專(zhuān)利名稱(chēng)：一種產(chǎn)生慶大霉素C1a的工程菌及其構(gòu)建方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于抗生素制藥領(lǐng)域，涉及一種主要產(chǎn)生慶大霉素Cla組分的工程菌及其構(gòu)建方法與應(yīng)用，可以應(yīng)用于抗生素制藥領(lǐng)域，應(yīng)用空間較大。具體涉及一種產(chǎn)生慶大霉素 Cla的工程菌及其構(gòu)建方法。
背景技術(shù)：
小單孢菌是一屬能產(chǎn)生多種具有臨床價(jià)值抗生素的微生物，在先后報(bào)道的60種小單孢菌中，就有40多種產(chǎn)生抗生素，其中包括大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)、氨基糖苷類(lèi)、安莎類(lèi)和蒽環(huán)類(lèi)等等。小單孢菌不僅可以產(chǎn)生鏈霉菌所產(chǎn)生的抗生素，還產(chǎn)生慶大霉素(Gentamicin)、西索米星(Sisomicin)、阿司米星(Astromivin)等。小單孢菌有巨大的潛力，日益受到人們的重視。慶大霉素(Gentamicin, GM)是由放線(xiàn)菌屬絳紅小單孢菌(Micromonospora purpurea)、棘孢小單孢菌(Micromonospora echinospora )發(fā)酵產(chǎn)生的氨基糖苷類(lèi)廣譜抗生素，對(duì)多種革蘭陰性菌和陽(yáng)性菌有較強(qiáng)的抗菌作用。1963年被美國(guó)人Weinstein首次發(fā)現(xiàn)，1969年被用于臨床，它也是我國(guó)獨(dú)立自主研制成功的廣譜抗生素。慶大霉素各組分在結(jié)構(gòu)上很相近，由三個(gè)環(huán)狀結(jié)構(gòu)組成，分別為絳紅糖胺，2-脫氧鏈霉胺和加拉糖胺。根據(jù)分子結(jié)構(gòu)的差異可以分為慶大霉素C，慶大霉素A，慶大霉素B和慶大霉素X等。慶大霉素C是主組分，2-脫氧鏈霉胺分別在4、6位上通過(guò)苷鍵連接絳紅糖胺和加拉糖胺。因絳紅糖胺C6’上的甲基化程度不同，形成了 Cl、C2、Cla三個(gè)組分。慶大霉素不同組分的抗菌活性因它們與細(xì)菌核糖體的親和力不同而異，最有效的成分為Cla，它的活性略高于C2，而Cl與細(xì)菌核糖體的親和力最弱。慶大霉素Cla組分可作為合成抗菌藥物依替米星的前體藥物，應(yīng)用空間較大。慶大霉素的生物合成基因簇已被克隆。根據(jù)抗性基因與合成基因連鎖的規(guī)律， Unwin等用已報(bào)道的慶大霉素抗性基因設(shè)計(jì)引物，認(rèn)Micromonospora echinospora ATCC15835基因組質(zhì)粒文庫(kù)為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，從1000個(gè)質(zhì)粒中篩選到I個(gè)陽(yáng)性克隆，包括38kb的外源片段，其中有28個(gè)完整的0RF。其中，講訪(fǎng)基因的功能已經(jīng)被證實(shí)。講沐基因編碼產(chǎn)物與olivasterospora中的基因產(chǎn)物有57%的同源性。 Fms7催化福提霉素6’位甲基化，使KLl轉(zhuǎn)變?yōu)镵K1，所以推斷皮 沐為6’ -C位甲基化酶基因。同時(shí)，慶大霉素與西索米星的化學(xué)結(jié)構(gòu)非常相似，推測(cè)它們有相似的生物合成路線(xiàn)和相似功能的基因。慶大霉素化學(xué)結(jié)構(gòu)中比西索米星多6’-C位的甲基，而在它們生物合成基因的比對(duì)中發(fā)現(xiàn)，西索米星生物合成基因簇中沒(méi)有與講沐相似的基因，所以推測(cè)講沐為6’-C 甲基化酶基因。而慶大霉素Cla在6’ -N位甲基轉(zhuǎn)移酶的作用下繼續(xù)合成慶大霉素C2b。慶大霉素Cla最常采用的制備方法為從小諾霉素的發(fā)酵液中分離得到。該方法通常包括發(fā)酵，將發(fā)酵液經(jīng)過(guò)過(guò)濾得到濾液，濾液經(jīng)脫色濃縮、濃縮液用大孔吸附樹(shù)脂吸附、用三種不同比例的乙醇一氨水進(jìn)行洗脫、解析，解析液經(jīng)濃縮、噴霧干燥得到慶大霉素Cla。 