專(zhuān)利名稱(chēng)：一種防治根瘤線蟲(chóng)的菌株培養(yǎng)液及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種生物制劑及其制備方法，更具體地說(shuō)，是涉及一種防治根瘤線蟲(chóng)的菌株培養(yǎng)液及其制備方法。
背景技術(shù)：
全世界廣泛分布的對(duì)農(nóng)作物產(chǎn)生傷害的植物寄生線蟲(chóng)就是根瘤線蟲(chóng)，對(duì)植物地上部分產(chǎn)生傷害或在土壤中棲息的同時(shí)對(duì)植物的根部進(jìn)行傷害，特別是在國(guó)內(nèi)，紅薯根瘤線蟲(chóng)(Meloidogyne incognita)、花生根瘤線蟲(chóng)(Meloidogyne arenaria)、胡蘿卜根瘤線蟲(chóng) (Meloidogyne hapla)等作為對(duì)作物產(chǎn)生傷害的主要害蟲(chóng)被人們所熟知。現(xiàn)階段，根瘤線蟲(chóng)的防治方法有栽培防治、物理防治和化學(xué)防治。栽培防治中有新鮮水、休耕、干土、深耕、客土、水稻輪作栽培、抗病品種等，物理防治有熱處理(蒸汽、干熱、 溫湯浸法)、太陽(yáng)能消毒等被使用著，化學(xué)防治有噻唑磷(線蟲(chóng)炭)等噴灑化學(xué)藥劑來(lái)防治著線蟲(chóng)。栽培防治根據(jù)地區(qū)條件和栽培作物不同，有應(yīng)用難和高費(fèi)用的缺點(diǎn)，特別是抗病品種對(duì)作物有局限性，所以實(shí)用性很低?；瘜W(xué)藥劑的情況，防治效果高，但大部分為有機(jī)磷劑和氨基甲酸酯類(lèi)在土壤中有殘留時(shí)，毒性高，不只對(duì)環(huán)境有污染，對(duì)作物賴以生存的土壤中的有益微生物無(wú)分別的發(fā)揮殺菌作用，使得蟲(chóng)害加劇，是土壤變貧瘠的原因。作為化學(xué)防治劑的代行方案，這種利用根瘤線蟲(chóng)天敵微生物，生化學(xué)劑和植物提取物的生物學(xué)方面的防治，它的研究活躍地進(jìn)行中，到現(xiàn)在為止，已報(bào)告了的殺蟲(chóng)霉 (Monacroporium thaumasium)在實(shí)際設(shè)施栽培地里使用效果極不好，對(duì)農(nóng)家可普及的實(shí)用化也很艱難，還有，利用藥用植物達(dá)到殺線蟲(chóng)效果的值得期待的研究也正在進(jìn)行中，原料的收集很難，缺點(diǎn)就是還需依靠進(jìn)口。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明就是針對(duì)上述問(wèn)題，提供了一種防蟲(chóng)效果好、環(huán)保型的防治根瘤線蟲(chóng)的菌株培養(yǎng)液及其制備方法。為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案，其主要組成為名稱(chēng)為 Photorhabdus temperata. subsp. Temperate 的昆蟲(chóng)病原性線蟲(chóng)(Heterorhabditis bacteriophora)先后經(jīng)過(guò)粉碎、分離、接種培養(yǎng)、提取后得到所述的菌株培養(yǎng)液。具體的制備步驟為，(1)粉碎、分離將昆蟲(chóng)病原性線蟲(chóng)(Heterorhabditisbacteriophora)置于含鏈霉素 0. 06wt % 的Naao溶液中進(jìn)行30 40min的消毒，每500 800只昆蟲(chóng)病原性線蟲(chóng)用300ppm的上述NaClO溶液；消毒后用勻漿機(jī)將線蟲(chóng)全部磨碎，磨碎后的漿液置于瓊脂培養(yǎng)基(MacConkey agar)中，將發(fā)出粉紅色熒光的這部分細(xì)菌取出，置于NBTA培養(yǎng)基中進(jìn)行二次分離，最后將圍繞群體白帶的綠色群體取出備用；昆蟲(chóng)病原性線蟲(chóng)購(gòu)自韓國(guó)慶尚南道晉州市國(guó)立慶尚大學(xué)。