專利名稱：：人rhbdd1基因的用途及其相關(guān)藥物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及生物
技術(shù)領(lǐng)域：
，更具體地涉及人RHBDDl基因的用途及其相關(guān)藥物。
背景技術(shù)：
：RNA干擾(RNAinterference,RNAi)是生物進(jìn)化中一項保守的防御機(jī)制，于1998年首先發(fā)現(xiàn)(FireA,XuS,MontgomeryMK,KostasSA,DriverSE,MelloCC.Potentandspecificgeneticinterferencebydouble-strandedRNAinCaenorhabditiselegans.Nature.1998；391(6669):806-11.)其本質(zhì)是由雙鏈RNA介導(dǎo)的與之同源的mRNA特異性降解，進(jìn)而抑制相應(yīng)基因表達(dá)的過程。由于其基因抑制效果確切，具有級聯(lián)式放大效應(yīng)和高穿透性等特點，因而在惡性腫瘤的研究中具有很好的應(yīng)用前景(AngajiSA,HedayatiSS,PoorRH,MadaniS,PoorSS,PanahiS.ApplicationofRNAinterferenceintreatinghumandiseases.JGenet.2010；89(4):527-37.)。研究表明，長度為21_23nt的小干擾RNA(smallinterferingRNA,siRNA)能夠在轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后水平特異性的引起RNAi(TuschlT,ZamorePD,SharpPA,BartelDP.RNAi:double-strandedRNAdirectstheATP-dependentcleavageofmRNAat21to23nucleotideintervals.Cell2000；101:25-33.)。因此，通過適當(dāng)?shù)募夹g(shù)生產(chǎn)特異性的siRNA并使其能有效地作用于靶基因的mRNA,即能實現(xiàn)基因沉默的目的。將外源性DNA導(dǎo)入真核細(xì)胞并進(jìn)行轉(zhuǎn)錄和表達(dá)的方式主要包括非病毒載體系統(tǒng)的細(xì)胞轉(zhuǎn)染和以病毒為載體的細(xì)胞感染方式。慢病毒載體是在人免疫缺陷病毒(HIV-1)基礎(chǔ)上改造成的病毒載體系統(tǒng)，能高效的將目的基因(或RNAi)導(dǎo)入動物和人的原代細(xì)胞或細(xì)胞系。慢病毒介導(dǎo)的基因表達(dá)或RNAi作用持續(xù)且穩(wěn)定，目的基因可整合到宿主細(xì)胞基因組中，隨細(xì)胞基因組的分裂而分裂，并能有效感染并整合到非分裂細(xì)胞中。鑒于慢病毒載體介導(dǎo)的外源基因可以在動物體內(nèi)實現(xiàn)長期穩(wěn)定的表達(dá)，同時不引起明顯的免疫反應(yīng)，慢病毒載體已經(jīng)成為研究基因功能的強(qiáng)有力的工具(HeroldMJ,vandenBrandtJ,SeiblerJ,ReichardtHM.1nducibleandreversiblegenesilencingbystableintegrationofanshRNA-encodinglentivirusintransgenicrats.ProcNatlAcadSciUSA.2008Nov25；105(47):18507-12.)。Rhomboid家族包含多種膜蛋白，是一類絲氨酸蛋白酶，在原核生物和真核生物之間廣泛保守，發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)功能(KooninEV，MakarovaKS,RogozinIB，DavidovicL，LetellierMC，PellegriniL.Therhomboids:anearlyubiquitousfamilyofintramembraneserineproteasesthatprobablyevolvedbymultipleancienthorizontalgenetransfers.GenomeBiol.2003；4(3):R19.)。目前，對果妮Rhomboid蛋白酶的作用已經(jīng)研究的比較深入。