這種方法存在不足之處，例如生產(chǎn)周期長(zhǎng)(480小時(shí)/批)；生產(chǎn)工藝復(fù)雜，樹(shù)脂吸附后需用混合溶液經(jīng)過(guò)三次洗脫、解析才能得到慶大霉素Cla ;混合洗脫劑和解析劑中的乙醇采用蒸餾塔回收，設(shè)備復(fù)雜，需消耗大量蒸汽；所用大孔吸附樹(shù)脂的吸附量?。划a(chǎn)品含量低(一般為85% — 90%);原材料消耗大，成本高。另一種生產(chǎn)慶大霉素Cla的方法為篩選慶大霉素Cla高產(chǎn)菌株。通過(guò)誘變慶大霉素產(chǎn)生菌絳紅小單孢菌，獲得慶大霉素Cla高產(chǎn)菌株，通過(guò)分離純化方法得到。但該方法對(duì)研究的菌株遺傳背景研究不清晰，菌株發(fā)酵產(chǎn)物中仍然可能有慶大霉素其他C組分的存在。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明通過(guò)基因工程的方法將負(fù)責(zé)慶大霉素生物合成C-6位甲基轉(zhuǎn)移酶的編碼基因阻斷，從而使生產(chǎn)菌不能合成慶大霉素C組分。所得菌株產(chǎn)生的Cla含量高，且菌株遺傳背景較清楚，不會(huì)發(fā)生回復(fù)突變。本發(fā)明的目的是提供一種主要產(chǎn)生慶大霉素Cla組分的工程菌。本發(fā)明的另一目的是提供該基因工程菌株的構(gòu)建方法。本發(fā)明的進(jìn)一步目的是基因工程菌的應(yīng)用。本發(fā)明通過(guò)框架內(nèi)刪除失活的方法破壞絳紅小單孢菌中的皮7沐基因，主要包括以下步驟
(I)講沐基因阻斷質(zhì)粒的構(gòu)建
本發(fā)明構(gòu)建了一種重組穿梭質(zhì)粒，其含有缺失348bp保守序列的講沐基因及其上下游部分序列。本發(fā)明所述的重組穿梭質(zhì)粒的骨架是pKC1139。(2)阻斷質(zhì)粒轉(zhuǎn)化絳紅小單孢菌
將所述的重組穿梭質(zhì)粒轉(zhuǎn)化慶大霉素產(chǎn)生菌，得到轉(zhuǎn)化子。所述的轉(zhuǎn)化方法為接合轉(zhuǎn)移，慶大霉素產(chǎn)生菌為絳紅小單孢菌。(3)雙交換阻斷株的篩選
雙交換篩選是根據(jù)抗性表型，篩選獲得同源基因雙交換阻斷突變株，對(duì)阻斷變株在基因水平發(fā)生的DNA雙交換進(jìn)行PCR驗(yàn)證，從而篩選到組分發(fā)生變化的轉(zhuǎn)化子。(4)發(fā)酵產(chǎn)物的分析
發(fā)酵產(chǎn)物分析為原株和變株的發(fā)酵液經(jīng)酸堿處理和上樹(shù)脂柱除雜后采用薄層色譜 TLC、生物顯影、HPLC-ELSD和MS等方法分析其產(chǎn)物變化情況。本發(fā)明主要產(chǎn)生的慶大霉素Cla組分可作為合成抗菌藥物依替米星的前體藥物， 應(yīng)用空間較大。本發(fā)明將絳紅小單孢菌進(jìn)行改造，敲除了講沐基因部分保守序列，得到了一種主要產(chǎn)生慶大霉素Cla的基因工程菌。本發(fā)明所構(gòu)建的基因工程菌提高了慶大霉素 Cla的產(chǎn)量。本發(fā)明的制備方法中雙交換雙臂的長(zhǎng)度分別為1300bp和1500bp，雙交換發(fā)生的幾率較高，雙交換結(jié)合子的篩選較快。得到的慶大霉素Cla產(chǎn)生菌命名purpurea gntlf,保藏編號(hào) CGMCC NO. 4838，保藏單位中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物菌種保藏中心，保藏地址北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路I號(hào)院3號(hào)，保藏日期2011年5月9日。


圖I是講沐基因阻斷質(zhì)粒的構(gòu)建過(guò)程；
圖2是原菌株與敏感菌株P(guān)CR驗(yàn)證的電泳圖譜 I. λ -DNA/ HindIII marker ；2.原菌株；3·阻斷株；
圖3是基因工程菌發(fā)酵液的薄層色譜圖