⑵接種培養(yǎng)將步驟(1)得到的菌種按2. 0%的接種量接種到5wt%的YS培養(yǎng)基中，在25 35°C、250 350rpm的條件下培養(yǎng)3 5天，然后將培養(yǎng)基中的紅色群體取出備用；(3)提取向步驟( 得到的群體中加入2倍體積的2-異丙醇，用超聲波處理1-2小時(shí)，在 4°C下放置M小時(shí)，除去培養(yǎng)液其它多糖類(lèi)物質(zhì)；接著將培養(yǎng)液置于離心分離機(jī)中，以12，OOOxg進(jìn)行40分鐘的離心分離，以GF/F 濾紙(Whatman，直徑047mm，孔徑0.7 μ m)濾去細(xì)胞后即得所述的菌株培養(yǎng)液。步驟(1)中所述的瓊脂培養(yǎng)基的組成及配比為，IL蒸餾水中，含蛋白胨17g，蛋白間質(zhì)蛋白胨3g，乳糖酶IOg,氯化鈉5g，膽汁酸鹽1. 5g，細(xì)菌用瓊脂13. 5g，中性紅0. 03g,結(jié)晶紫 0. OOlg ；NBTA培養(yǎng)基的組成及配比為，IL蒸餾水中，含牛肉膏3g，蛋白胨5g，細(xì)菌營(yíng)養(yǎng)用瓊脂15g,溴麝香草酚藍(lán)0. 025g, 2,3,5-三苯基氯化四氮唑(TTC) 0. 04g。步驟O)中的YS培養(yǎng)基的原料為食用油，卵黃粉，膽固醇，豬油，卵磷脂，全脂粉乳，氯化鈉，磷酸二氫鉀、酵母提取物中的一種以上。步驟(3)中的2-異丙醇的溫度為0 5°C。本發(fā)明的有益效果H明i以名禾爾為 Photorhabdus temperata. subsp. Temperate ^ ^ ] 分的生物制劑，替代了現(xiàn)存的化學(xué)農(nóng)藥制劑。不只可以減少關(guān)于土壤的農(nóng)藥殘留傷害，還因?yàn)橥辽N能生產(chǎn)殺線蟲(chóng)的物質(zhì)，使用含有這種成分的培養(yǎng)液可以減輕根瘤線蟲(chóng)的傷害。本發(fā)明制得的培養(yǎng)液在使用時(shí)可以分泌蒽醌，蒽醌對(duì)根瘤線蟲(chóng)有防治作用，其對(duì)根瘤線蟲(chóng)的根組織內(nèi)抑制感染態(tài)和殺蟲(chóng)的效果都很明顯。本發(fā)明對(duì)紅薯根瘤線蟲(chóng)(Meloidogyne incognita)，花生根瘤線蟲(chóng)(Meloidogyne arenaria)，胡蘿卜根瘤線蟲(chóng)(Meloidogyne hapla)都具有防治作用。


圖1為實(shí)施例1中經(jīng)分離得到的培養(yǎng)液的菌落外觀圖。圖2為實(shí)施例1中最終產(chǎn)品的外觀圖。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1(1)粉碎、分離將昆蟲(chóng)病原性線蟲(chóng)(Heterorhabditisbacteriophora)置于含鏈霉素 0. 06wt % 的NaClO溶液中進(jìn)行30min的消毒，每500只昆蟲(chóng)病原性線蟲(chóng)用300ppm的上述NaClO溶液；消毒后用勻漿機(jī)將線蟲(chóng)全部磨碎，磨碎后的漿液置于瓊脂培養(yǎng)基(MacConkey agar)中，將發(fā)出粉紅色熒光的這部分細(xì)菌取出，置于NBTA培養(yǎng)基中進(jìn)行二次分離，最后將圍繞群體白帶的綠色群體取出備用；昆蟲(chóng)病原性線蟲(chóng)購(gòu)自韓國(guó)慶尚南道晉州市國(guó)立慶尚大學(xué)。(2)接種培養(yǎng)將步驟(1)得到的菌種按2. 