專利名稱：在單個(gè)微室中濃縮和擴(kuò)增核酸的方法和儀器的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及在單個(gè)微室(micro chamber)中濃縮和擴(kuò)增核酸的方法和儀器。
背景技術(shù)：
在分子生物學(xué)中，高純度雙鏈質(zhì)粒DNAs、單鏈?zhǔn)删wDNAs、染色體DNAs、以及瓊脂糖凝膠純化的DNA片段的生產(chǎn)是非常重要的。純化DNAs的理想方法應(yīng)當(dāng)簡單快速，并且?guī)缀醪话~外的樣品操作。用這種方法獲得的DNAs可以用于直接轉(zhuǎn)化、限制酶分析、連接或測(cè)序。這樣的方法在DNA樣品的自動(dòng)化生產(chǎn)中非常有吸引力，其在實(shí)驗(yàn)室研究和診斷中很受歡迎。傳統(tǒng)上，用固相純化核酸的方法是已知的。例如，美國專利5，234，809披露了用結(jié)合核酸的固相純化核酸的方法，該方法包括混合原料、離液(chaotropic)材料、和結(jié)合核酸的固相；從液體中將結(jié)合有核酸的固相分離并沖洗固相核酸復(fù)合物。然而，該方法是費(fèi)時(shí)且復(fù)雜的，因此不適合于芯片實(shí)驗(yàn)室(Lab-On-a-Chip，L0C)。同時(shí)，該方法存在問題，因?yàn)樾枰秒x液材料。美國專利6，291，166披露了用固相基質(zhì)獲取核酸的方法。由于核酸不可逆地結(jié)合于固相基質(zhì)，因而存儲(chǔ)后對(duì)核酸固相基質(zhì)復(fù)合物的延遲分析或重復(fù)分析是可能的，因此該方法具有優(yōu)勢(shì)。然而，根據(jù)該方法，具有正電荷表面的礬土(A1203)需要用堿性材料如NaOH 親水性化處理，核酸不可逆地結(jié)合于親水性化處理的礬土，因此不能從礬土分離。因此，所述方法存在的問題是，在不可逆結(jié)合有DNA的固相基質(zhì)中，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)產(chǎn)率低。美國專利6，383，783公開了從樣品分離核酸的方法，所述方法包括向疏水性有機(jī)聚合物固相加入包含目標(biāo)核酸的樣品，以將目標(biāo)核酸附著于固相；和將非離子表面活性劑添加到固相并去除附著的目標(biāo)核酸。然而，盡管在常規(guī)方法中使用疏水性固相分離核酸， 但在本發(fā)明中核酸的濃縮和擴(kuò)增是利用具有親水性表面的固相和親液(kosmotropic)鹽在單個(gè)微室中順序進(jìn)行的。本發(fā)明的發(fā)明人研究了基于上述現(xiàn)有技術(shù)的濃縮和擴(kuò)增核酸的方法，并確認(rèn)了核酸的濃縮和擴(kuò)增在單個(gè)微室中順序進(jìn)行，以便通過向其表面上具有親水性官能團(tuán)的微室添加親液鹽，在微室中濃縮核酸，并且用濃縮的核酸在微室中實(shí)施PCR。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供在單個(gè)微室中順序進(jìn)行核酸濃縮和擴(kuò)增的方法，其可以最小化樣品損失、時(shí)間和成本。本發(fā)明還提供順序進(jìn)行核酸的濃縮和擴(kuò)增的儀器，所述儀器包括在其表面上具有親水性官能團(tuán)的微室；存儲(chǔ)親液鹽溶液的部件；存儲(chǔ)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)混合物的部件；以及加熱部件和冷卻部件。本發(fā)明還提供用于順序進(jìn)行核酸的濃縮和擴(kuò)增的儀器，所述儀器包括包括在其表面上具有親水性官能團(tuán)的微室的芯片；和在其上裝配了所述芯片的核酸擴(kuò)增部件。