I為慶大霉素Cla標(biāo)準(zhǔn)品，2為慶大霉素標(biāo)準(zhǔn)品，3為原始囷株發(fā)酵液，4為基因工程囷株發(fā)酵液，5為慶大霉素C2b標(biāo)準(zhǔn)品。A為Cl，B為C2，C為Cla，D為C2b ;
圖4是慶大霉素標(biāo)準(zhǔn)品和基因工程菌發(fā)酵液的HPLC-ELSD圖譜；
A為慶大霉素標(biāo)準(zhǔn)品，B為原始菌發(fā)酵液，C為基因工程菌發(fā)酵液，D為C2b標(biāo)準(zhǔn)品圖5是慶大霉素Cla的質(zhì)譜圖。
-TGCTCTAGACGGGTAGAACGGGTTGGTCC -3’ 帶有油a I 酶切
-CGGAATTCCAGCGTTGGCAATAATCATCAGC -3’ 帶有 &oR I 酶
具體實(shí)施例方式實(shí)施例I :講沐基因阻斷質(zhì)粒的構(gòu)建
根據(jù)已經(jīng)發(fā)表的Micromonospora echinospora 相應(yīng)序列(GenBank登錄號(hào) AY524043)設(shè)計(jì)引物
左臂上游引物K1 5’ - TCCAAGCTTGTACCCTCGGAGCCGGTCTTGT-3’ 帶有歷/ d III酶切位點(diǎn)；
左臂下游引物K2 5’ - TGCTCTAGACTGGGTTGCGTCTGCGTGAT -3’ 帶有油a I 酶切位點(diǎn)；擴(kuò)增I. 3kb片段Pl ；
右臂上游引物K3 位點(diǎn)；
右臂下游引物Κ4 切位點(diǎn)；擴(kuò)增1.5kb片段Ρ2。以絳紅小單孢菌總DNA為模板，PCR擴(kuò)增I. 3kb和I. 5kb這兩個(gè)片段，刪除了基因內(nèi)部348bp的保守序列，PCR反應(yīng)的條件為(I) 95°C預(yù)變性5min ；(2)解鏈95°C X 90 s ； 退火 55°C X30 s ;延伸 72°C X3 min ;30 個(gè)循環(huán)；(3)72°C X7 min。將 PCR產(chǎn)物 Pl 片段電泳回收，皆Mindl 11和Xba I雙酶切后，連入經(jīng)同樣雙酶切后的pi J2925上，轉(zhuǎn)化大腸桿菌 DH-5 α感受態(tài)，篩選陽(yáng)性克隆，獲得重組質(zhì)粒pMPKOl。質(zhì)粒pMPKOl經(jīng)油al和&oRI雙酶切后，電泳回收，與經(jīng)過(guò)相同酶處理過(guò)的P2片段連接。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH-5ci感受態(tài)，篩選陽(yáng)性克隆，獲得重組質(zhì)粒PMPK02。PMPK2刪除了目的基因內(nèi)部的348bp保守序列。 質(zhì)粒pMPK02經(jīng)歷idIII和&oRI雙酶切后，電泳回收P1+P2片段，連入經(jīng)同樣雙酶切后的 PKC1139上，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH-5 α感受態(tài)，篩選陽(yáng)性克隆，獲得重組質(zhì)粒ρΜΡΚ03。實(shí)施例2 阻斷質(zhì)粒ρΜΡΚ03轉(zhuǎn)化絳紅小單孢菌
將含有oriT的穿梭質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌ET12567 (pUZ8002)中，得到供體菌株大腸桿菌 ET12567 (pUZ8002，供體質(zhì)粒)。將大腸桿菌ET12567 (pUZ8002，供體質(zhì)粒)單菌落，接種于 3 ml LB培養(yǎng)基(加入作用濃度為25 Pg/ml卡那霉素和氯霉素以及50 μδ/πι1供體質(zhì)粒對(duì)應(yīng)的抗生素)中，37 °C培養(yǎng)過(guò)夜，按O. 2%轉(zhuǎn)種到20 ml含三種抗生素的LB培養(yǎng)基中，37 °C培養(yǎng)2. 5 3. O h，離心沉淀菌體，用新鮮的LB培養(yǎng)基洗滌兩次，最后將菌體懸浮于約7. 5 ml培養(yǎng)基中，鏡檢計(jì)數(shù)約為IO8數(shù)量級(jí)。制備絳紅小單孢菌單孢子懸液，用2 X YT培養(yǎng)基洗滌2次，溶解在一定體積2 X YT 中使單孢子濃度為108，50°C熱激活10 min，37°C水浴預(yù)培養(yǎng)2 3 h，冷卻至室溫。將處理好的供體菌O. 5 ml與絳紅小單孢菌單孢子懸液O. 5 ml于eppendorf管中混合，離心沉淀，用少量的殘液懸浮后涂布在MS培養(yǎng)基上。28°C培養(yǎng)2(T24 h，用800 μ 含安普霉素(濃度度50 Pg/ml)和吡哌酸(終濃度50 Pg/ml)的水溶液覆蓋。28°C繼續(xù)培養(yǎng) 144 h，平板上長(zhǎng)出菌落。實(shí)施例3 :雙交換阻斷株的篩選