0%的接種量接種到5wt%的YS培養(yǎng)基中，在25°C、 250rpm的條件下培養(yǎng)4天，然后將培養(yǎng)基中的紅色群體取出備用；(3)提取向步驟⑵得到的群體中加入2倍體積4°C的2-異丙醇，用超聲波處理1-2小時(shí)， 在4°C下放置M小時(shí)，除去培養(yǎng)液其它多糖類(lèi)物質(zhì)；接著將培養(yǎng)液置于離心分離機(jī)中，以12，OOOxg進(jìn)行40分鐘的離心分離，以GF/F 濾紙(Whatman，直徑047mm，孔徑0.7 μ m)濾去細(xì)胞后即得所述的菌株培養(yǎng)液。步驟(1)中所述的瓊脂培養(yǎng)基的組成及配比為，IL蒸餾水中，含蛋白胨17g，蛋白間質(zhì)蛋白胨3g，乳糖酶IOg,氯化鈉5g，膽汁酸鹽1. 5g，細(xì)菌用瓊脂13. 5g，中性紅0. 03g,結(jié)晶紫 0. OOlg ；NBTA培養(yǎng)基的組成及配比為，IL蒸餾水中，含牛肉膏3g，蛋白胨5g，細(xì)菌營(yíng)養(yǎng)用瓊脂15g,溴麝香草酚藍(lán)0. 025g, 2,3,5-三苯基氯化四氮唑(TTC) 0. 04g。步驟O)中的YS培養(yǎng)基的原料為食用油，卵黃粉，膽固醇，豬油，卵磷脂，全脂粉乳，氯化鈉，磷酸二氫鉀、酵母提取物。實(shí)施例2為確定 Photorhabdus temperata. subsp. temperata 菌種的系統(tǒng)學(xué)的位置,把 16S rRNA增幅到PCR來(lái)測(cè)定了鹽基序列。16S rRNA 的鹽基序列測(cè)定中，利用 ABI PRISM BigDye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit (Applied Biosystems)進(jìn)行循環(huán)測(cè)序后以 ABI PRISM 310 Genetic Analyaer (Applied Biosystemo)測(cè)定了鹽基序列。通過(guò)上述實(shí)驗(yàn)得到的16S rRNA 鹽基序列的相同性是利用DDBJ/NCBI/RDP/GeneBank database的BLAST program來(lái)對(duì)照調(diào)查的，各鹽基序列的排序(alignment)是利用Clustal X algorithm算法進(jìn)行排序的，示意圖的制作是以依據(jù)近鄰結(jié)合法確定了系統(tǒng)學(xué)的位置。上述菌種通過(guò)16S rRNA的基因分析出的鹽基序列結(jié)果顯示與Photorhabdus temperata. subsp. Temperata有100%的相同性。實(shí)施例3對(duì)紅薯根瘤線蟲(chóng)(Meloidogyne incognita),花生根瘤線蟲(chóng)(Meloidogyne arenaria)，胡蘿卜根瘤線蟲(chóng)(Meloidogyne hapla)的防治效果進(jìn)行了檢定，檢定是在室內(nèi)培養(yǎng)皿中檢定的。試驗(yàn)區(qū)為實(shí)施例1制得的菌株培養(yǎng)液，菌株培養(yǎng)液中，蒽醌濃度為-5wt% ； 對(duì)照區(qū)為阿維菌素乳油，型號(hào)為EC 0. 025%，阿維菌素的濃度為5wt% ；比較區(qū)為經(jīng)滅菌處理過(guò)的蒸餾水。檢定結(jié)果見(jiàn)表1。
權(quán)利要求
1.一種防治根瘤線蟲(chóng)的菌株培養(yǎng)液，其特征在于，其主要組成為名稱(chēng)為Photorhabdus temperata. subsp. Temperate 的胃_0
2.—種權(quán)利要求1所述的防治根瘤線蟲(chóng)的菌株培養(yǎng)液的制備方法，其特征在于，昆蟲(chóng)病原性線蟲(chóng)(Heterorhabditis bacteriophora)先后經(jīng)過(guò)粉碎、分離、接種培養(yǎng)、提取后得到所述的菌株培養(yǎng)液。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的防治根瘤線蟲(chóng)的菌株培養(yǎng)液的制備方法，其特征在于，具體的制備步驟為，(1)粉碎、分離將昆蟲(chóng)病原性線蟲(chóng)(Heterorhabditis bacteriophora)置于含鏈霉素0. 