本發(fā)明還提供包括濃縮和擴(kuò)增核酸的儀器的芯片實(shí)驗(yàn)室(lab-on-a-chip)。本發(fā)明的目的通過以下實(shí)現(xiàn)I.在單個(gè)微室中順序進(jìn)行核酸的濃縮和擴(kuò)增的方法，該方法包括將包含核酸的樣品和包含親液鹽的溶液加入到具有親水性表面的微室中，從而通過將核酸結(jié)合在微室表面上來濃縮核酸；和通過將PCR混合物添加到所述微室中來實(shí)施聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)。2.條目I的方法,其中濃縮核酸進(jìn)一步包括沖洗未結(jié)合到微室表面上的樣品。3.條目I的方法，其中實(shí)施PCR包括添加聚乙二醇和牛血清白蛋白(BSA)。4.條目3的方法，其中聚乙二醇和牛血清白蛋白(BSA)的濃度分別為1_10體積％ 和 O. Ι-lOmg/ml。5.條目I的方法，其中微室的表面有多個(gè)柱狀物。6.條目5的方法，其中柱狀物之間的間距為8 50 μ m。7.條目I的方法，其中所述親水性官能團(tuán)選自羥基、胺基、羧基、多羧基和硅烷醇基。8.條目I的方法，其中所述親液鹽選自硫酸鹽(S042_)、磷酸鹽(ΗΡ042_)、氫氧化物 (0H_)、氟化物(F_)、甲酸鹽(HC00_)和乙酸鹽(CH3COCT)。9.條目I的方法，其中所述包含核酸的樣品和親液鹽具有3-10的pH。10.條目I的方法，其中親液鹽的濃度為100 2000mM。11.條目I的方法，其中所述包含核酸的樣品為血液、血清、尿、唾液或存在于細(xì)胞培養(yǎng)物液體中的細(xì)菌的細(xì)胞溶解產(chǎn)物。12.用于順序進(jìn)行核酸的濃縮和擴(kuò)增的儀器，所述儀器包括在其表面上具有親水性官能團(tuán)的微室；通過微通道與微室互連的存儲(chǔ)含核酸樣品的部件，其為微室提供含核酸的樣品；通過微通道與微室互連的存儲(chǔ)親液鹽溶液的部件，其為微室提供親液鹽；通過微通道與微室互連的存儲(chǔ)PCR混合物的部件，其為微室提供PCR混合物；加熱和冷卻微室的加熱部件和冷卻部件。13.條目12的儀器，其中微室的表面具有多個(gè)柱狀物。14.條目13的儀器，其中柱狀物之間的間距為8 50 μ m。15.條目12的儀器，其中所述親水性官能團(tuán)選自羥基、胺基、羧基、多羧基和硅烷醇基。16.條目12的儀器，其中所述包含核酸的樣品為血液、血清、尿、唾液或存在于細(xì)胞培養(yǎng)物液體中的細(xì)菌的細(xì)胞溶解產(chǎn)物。17.用于順序進(jìn)行核酸的濃縮和擴(kuò)增的儀器，所述儀器包括包括在其表面上具有親水性官能團(tuán)的微室的芯片；和包括位于其上的芯片的核酸擴(kuò)增部件。18.包括條目12或17的儀器的芯片實(shí)驗(yàn)室。


通過參考附圖詳細(xì)描述其示例性實(shí)施方案，本發(fā)明上述以及其他特征和優(yōu)勢(shì)將更為明顯，其中圖I為圖解如何根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方案在單個(gè)微室中實(shí)施核酸的濃縮和擴(kuò)增的視圖；圖2為圖解根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方案，在親液鹽的存在下，如何將核酸結(jié)合在微室的親水性表面上的視圖；圖3為顯示根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方案，相應(yīng)于芯片表面積的增加的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) (PCR)效率的圖表；圖4圖不兩個(gè)圖表,這兩個(gè)圖表顯不根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方案，相對(duì)于PEG濃度的 PCR效率；圖5圖不兩個(gè)圖表,這兩個(gè)圖表顯不根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方案,相對(duì)于BSA濃度的 PCR效率。