將28°C培養(yǎng)長(zhǎng)出的轉(zhuǎn)化子傳加藥平板于37°C培養(yǎng)，因?yàn)樽钄噘|(zhì)粒在42°C都不能復(fù)制， 只有通過(guò)同源交換整合到染色體上之后接合子才會(huì)生長(zhǎng)，表現(xiàn)為安普霉素抗性，說(shuō)明接合子都發(fā)生了單交換整合。將單交換菌株在無(wú)藥平板上傳三代，挑350個(gè)單菌落分別點(diǎn)種到含藥和無(wú)藥的平板上，篩選出2株安普霉素敏感的菌株，提取這兩株菌的總DNA，PCR驗(yàn)證， 其中一株與對(duì)照一樣大，說(shuō)明其發(fā)生了單交換的脫落；另一株的片段比對(duì)照小，說(shuō)明其發(fā)生了雙交換，將這株菌命名為M purpurea gn tlT。實(shí)施例4 :發(fā)酵產(chǎn)物的分析
(1)絳紅小單孢菌基因工程菌的搖瓶發(fā)酵
將絳紅小單孢菌斜面用挖塊法接種于30mL種子培養(yǎng)基中，34°C搖床培養(yǎng)32_36h，10% 轉(zhuǎn)種于30mL發(fā)酵培養(yǎng)基中，34 °C搖床培養(yǎng)120h。種子培養(yǎng)基可溶性淀粉I. O,黃豆餅粉I. 5，葡萄糖O. 1，碳酸鈣O. 3，硝酸鉀
O.05 ；pH6. 8
發(fā)酵培養(yǎng)基可溶性淀粉5. O,黃豆餅粉3. 5，硫酸銨O. 05，蛋白胨O. 2，葡萄糖I. 5，硝酸鉀O. 05，碳酸鈣O. 6，氯化銨O. 1，玉米粉I. 5，氯化鈷10μ g/mL ；pH7. 5
(2)發(fā)酵液處理
用濃硫酸調(diào)節(jié)發(fā)酵液pH到I. 5,攪拌酸化30min,然后10000r/min離心IOmin,取上清并用2mol氫氧化鈉調(diào)pH至6. 8,10000r/min離心IOmin,取上清備用。(3)D152型樹(shù)脂除雜
將處理好的樹(shù)脂裝柱，用蒸餾水洗柱。然后將處理好的發(fā)酵液上柱，控制低流速，吸附后用蒸餾水洗脫至無(wú)色，用2mol的氨水解吸，用部分收集器收集。將有活性的解吸液合并。(4)薄層色譜分析
氯仿-甲醇-氨水(I 1:1)混合振搖，上相飽和，下相展開(kāi)。通過(guò)薄層色譜和生物顯影分析，可以發(fā)現(xiàn)與原始菌株相比，阻斷株的組分發(fā)生了變化。(5 ) HPLC-ELSD 分析
色譜柱為ODS C18柱(Diamonsil)，流動(dòng)相為0. 2mol/L三氟醋酸-甲醇(92 :8)，流速為每分鐘0. 6ml，用蒸發(fā)光檢測(cè)器檢測(cè)。原始菌株和阻斷株各組分的保留時(shí)間，峰面積和相對(duì)含量如下表
表一慶大霉素各組分標(biāo)準(zhǔn)品的保留時(shí)間
權(quán)利要求
1.一種基因工程菌，其特征是，該菌株主要產(chǎn)生慶大霉素Cla組分，將該基因工程菌命名為 Micromonospora purpurea ，其保藏編號(hào)為CGMCC NO. 4838。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的基因工程菌，其特征是，在野生菌株基因組中阻斷講沐基因。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的基因工程菌，其特征是，構(gòu)建基因工程菌的野生菌株，為慶大霉素產(chǎn)生菌絳紅小單胞菌或荊棘小單胞菌。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的基因工程菌，其特征是，阻斷基因的序列如SEQID No. I所不，基因相應(yīng)的氣基酸序列如SEQ ID No. 2所不。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的基因工程菌，其特征是，阻斷講沐基因的方法包括基因阻斷和基因替換。