果蠅Rhomboidsl-3具有調(diào)節(jié)EGF受體信號，控制生長和發(fā)育的功能(LeeJR,UrbanS，GarveyCF，F(xiàn)reemanM.RegulatedintracellularligandtransportandproteolysiscontrolEGFsignalactivationinDrosophila.Cell.2001；107(2):161-71.UrbanS，LeeJRiFreemanM.Drosophilarhomboid-1definesafamilyofputativeintramembraneserineproteases.Cell.2001；107(2):173-82.)。果蠅Rhomboid7被發(fā)現(xiàn)與精子發(fā)生有關(guān)(McQuibbanGA，LeeJR,ZhengL，JuusolaM，F(xiàn)reemanM.Normalmitochondrialdynamicsrequiresrhomboid_7andaffectsDrosophilalifespanandneuronalfunction.CurrBiol.2006；16(10):982-9.)。酵母的Rhomboid蛋白酶被發(fā)現(xiàn)在線粒體膜重塑中發(fā)揮重要功能(McQuibbanGA，SauryaS，F(xiàn)reemanM.Mitochondrialmembraneremodellingregulatedbyaconservedrhomboidprotease.Nature.2003；423(6939):537-41.)。脊椎動物的Rhomboid基因可分為三類:(1)活性的細(xì)胞Rhomboid，包括RHBDL2、RHBDL4和RHBDDl；(2)無活性的細(xì)胞Rhomboid，包括RHBDD5和RHBDD6；(3)線粒體Rhomboid,又稱為PARL(UrbanS.Rhomboidproteins!conservedmembraneproteaseswithdivergentbiologicalfunctions.GenesDev.2006；20(22):3054-68.)。這些蛋白酶參與重要的信號途徑，比如，RHBDL2具有裂解血栓調(diào)節(jié)蛋白(thiOmbomodulin)和受體酪氨酸激酶配體(ephrinB3)的作用(Lohi0，UrbanS，F(xiàn)reemanM.Diversesubstraterecognitionmechanismsforrhomboids;thrombomoduliniscleavedbyMammalianrhomboids.CurrBiol.2004；14(3):236-41.PascallJC，BrownKD.1ntramembranecleavageofephrinB3bythehumanrhomboidfamilyprotease,RHBDL2.BiochemBiophysResCommun.2004Apr23；317(1):244-52.)。線粒體內(nèi)膜PARL與細(xì)胞凋亡相關(guān)(GottliebE.0PAlandPARLkeepalidonapoptosis.Cell.2006；126(I):27-9.CipolatS，RudkaT，HartmannD，CostaV，SerneelsL，CraessaertsK，MetzgerK，F(xiàn)rezzaC，AnnaertW，DfAdamioL，DerksC，DejaegereT，PellegriniL，DfHoogeR，ScorranoL，DeStrooperB.MitochondrialrhomboidPARLregulatescytochromecreleaseduringapoptosisviaOPAl—dependentcristaeremodeling.Cell.2006；126(1):163-75.HillRB，PellegriniLThePARLfamilyofmitochondrialrhomboidproteases.SeminCellDevBiol.2010；21(6):582-92.)。人RHBDDl基因(rhomboiddomaincontainingI)是一個新發(fā)現(xiàn)的Rhomboid家族成員，在睪丸中高表達(dá)，參與促凋亡蛋白BIK的裂解。