圖6圖示根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方案，代表具有不同表面積的六種芯片的照片。圖7為顯示根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方案，不同表面積的六種芯片的DNA結(jié)合效率和PCR 效率的圖表。圖8為顯示根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方案，相應(yīng)于核酸濃度的PCR效率提高的圖表。圖9為標(biāo)準(zhǔn)曲線，其顯示相應(yīng)于大腸桿菌(E. coli)BL21gDNA的目標(biāo)基因拷貝數(shù)的 Ct值。濃縮核酸后，在標(biāo)準(zhǔn)曲線上為所測(cè)試芯片(芯片#2和芯片#6)的Ct值指定相應(yīng)位置。圖10為顯示根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方案，相應(yīng)于來自細(xì)胞溶解產(chǎn)物的核酸的濃縮和純化的PCR效率增加的圖表。圖11為標(biāo)準(zhǔn)曲線，其顯示相應(yīng)于E. coli BL21細(xì)胞數(shù)目的Ct值。濃縮核酸后，在標(biāo)準(zhǔn)曲線上為所測(cè)試芯片(芯片#2)的Ct值指定相應(yīng)位置。
具體實(shí)施例方式現(xiàn)在將參考附圖更為充分地描述本發(fā)明，附圖中顯示本發(fā)明的示例性實(shí)施方案。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方案，提供在單個(gè)微室中順序進(jìn)行核酸的濃縮和擴(kuò)增的方法， 所述方法包括向具有親水性表面的微室中加入含核酸的樣品和含親液鹽的溶液，以通過將核酸結(jié)合在微室的表面上而濃縮核酸；和通過向所述微室添加PCR混合物來實(shí)施PCR。本發(fā)明涉及在單個(gè)微室中制備用于核酸分析的樣品和實(shí)施實(shí)時(shí)PCR的技術(shù)。為擴(kuò)增和檢測(cè)目標(biāo)基因，必須從生物樣品分離和純化DNA。通過純化步驟去除存在于細(xì)胞溶解產(chǎn)物中且抑制PCR的多種雜質(zhì)。在常規(guī)方法中，在單獨(dú)的微室中純化、擴(kuò)增和檢測(cè)特定基因， 因此在基因分析中耗費(fèi)了大量時(shí)間和成本，并且樣品交叉污染的可能性很高。在本發(fā)明中， 核酸純化/濃縮和核酸擴(kuò)增是集成化的，因此簡化了分析過程，并且減小了交叉污染的風(fēng)險(xiǎn)。圖I為圖解如何根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方案在單個(gè)微室中實(shí)施核酸的濃縮和擴(kuò)增的視圖。在單個(gè)微室中從包含核酸的生物樣品純化和濃縮目標(biāo)基因，然后所純化和濃縮的目標(biāo)基因在微室中擴(kuò)增，從而進(jìn)行實(shí)時(shí)檢測(cè)。然而，這必須滿足幾個(gè)要求。首先，用于DNA純化和濃縮的試劑不應(yīng)影響實(shí)時(shí)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)，因此不能使用PCR抑制劑如離液鹽和乙醇。第二，PCR必須在具有大的表面積的SiO2芯片中進(jìn)行，而SiO2的表面起到PCR抑制劑的作用，因此需要添加適當(dāng)?shù)奶砑觿┮詼p少PCR抑制。