù)14 ；8:陰性對(duì)照?qǐng)D2:試劑盒法提取孢子捕捉器捕捉帶上小麥白粉菌DNA后的PCR擴(kuò)增結(jié)果M:分子量標(biāo)準(zhǔn)DGL100 ；1:陽(yáng)性對(duì)照；2:捕捉帶上分生孢子數(shù)58 ；3:捕捉帶上分生孢子數(shù)6 ；4:捕捉帶上分生孢子數(shù)16 ；5:捕捉帶上分生孢子數(shù)94 ；6:捕捉帶上分生孢子數(shù)76 ；7:陰性對(duì)照
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1:傳統(tǒng)C TAB法提取孢子捕捉器捕捉帶上小麥白粉菌DNA
I)樣品制備將從田間孢子捕捉器上取回的捕捉帶剪成長(zhǎng)為48mm的片段。2)捕捉帶上白粉菌孢子的洗脫和破壁將捕捉帶剪成6段，放入2ml離心管中，加入400 μ I Nonidet Ρ-40和0.2g直徑為400-600 μ m的玻璃珠，在65°C下溫育30min。在Fast-Prep 儀器上以6m/s震蕩40s 2次后在冰上放置2min，然后再以6m/s震蕩40s 2次，可把捕捉帶洗脫白粉菌分生孢子洗脫下來(lái)，并得到破壁的病菌孢子懸浮液。3) DNA的提取和純化將洗脫和破壁孢子懸浮液轉(zhuǎn)入另一離心管中，按傳統(tǒng)的CTAB法進(jìn)行白粉菌分生孢子DNA的提取和純化。4)提取結(jié)果評(píng)價(jià)以純化好的DNA為模板，以小麥白粉菌的特異性引物5’ -AAGCTATGCGGAACTTCGITT-3’ ；5’ -TAAGGAGITTTGGCAAGTCCC-3’ 進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增，根據(jù)擴(kuò)增產(chǎn)物的大小和有無(wú)來(lái)判定結(jié)果。實(shí)施結(jié)果以利用CTAB法對(duì)破壁后小麥白粉菌分生孢子懸浮液進(jìn)行提取純化好的DNA為模板，以已經(jīng)報(bào)道的小麥 白粉菌特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增后，在部分樣品中擴(kuò)增出了與陽(yáng)性對(duì)照大小一致的目的條帶(圖1)，說(shuō)明DNA已成功提取出來(lái)。實(shí)施例2 =DNA提取試劑盒法提取孢子捕捉器捕捉帶上小麥白粉菌DNAI)樣品制備將從田間孢子捕捉器上取回的捕捉帶剪成長(zhǎng)為48mm的片段。2)捕捉帶上白粉菌分生孢子的洗脫和破壁將捕捉帶剪成6段，放入2ml離心管中，加入400 μ I Nonidet Ρ-40和0.2g直徑為400-600 μ m的玻璃珠，在65°C下溫育30min。在Fast-Prep 儀器上以6m/s震蕩40s 2次后在冰上放置2min，然后再以6m/s震蕩40s 2次，可把捕捉帶洗脫白粉菌分生孢子洗脫下來(lái)，并得到破壁的病菌孢子懸浮液。3) DNA的提取和純化將洗脫和破壁的孢子懸浮液轉(zhuǎn)入另一離心管中，按試劑盒法傷的描述進(jìn)行白粉菌分生孢子DNA的提取和純化。4)提取結(jié)果評(píng)價(jià)以純化好的DNA為模板，以小麥白粉菌的特異性引物5’ -AAGCTATGCGGAACTTCGITT-3’ ；5’ -TAAGGAGITTTGGCAAGTCCC-3’ 進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增，根據(jù)擴(kuò)增產(chǎn)物的大小和有無(wú)來(lái)判定結(jié)果。實(shí)施結(jié)果以利用試劑盒法對(duì)破壁后小麥白粉菌分生孢子懸浮液進(jìn)行提取純化好的DNA為模板，以已經(jīng)報(bào)道的小麥白粉菌特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增后，在部分樣品中擴(kuò)增出了與陽(yáng)性對(duì)照大小一致的目的條帶(圖2)，說(shuō)明DNA已成功提取出來(lái)。
權(quán)利要求
1.在一種用于從孢子捕捉器的捕捉帶上提取小麥白粉菌DNA的方法發(fā)明中，主要涉及一種對(duì)孢子捕捉器捕捉帶上所收集的小麥白粉菌分生孢子洗脫和破壁的合適方法為將捕捉帶剪成6段，放入2ml離心管中，加入400 μ I Nonidet Ρ-40和O. 2g直徑為400-600 μ m的玻璃珠，在65°C下溫育30min。在Fast-Prep 儀器上以6m/s震蕩40s 2次后在冰上放置2min,然后再以6m/s震蕩40s 2次，可把捕捉帶洗脫白粉菌分生孢子洗脫下來(lái)，并得到破壁的病菌孢子懸浮液，然后用常規(guī)方法或試劑盒的提取方法進(jìn)行DNA的提取和純化。
全文摘要
本發(fā)明“一種用于從孢子捕捉器的捕捉帶上提取小麥白粉菌DNA的方法”可用于提取經(jīng)孢子捕捉器收集到的白粉菌分生孢子的DNA，屬于植物病害流行監(jiān)測(cè)領(lǐng)域。該發(fā)明首先通過(guò)對(duì)孢子捕捉器捕捉帶上收集到的小麥白粉菌的分生孢子進(jìn)行洗脫和破壁，然后對(duì)破壁后分生孢子的DNA進(jìn)行提取和純化，從而為利用分子生物學(xué)定量研究技術(shù)開(kāi)展病害的發(fā)生流行監(jiān)測(cè)服務(wù)。該發(fā)明提取的DNA不僅可用用來(lái)準(zhǔn)確定量檢測(cè)孢子捕捉器收集到的小麥白粉菌分生孢子，而且還可直接用于抗藥性監(jiān)測(cè)。此技術(shù)可作為病害監(jiān)測(cè)技術(shù)在各地推廣應(yīng)用。
文檔編號(hào)C12R1/645GK103255129SQ201210039038
公開(kāi)日2013年8月21日 申請(qǐng)日期2012年2月21日 優(yōu)先權(quán)日2012年2月21日
發(fā)明者曹學(xué)仁, 周益林, 駱勇, 段霞瑜, 陳萬(wàn)權(quán) 申請(qǐng)人:中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所