在人胚腎細(xì)胞(HEK293T)中過表達(dá)或敲減RHBDDl基因，分別導(dǎo)致降低或增強(qiáng)的BIK介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。因此，RHBDDl作為一種絲氨酸蛋白酶調(diào)節(jié)BIK介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡活性(WangY，GuanX,FokKLiLiS，ZhangXiMiaoS，ZongS，KoideSS,ChanHCiWangLAnovelmemberoftheRhomboidfamily，RHBDDl，regulatesBIK-mediatedapoptosis.CellMolLifeSc1.2008；65(23):3822-9.)。人RHBDDl基因的同源基因，mRHBDDl和rRHBDDl也發(fā)現(xiàn)在小鼠和大鼠的卵巢組織中高表達(dá)。而且，發(fā)現(xiàn)mRHBDDl通過調(diào)節(jié)精子的凋亡而參與調(diào)節(jié)精子發(fā)生過程(WangY，SongW，LiS，GuanX，MiaoS，ZongS，KoideSS,WangLGC-1mRHBDDlknockdownspermatogoniacellslosetheirspermatogeniccapacityinmouseseminiferoustubules.BMCCellBiol.2009；10:25.)。然而，人RHBDDl基因是否與腫瘤細(xì)胞的凋亡有關(guān)以及在腫瘤發(fā)生和進(jìn)展中的作用尚無文獻(xiàn)報道。故人RHBDDl基因在腫瘤中作用還有待于進(jìn)一步的研究。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于公開與人RHBDDl基因相關(guān)的治療方法及藥物。本發(fā)明第一方面，公開了將人RHBDDl基因用于制備或篩選腫瘤治療藥物，或者將人RHBDDl基因用于制備腫瘤診斷藥物。人RHBDDl基因用于制備或篩選腫瘤治療藥物包括兩方面的內(nèi)容:其一，將人RHBDDl基因作為藥物或制劑針對腫瘤細(xì)胞的作用靶標(biāo)應(yīng)用于制備腫瘤治療藥物或制劑；其二，將人RHBDDl基因作為藥物或制劑針對腫瘤細(xì)胞的作用靶標(biāo)應(yīng)用于篩選腫瘤治療藥物或制劑。所述將人RHBDDl基因作為藥物或制劑針對腫瘤細(xì)胞的作用靶標(biāo)具體是指:將人RHBDDl基因作為藥物或制劑針對腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生RNA干擾作用的靶標(biāo)，從而能降低腫瘤細(xì)胞人RHBDDl基因的表達(dá)水平。所述將人RHBDDl基因作為藥物或制劑針對腫瘤細(xì)胞的作用靶標(biāo)應(yīng)用于篩選腫瘤治療藥物或制劑具體是指JfARHBDDl基因作為作用對象對藥物或制劑進(jìn)行篩選，以找到可以抑制或促進(jìn)人RHBDDl基因表達(dá)的藥物作為腫瘤治療備選藥物。如之后所述的人RHBDDl基因小分子干擾RNA即是以人RHBDDl基因為作用對象篩選獲得的，可用作具有抑制腫瘤細(xì)胞增殖作用的藥物。諸如抗體藥物，小分子藥物等也可將RHBDDl基因作為作用對象。所述將人RHBDDl基因用于制備腫瘤診斷藥物，是指將人RHBDDl基因表達(dá)產(chǎn)物作為一項腫瘤診斷指標(biāo)應(yīng)用于腫瘤診斷藥物的制備。所述的腫瘤可以為其腫瘤細(xì)胞的增殖與人RHBDDl基因的表達(dá)相關(guān)的任一種腫瘤，更進(jìn)一步的，為一種惡性腫瘤，例如選自:肝癌、舌鱗狀細(xì)胞癌、乳腺癌、胰腺癌、胃癌和肺癌。所述腫瘤治療藥物可以為小分子化學(xué)藥，抗體藥，也可以為核酸類藥物。進(jìn)一步的，所述腫瘤治療藥物能降低人RHBDDl基因的表達(dá)水平從而抑制腫瘤細(xì)胞的增殖。采用前述腫瘤治療藥物治療腫瘤的方法，主要是通過降低人RHBDDl基因的表達(dá)水平抑制腫瘤細(xì)胞的增殖來達(dá)到治療目的的。具體的，治療時，將能有效降低人RHBDDl基因表達(dá)水平的物質(zhì)給藥于患者。進(jìn)一步的，所述的能有效降低人RHBDDl基因表達(dá)水平的物質(zhì)，包括能夠特異性沉默人RHBDDl基因表達(dá)的小分子干擾RNA(siRNA)。該小分子干擾RNA(siRNA)可以起到特異性沉默腫瘤細(xì)胞中內(nèi)源RHBDDl基因的表達(dá)的作用。