第三，所述SiO2芯片必須具有高的DNA結(jié)合效率。為解決這些問題，用親液鹽代替?zhèn)鹘y(tǒng)上用于純化核酸的離液鹽。使用離液鹽時(shí)，微室表面脫水，核酸通過氫鍵直接結(jié)合到微室，因此核酸的結(jié)合受PH的影響，并且離液鹽起到PCR抑制劑的作用。相反，使用親液鹽時(shí)，微室的表面是水合的，因此在微室的表面上形成穩(wěn)定的水層。核酸可以通過親水性相互作用的鹽析效應(yīng)在微室的表面上被水合。圖2為圖解根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方案，在親液鹽的存在下，如何將核酸結(jié)合在微室的親水性表面上的視圖。由圖2可以看到，由于親液鹽的鹽析效應(yīng)，硅石底物(圖2的左邊部分)通過氫鍵與水結(jié)合，所形成的水層(圖2的中間部分)再次與核酸(圖2的右邊部分)形成氫鍵，因此核酸借助穩(wěn)定的水層結(jié)合于微室。因此，核酸與微室結(jié)合不需要傳統(tǒng)上核酸結(jié)合所需的酸性條件，并且微室的表面不必限于硅石。在根據(jù)本發(fā)明實(shí)施方案的核酸濃縮中，當(dāng)加入包含核酸的樣品和包含親液鹽的溶液時(shí)，由于親液鹽的鹽析效應(yīng)，水在微室的表面形成氫鍵，然后所形成的水層再次與核酸形成氫鍵，結(jié)果，核酸結(jié)合于微室的表面。核酸結(jié)合在微室表面之后，通過洗去除核酸外的未結(jié)合于微室的其它成分，可以將核酸純化和濃縮為更純的形式。核酸結(jié)合于微室時(shí)所使用的溶液可以用作沖洗液，所述沖洗液的濃度低于核酸結(jié)合于微室時(shí)所使用的親液鹽的濃度。在根據(jù)本發(fā)明當(dāng)前實(shí)施方案的擴(kuò)增核酸的方法中，將PCR混合物添加到在其中濃縮核酸的微室中，然后使用結(jié)合到微室表面的或者從微室表面分離的目標(biāo)核酸實(shí)施PCR。本領(lǐng)域技術(shù)人員將會(huì)理解，PCR混合物的組成和濃度將根據(jù)所加入的聚合酶而變化。此外,可以依據(jù)所要擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物的長度、模板與引物之間的序列同源性、引物的長度等適當(dāng)?shù)剡x擇PCR條件。在根據(jù)本發(fā)明當(dāng)前實(shí)施方案的濃縮和擴(kuò)增核酸的方法中，可以在PCR方法中添加聚乙二醇和牛血清白蛋白(BSA)。SiO2的表面在具有大的表面積的微室中起到PCR抑制劑的作用，因此需要添加適當(dāng)?shù)奶砑觿┮詼p小抑制。因此，在本發(fā)明的實(shí)施方案中，通過添加聚乙二醇(PEG)和牛血清白蛋白(BSA)來提高PCR擴(kuò)增效率。聚乙二醇和牛血清白蛋白 (BSA)的濃度可以分別為1-10體積％和O. l-10mg/ml。PEG和BSA的濃度超出這些范圍時(shí)， PCR擴(kuò)增效率降低。在根據(jù)本發(fā)明當(dāng)前實(shí)施方案的濃縮和擴(kuò)增核酸的方法中，微室的表面可以具有許多柱狀物。為了增加包含核酸的樣品與微室接觸的機(jī)會(huì)，微室的表面優(yōu)選具有柱狀結(jié)構(gòu)而非平面結(jié)構(gòu)，所述柱狀結(jié)構(gòu)具有大的表面積。所述柱狀物可以具有不同的形狀，如正方形、 矩形、菱形、圓柱狀、圓錐狀、六邊形、八邊形等。柱狀物之間的間距可以為8 50 μ m。柱狀物之間的間距超出此范圍時(shí)，核酸的結(jié)合和擴(kuò)增效率降低。在根據(jù)本發(fā)明當(dāng)前實(shí)施方案的濃縮和擴(kuò)增核酸的方法中，微室的親水性官能團(tuán)可以是任何的親水性基團(tuán)如羥基、胺基、羧基、多羧基(polycarboxyl)、硅烷醇基等等。