06wt%的 NaClO溶液中進(jìn)行30 40min的消毒，每500 800只昆蟲(chóng)病原性線蟲(chóng)用300ppm的上述 NaClO溶液；消毒后用勻漿機(jī)將線蟲(chóng)全部磨碎，磨碎后的漿液置于瓊脂培養(yǎng)基(MacConkey agar) 中，將發(fā)出粉紅色熒光的這部分細(xì)菌取出，置于NBTA培養(yǎng)基中進(jìn)行二次分離，最后將圍繞群體白帶的綠色群體取出備用；(2)接種培養(yǎng)將步驟(1)得到的菌種按2. 0%的接種量接種到5wt%的YS培養(yǎng)基中，在25 35°C、 250 350rpm的條件下培養(yǎng)3 5天，然后將培養(yǎng)基中的紅色群體取出備用；(3)提取向步驟(2)得到的群體中加入2倍體積的2-異丙醇，用超聲波處理1-2小時(shí)，在4°C下放置M小時(shí)，除去培養(yǎng)液其它多糖類(lèi)物質(zhì)；接著將培養(yǎng)液置于離心分離機(jī)中，以12，OOOxg進(jìn)行40分鐘的離心分離，以GF/F濾紙濾去細(xì)胞后即得所述的菌株培養(yǎng)液。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的防治根瘤線蟲(chóng)的菌株培養(yǎng)液的制備方法，其特征在于，步驟(1)中所述的瓊脂培養(yǎng)基的組成及配比為，IL蒸餾水中，含蛋白胨17g，蛋白間質(zhì)蛋白胨3g， 乳糖酶IOg,氯化鈉5g，膽汁酸鹽1. 5g，細(xì)菌用瓊脂13. 5g，中性紅0. 03g,結(jié)晶紫0. OOlg ；NBTA培養(yǎng)基的組成及配比為，IL蒸餾水中，含牛肉膏3g，蛋白胨5g，細(xì)菌營(yíng)養(yǎng)用瓊脂 15g,溴麝香草酚藍(lán)0. 025g, 2，3，5-三苯基氯化四氮唑(TTC) 0. 04g。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的防治根瘤線蟲(chóng)的菌株培養(yǎng)液的制備方法，其特征在于，步驟(2)中的YS培養(yǎng)基的原料為食用油，卵黃粉，膽固醇，豬油，卵磷脂，全脂粉乳，氯化鈉，磷酸二氫鉀、酵母提取物中的一種以上。
6.根據(jù)權(quán)利要求3所述的防治根瘤線蟲(chóng)的菌株培養(yǎng)液的制備方法，其特征在于，步驟(3)中的2-異丙醇的溫度為0 5°C。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種生物制劑及其制備方法，更具體地說(shuō)，是涉及一種防治根瘤線蟲(chóng)的菌株培養(yǎng)液及其制備方法。本發(fā)明提供了一種防蟲(chóng)效果好、環(huán)保型的防治根瘤線蟲(chóng)的菌株培養(yǎng)液及其制備方法。其主要組成為名稱(chēng)為Photorhabdustemperata.subsp.Temperate的菌株。昆蟲(chóng)病原性線蟲(chóng)(Heterorhabditisbacteriophora)先后經(jīng)過(guò)粉碎、分離、接種培養(yǎng)、提取后得到所述的菌株培養(yǎng)液。本發(fā)明替代了現(xiàn)存的化學(xué)農(nóng)藥制劑。不只可以減少關(guān)于土壤的農(nóng)藥殘留傷害，還因?yàn)橥辽N能生產(chǎn)殺線蟲(chóng)的物質(zhì)，使用含有這種成分的培養(yǎng)液可以減輕根瘤線蟲(chóng)的傷害。
文檔編號(hào)C12N1/20GK102533613SQ20121003862
公開(kāi)日2012年7月4日 申請(qǐng)日期2012年2月21日 優(yōu)先權(quán)日2012年2月21日
發(fā)明者南旭浩, 金孝炫, 金泰完 申請(qǐng)人:沈陽(yáng)麥克斯生物工程有限公司