6.一種如權(quán)利要求I所述的基因工程菌的構(gòu)建方法，其特征是，主要包括以下步驟(1)講沐基因阻斷質(zhì)粒的構(gòu)建；(2)^/7沐基因阻斷質(zhì)粒轉(zhuǎn)化絳紅小單孢菌；(3)講沐基因雙交換阻斷株的篩選；(4 )講沐基因阻斷變株發(fā)酵產(chǎn)物的分析。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的基因工程菌的構(gòu)建方法，其特征是，通過(guò)框架內(nèi)刪除失活構(gòu)建阻斷質(zhì)粒，該方法為PCR分別獲得講沐基因上下游片段I. 3kb和I. 5kb，刪除講沐基因內(nèi)部348bp的保守序列，將兩個(gè)片段同時(shí)連接到pIJ2925上，再通過(guò)歷·/ (! III，EcoR I雙酶切將這兩個(gè)片段連接到穿梭載體PKC1139上。
8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的基因工程菌的構(gòu)建方法，其特征是，所述的雙交換阻斷株的篩選是根據(jù)抗性表型，篩選獲得同源基因雙交換阻斷突變株，對(duì)阻斷突變株在基因水平發(fā)生的DNA雙交換進(jìn)行PCR驗(yàn)證，從而篩選到組分發(fā)生變化的轉(zhuǎn)化子。
9.根據(jù)權(quán)利要求6所述的基因工程菌的構(gòu)建方法，其特征是，所述的發(fā)酵產(chǎn)物分析為變株和原株的發(fā)酵液經(jīng)酸堿處理和上樹(shù)脂柱除雜后采用薄層色譜TLC、生物顯影、 HPLC-ELSD和MS分析其產(chǎn)物變化情況。
10.一種重組載體，其特征是，含有大腸桿菌和鏈霉菌復(fù)制起點(diǎn)，含有權(quán)利要求7中刪除后缺失部分保守序列的gn沐基因的溫敏型質(zhì)粒。
11.一種轉(zhuǎn)化子，其特征是，含有權(quán)利要求10所述的重組載體。
12.如權(quán)利要求11所述的轉(zhuǎn)化子，其特征在于，所述的轉(zhuǎn)化子的宿主細(xì)胞是大腸桿菌 ET12567。
13.權(quán)利要求I所述的基因工程菌在合成抗菌藥物中的應(yīng)用。
14.權(quán)利要求I所述的基因工程菌在產(chǎn)生慶大霉素Cla組分中的應(yīng)用。
15.根據(jù)權(quán)利要求14所述的應(yīng)用，其特征在于，包括將權(quán)利要求8所述的轉(zhuǎn)化子與產(chǎn)慶大霉素的絳紅小單孢菌接合，挑選接合子。
全文摘要
本發(fā)明屬于醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種主要產(chǎn)生慶大霉素C1a的工程菌及其構(gòu)建方法，是利用基因阻斷技術(shù)對(duì)慶大霉素產(chǎn)生菌棘孢小單孢菌中的6’-C-甲基轉(zhuǎn)移酶基因gntK進(jìn)行破壞，以阻斷慶大霉素C1，C2和C2a的合成，使其主要產(chǎn)生慶大霉素C1a和少部分的慶大霉素C2b。原始菌株中C1a，C2，C2a和C1的含量分別為6.5%，45.3%，20.1%和27.1%，而阻斷株中的C1a和C2b的含量分別為94.0%和6.0%。本發(fā)明通過(guò)框架內(nèi)刪除失活的方法破壞棘孢小單孢菌中g(shù)ntK基因，包括gntK基因阻斷質(zhì)粒的構(gòu)建，阻斷質(zhì)粒轉(zhuǎn)化棘孢小單孢菌，雙交換菌株的篩選以及發(fā)酵產(chǎn)物的分析。本發(fā)明所構(gòu)建的工程菌，不含有任何抗性標(biāo)記，通過(guò)連續(xù)傳代，慶大霉素C1a產(chǎn)量非常穩(wěn)定。
文檔編號(hào)C12N1/20GK102586146SQ20121003214
公開(kāi)日2012年7月18日 申請(qǐng)日期2012年2月14日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月19日
發(fā)明者倪現(xiàn)樸, 夏煥章, 李 昊 申請(qǐng)人:沈陽(yáng)藥科大學(xué)