在根據(jù)本發(fā)明當(dāng)前實(shí)施方案的濃縮和擴(kuò)增核酸的方法中，親液鹽可以為硫酸鹽 (S042_)、磷酸鹽(ΗΡ042_)、氫氧化物(0H_)、氟化物(F_)、甲酸鹽(HC00_)、乙酸鹽(CH3C00_)等等，但不限于這些。親液鹽誘導(dǎo)蛋白質(zhì)結(jié)晶，作為疏水粒子的鹽析離子，形成按照霍夫邁斯特序(Hofmeister series)的水的結(jié)構(gòu)。在根據(jù)本發(fā)明當(dāng)前實(shí)施方案的濃縮和擴(kuò)增核酸的方法中，含核酸的樣品和含親液鹽的溶液可以具有3-10的pH。包括含核酸樣品的溶液和含親液鹽溶液的溶液的pH超出此范圍時(shí)，DNA可能會(huì)物理和化學(xué)變性，并且影響隨后的進(jìn)程。在根據(jù)本發(fā)明當(dāng)前實(shí)施方案的濃縮和擴(kuò)增核酸的方法中，親液鹽的濃度可以為 100 2，OOOmM。親液鹽的濃度小于IOOmM時(shí)，結(jié)合于微室的核酸的結(jié)合效率降低。親液鹽的濃度大于2，OOOmM時(shí)，很難制備所述溶液。在根據(jù)本發(fā)明當(dāng)前實(shí)施方案的濃縮和擴(kuò)增核酸的方法中，含核酸的樣品可以為血液、血清、尿、唾液或存在于細(xì)胞培養(yǎng)物液體中的細(xì)菌的細(xì)胞溶解產(chǎn)物，但不限于這些。根據(jù)本發(fā)明實(shí)施方案的含核酸樣品可以來自哺乳動(dòng)物、植物、細(xì)菌、或酵母。樣品可以為單細(xì)胞形式或組織形式，所述細(xì)胞或組織可以源于體外培養(yǎng)物。根據(jù)本發(fā)明的另一實(shí)施方案，提供用于順序進(jìn)行核酸的濃縮和擴(kuò)增的儀器，所述儀器包括在其表面上具有親水性官能團(tuán)的微室；通過微通道與微室互連的存儲(chǔ)含核酸樣品的部件，其為微室提供含核酸樣品；通過微通道與微室互連的存儲(chǔ)親液鹽溶液的部件，其為微室提供親液鹽；通過微通道與微室互連的存儲(chǔ)PCR混合物的部件，其為微室提供PCR混合物；加熱和冷卻微室的加熱部件和冷卻部件。根據(jù)本發(fā)明當(dāng)前實(shí)施方案的用于濃縮和擴(kuò)增核酸的儀器基本上包括在其表面上具有親水性官能團(tuán)的微室，存儲(chǔ)含核酸樣品的部件，存儲(chǔ)親液鹽溶液的部件，存儲(chǔ)PCR混合物的部件以及加熱部件和冷卻部件。在根據(jù)本發(fā)明當(dāng)前實(shí)施方案的用于濃縮和擴(kuò)增核酸的儀器中，所述微室包括芯片中的微室，并且在其表面上具有親水性官能團(tuán)，其因此與水一起形成氫鍵，從而構(gòu)成水層。所形成的穩(wěn)定水層與核酸結(jié)合。所述親水性官能團(tuán)可以為任何親水性基團(tuán)如羥基、胺基、羧基、多羧基、硅烷醇基等等。所述存儲(chǔ)含核酸樣品的部件是為微室提供含核酸樣品、且通過微通道與微室互連的部件。存儲(chǔ)親液鹽溶液的部件是為微室提供親液鹽、且通過微通道與微室互連的部件。 當(dāng)把要分離的含核酸樣品加入到儀器中時(shí)，存儲(chǔ)親液鹽溶液的部件為微室提供親液鹽，含核酸樣品和親液鹽在儀器中混合，并且，由于親液鹽的鹽析效應(yīng)，核酸結(jié)合于微室。存儲(chǔ)PCR混合物的部件是為微室提供PCR混合物、且通過微通道與微室互連的部件。核酸在微室中濃縮后，存儲(chǔ)PCR混合物的部件將PCR混合物注入到微室中以實(shí)施PCR。加熱部件和冷卻部件是加熱和冷卻微室的部件，當(dāng)把PCR混合物加入到微室中時(shí)，加熱部件和冷卻部件通過根據(jù)PCR條件加熱和冷卻來控制微室的溫度。在根據(jù)本發(fā)明當(dāng)前實(shí)施方案的用于濃縮和擴(kuò)增核酸的儀器中，微室的表面可以具有許多柱狀物。為了增加含核酸樣品與微室接觸的機(jī)會(huì)，微室的表面優(yōu)選具有柱狀結(jié)構(gòu)而非平面結(jié)構(gòu)，所述柱狀結(jié)構(gòu)具有大的表面積。所述柱狀物可以有多種形狀，如正方形、矩形、 菱形、圓柱狀、圓錐狀、六邊形、八邊形等。柱狀物之間的間距可以為8 50 μ m。柱狀物之間的間距超出此范圍時(shí)，核酸的結(jié)合和擴(kuò)增效率降低。在根據(jù)本發(fā)明當(dāng)前實(shí)施方案的用于濃縮和擴(kuò)增核酸的儀器中，含核酸的樣品可以為血液、血清、尿、唾液或存在于細(xì)胞培養(yǎng)物液體中的細(xì)菌的細(xì)胞溶解產(chǎn)物，但不限于這些。 根據(jù)本發(fā)明實(shí)施方案的含核酸的樣品可以來自哺乳動(dòng)物、植物、細(xì)菌、或酵母。樣品可以為單細(xì)胞形式或組織形式，所述細(xì)胞或組織可以源于體外培養(yǎng)物。根據(jù)本發(fā)明的另一實(shí)施方案，提供用于順序進(jìn)行核酸的濃縮和擴(kuò)增的儀器，所述儀器包括包括在其表面上具有親水性官能團(tuán)的微室的芯片；和在其上裝配了所述芯片的核酸擴(kuò)增部件。根據(jù)本發(fā)明當(dāng)前實(shí)施方案的用于濃縮和擴(kuò)增核酸的儀器包括芯片和核酸擴(kuò)增部件，所述芯片包括在其表面上具有親水性官能團(tuán)的微室，且所述芯片包括單個(gè)微室。所述微室在其表面上具有親水性官能團(tuán)，因此，當(dāng)把含核酸的樣品和包含親液鹽的溶液加入到微室中時(shí)，核酸結(jié)合在微室的表面上，核酸被濃縮。核酸擴(kuò)增部件包括位于其上的芯片， 并且在芯片的微室中擴(kuò)增濃縮的核酸。將所述芯片置于微室中，所述芯片包括在其中濃縮核酸的微室，并且將PCR混合物加入到微室中，然后實(shí)施PCR以擴(kuò)增濃縮的核酸。根據(jù)本發(fā)明的另一實(shí)施方案，提供包括用于濃縮和擴(kuò)增核酸的儀器的芯片實(shí)驗(yàn)室。在根據(jù)本發(fā)明實(shí)施方案的用于濃縮和擴(kuò)增核酸的儀器中，每種功能組件都可以通過利用已知的微流體技術(shù)和MEMS裝置的芯片方法(process-on-a-chip)而工作，并且可以通過芯片實(shí)驗(yàn)室進(jìn)一步工作。以下將參考下述的實(shí)施例更詳細(xì)地描述本發(fā)明。這些實(shí)施例僅僅用于說明性目的，而不是意味著限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例I :依據(jù)芯片表面積增加的PCR效率依據(jù)芯片表面積的增加測(cè)定了 PCR效率。用TMC1000 (Samsung)儀器實(shí)施了 PCR。 TMC1000是在基于硅的芯片上實(shí)施定量PCR的儀器。除非另有說明，所有實(shí)施例中使用的模板DNA都是E. coli BL21的基因組DNA，每個(gè)反應(yīng)使用1.4X105個(gè)拷貝。一個(gè)拷貝基因組DNA具有七個(gè)目標(biāo)核酸(16s-rRNA基因)，因此每個(gè)反應(yīng)共計(jì)包括IO6個(gè)目標(biāo)基因拷貝。 正向引物(YCCAKACTCCTACGGGAGGC ；SEQ ID NO 1)和反向引物(GTATTACCGCRRCTGCTGGCAC ； SEQ ID NO 2)用作 PCR 引物。除非另有說明，PCR混合物包括 I XPCR 緩沖液(Solgent Co. Ltd. )、5· OmMMgCl2, 200 μ M dNTP、0. 2μΜ 的每種引物、O. lmg/ml BSA、和 O. IU/μ I 的 Taq DNA 聚合酶。PCR 的溫度條件如下。在EppendorfPCR管中實(shí)施PCR -MV 5分鐘I個(gè)循環(huán)，94°C 30秒、62°C 30 秒和72°C 30秒30個(gè)循環(huán)，然后用Bioanalyzer(Agilent)對(duì)所獲得的PCR產(chǎn)物進(jìn)行定量。 在芯片中實(shí)施PCR -MV I分鐘I個(gè)循環(huán)，94°C 5秒、62°C 5秒和72°C 20秒40個(gè)循環(huán)，然后用TMC1000 (Samsung)儀器實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)所獲得的PCR產(chǎn)物。圖3為顯示根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方案，依據(jù)芯片表面積的增加的PCR效率的圖表。由圖3可以看到，芯片表面積相對(duì)于體積的比值越高，所獲得的PCR產(chǎn)物的量越少，并且所生產(chǎn)的PCR產(chǎn)物的量也與芯片表面積相對(duì)于體積的比值密切相關(guān)。因此，為了用具有大的表面積的芯片實(shí)施PCR，需要添加其它的添加劑以減小PCR抑制。實(shí)施例2 依據(jù)PEG濃度的PCR效率對(duì)于具有大的表面積的芯片，測(cè)定了根據(jù)聚乙二醇(PEG)濃度的PCR效率。除了通過分別向PCR混合物添加濃度為O. 31 %、I. 25 %、2. 5 %、5 %和10 %的PEG而制備了 5個(gè)樣品外，以與實(shí)施例I中相同的方式實(shí)施PCR。圖4圖不兩個(gè)圖表,這兩個(gè)圖表顯不相對(duì)于 PEG濃度的PCR效率。圖4中，左邊的圖表顯示Rn值，右邊的圖表顯示熒光測(cè)定值Ct。所述熒光測(cè)定值Ct通過測(cè)定熒光的量來表示，所述熒光的量是作為閾值循環(huán)實(shí)時(shí)擴(kuò)增的。使用相同的樣品時(shí)，Ct值越低，PCR效率越高。Ct為表示I個(gè)循環(huán)差異代表加倍或減半的DNA濃度的單位。Rn與PCR產(chǎn)物的濃度有關(guān)，Rn值越高，PCR產(chǎn)物的濃度越高。如圖4所示，當(dāng)添加5% (w/w)的PEG時(shí)，Rn具有最高值，Ct具有最低值，因此獲得最高的PCR效率。實(shí)施例3 依據(jù)BSA濃度的PCR效率對(duì)于具有大的表面積的芯片，測(cè)定了與牛血清白蛋白(BSA)濃度有關(guān)的PCR效率。 除了向PCR混合物添加了 5%的PEG,并且通過向其添加O. 62mg/ml、l. 25mg/ml、2. 5mg/ml、 5mg/ml和10mg/ml的BSA而制備了 5個(gè)樣品外，以與實(shí)施例I相同的方式實(shí)施了 PCR。圖5 圖示兩個(gè)圖表，這兩個(gè)圖表顯示根據(jù)BSA濃度的PCR效率。圖5中，左邊的圖表顯示Rn值， 右邊的圖表顯示Ct值。如圖5所示，添加O. 62mg/ml BSA時(shí)，Rn具有最高值，Ct具有最低值，因此獲得最高的PCR效率。實(shí)施例4 :依據(jù)具有不同表面積的芯片的PCR效率為了測(cè)定根據(jù)具有不同表面積的芯片的PCR效率，制備了六種芯片。制備基于硅的芯片(硅/二氧化硅)的方法如下(I)薄片沖洗薄片在Piranah溶液(H2SO4 : H2O2 = 3 : 1,120°C )中處理15分鐘,在流水下沖
洗后干燥。(2)六甲基二硅氮烷(HMDS)涂覆用旋轉(zhuǎn)涂布機(jī)將5ml六甲基二硅氮烷(HMDS)涂覆在沖洗過的薄片上，以500rpm 涂覆5秒和4000rpm涂覆40秒，然后涂覆過的薄片在電熱板中于120°C烘烤兩分鐘。(3)PR 涂覆將5ml光刻膠(GXR 601)涂覆在烘烤過的薄片上，然后以500rpm 5秒和4000rpm
40秒進(jìn)行涂覆。(4)溫和烘烤(soft baking)PR-涂覆的薄片用電熱板于95°C烘烤兩分鐘。(5)紫外線(UV)輻照將用于制造柱狀物的掩膜安裝在UV光刻機(jī)(aligner) (i-line)中，然后照射 250mJ的紫外線。(6)顯影用MIF 300顯影劑進(jìn)行顯影。(7)強(qiáng)烈烘烤(hard baking)已顯影的薄片于115°C強(qiáng)烈烘烤兩分鐘。(8)深層 RIE用STS ICP-RIE裝置蝕刻烤干的薄片達(dá)100 μ m的硅。(9)灰化用灰化裝置從蝕刻的薄片中灰化光刻膠。(10) PR 剝離灰化的薄片在Piranah溶液中處理15分鐘，沖洗并干燥以去除和洗去殘留的PR。(11)氟化氫(HF)加工用稀釋的HF處理所得薄片一分鐘，去除天然氧化物。(12)硅氧化
9
為了進(jìn)行SiO2顯影，用蒸氣進(jìn)行濕熱氧化以顯影3000A的厚度。(13)薄片沖洗所述薄片在Piranah溶液中處理15分鐘，沖洗并干燥。(14)陽極鍵合(Anodic bonding)將玻璃基板置于(13)中沖洗過的薄片上，400°C加熱并向其施加1000伏的電壓以制成微芯片。圖6圖示根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方案，代表具有不同表面積的六種芯片的照片?？梢砸霕悠返闹鶢钗锍叽纭⒅鶢钗镏g的間距、柱狀物高度、總表面積、體積、表面積與體積的比值如表I所示。表I
權(quán)利要求
1.用于順序進(jìn)行核酸的濃縮和擴(kuò)增的儀器，所述儀器包括在其表面上具有親水性官能團(tuán)的微室；通過微通道與微室互連的存儲(chǔ)含核酸樣品的部件，其為微室提供含核酸的樣品；通過微通道與微室互連的存儲(chǔ)親液鹽溶液的部件，其為微室提供親液鹽；通過微通道與微室互連的存儲(chǔ)PCR混合物的部件，其為微室提供PCR混合物；以及加熱和冷卻微室的加熱部件和冷卻部件。并不
2.權(quán)利要求I的儀器，其中微室的表面具有多個(gè)柱狀物。
3.權(quán)利要求2的儀器，其中柱狀物之間的間距為8 50μ m。
4.權(quán)利要求I的儀器，其中所述親水性官能團(tuán)選自羥基、胺基、羧基、多羧基和硅烷醇基。
5.權(quán)利要求I的儀器，其中所述包含核酸的樣品為血液、血清、尿、唾液或存在于細(xì)胞培養(yǎng)物液體中的細(xì)菌的細(xì)胞溶解產(chǎn)物。
6.包括權(quán)利要求I的儀器的芯片實(shí)驗(yàn)室。
全文摘要
提供在單個(gè)微室中順序進(jìn)行核酸的濃縮和擴(kuò)增的方法，該方法包括向具有親水性表面的微室中加入含核酸的樣品和含親液鹽的溶液，從而通過將核酸結(jié)合在微室表面上來濃縮核酸；和通過向微室中添加PCR混合物而實(shí)施聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)。由于核酸可逆地結(jié)合在微室表面，因而與發(fā)生不可逆結(jié)合的氧化鋁的表面相比，PCR產(chǎn)率更高。此外，所有的工藝都在單個(gè)微室中順序進(jìn)行，從而可以減少樣品和消耗品的量，可以減少處理和分析中耗費(fèi)的時(shí)間和勞動(dòng)，由于通過排除運(yùn)輸樣品的過程而無樣品損失，因而可以提高檢測(cè)靈敏度，并且能夠顯著地減小交叉污染的危險(xiǎn)。因此，建立用于濃縮和擴(kuò)增核酸的完整的自動(dòng)化系統(tǒng)是容易的。
文檔編號(hào)C12M1/34GK102586093SQ20121003276
公開日2012年7月18日 申請(qǐng)日期2006年12月29日 優(yōu)先權(quán)日2006年5月22日
發(fā)明者劉昌恩, 李仁鎬, 李英善, 金榮錄, 閔畯泓, 韓基雄 申請(qǐng)人:三星電子株式會(huì)社