進(jìn)一步的，所述小分子干擾RNA以選自SEQIDNO:1_33之任一的序列作為特異性沉默人RHBDDl基因表達(dá)的靶點序列。所述小分子干擾RNA以選自SEQIDNO:1_33之任一的序列作為特異性沉默人RHBDDl基因表達(dá)的靶點序列是指:該小分子干擾RNA能與SEQIDNO:1_33中的任一種序列所編碼的mRNA片段特異性結(jié)合，并特異性沉默人RHBDDl基因的表達(dá)。進(jìn)一步的，所述能夠特異性沉默人RHBDDl基因表達(dá)的小分子干擾RNA(siRNA)經(jīng)由慢病毒載體表達(dá)。具體而言，這個過程包括:將編碼所述人RHBDDl基因小分子干擾RNA的DNA片段克隆入慢病毒載體獲得人RHBDDl基因干擾慢病毒載體，進(jìn)而利用該人RHBDDl基因干擾慢病毒載體經(jīng)過病毒包裝成為有感染力的病毒顆粒后，感染腫瘤細(xì)胞并最終表達(dá)所述siRNA。人RHBDDl基因干擾慢病毒載體為將編碼所述人RHBDDl基因小分子干擾RNA的DNA片段克隆入慢病毒載體后獲得，能產(chǎn)生人RHBDDl基因小分子干擾RNA。進(jìn)一步的，所述的慢病毒載體可選自:pLK0.1-purο,pLK0.1-CMV-tGFP,pLK0.1-puro-CMV-tGFP,pLK0.1-CMV-Neo,pLK0.l_Neo、pLK0.l-Neo-CMV-tGFP、pLK0.1-puro-CMV-TagCFP、pLK0.l-puro-CMV-TagYFP、pLK0.l-puro-CMV-TagRFP、pLK0.l-puro-CMV-TagFP635,pLK0.1-puro-UbC-TurboGFP、pLK0.l-puro-UbC_TagFP635、pLKO-puro-1PTG-lxLacO、pLK0-puro-1PTG_3xLac0、pLPl、pLP2、pLP/VSV-G、pENTR/U6、pLenti6/BL0CK-1T-DEST、pLenti6-GW/U6-laminshrna、pcDNAl.2/V5_GW/lacZ、pLenti6.2/N-Lumio/V5-DEST、pGCSIL-GFP或pLenti6.2/N-Lumio/V5-Gff/lacZ中的任一種慢病毒載體，本發(fā)明實施例具體列舉了以pGCSIL-GFP為載體。慢病毒載體可在慢病毒包裝質(zhì)粒、細(xì)胞系的輔助下，經(jīng)過病毒包裝成為有感染力的病毒顆粒。本發(fā)明第二方面，公開了一種分離的人RHBDDl基因小分子干擾RNA(siRNA)靶標(biāo)片段，其序列為SEQIDNO:1-33中任意一條序列。所述分離的人RHBDDl基因小分子干擾RNA(siRNA)靶標(biāo)片段可應(yīng)用于人RHBDDl基因小分子干擾RNA的篩選與制備。本發(fā)明第三方面，公開了一種人RHBDDl基因小分子干擾RNA(siRNA)，能夠特異性沉默人RHBDDl基因的表達(dá)。所述人RHBDDl基因小分子干擾RNA以選自SEQIDNO:1-33之任一的序列作為特異性沉默人RHBDDl基因表達(dá)的靶點序列。進(jìn)一步的，所述人RHBDDl基因小分子干擾RNA包含正義RNA片段和反義RNA片段，所述正義RNA片段和所述反義RNA片段互補(bǔ)，所述正義RNA片段含有SEQIDN0:l_33中之任一序列編碼的RNA。所述正義RNA片段和反義RNA片段存在于兩條不同的RNA鏈上或者存在于同一條RNA鏈上。所述正義RNA片段和反義RNA片段的長度均為15_27個核苷酸；較佳的，長度均為19-23個核苷酸；最佳的，長度均為19、20或者21個核苷酸。進(jìn)一步的，所述人RHBDDl基因小分子干擾RNA為發(fā)夾型單鏈RNA，包括正義RNA片段、莖環(huán)片段和反義RNA片段，正義RNA片段和反義RNA片段中間由莖環(huán)片段分隔；其中，正義RNA片段和反義RNA片段互補(bǔ)，正義RNA片段的序列選自SEQIDNO:1_33之任一。所述莖環(huán)片段結(jié)構(gòu)包括6個或9個堿基。進(jìn)一步的所述莖環(huán)片段的序列選自以下任一:UUCAAGAGA、AUG、CCC,UUCG,CCACC,CTCGAG,AAGCUU,CCACACC。本發(fā)明具體列舉了以UUCAAGAGA為莖環(huán)。如實施例列舉的，所述人RHBDDl基因小分子干擾RNA的序列為SEQIDNO:34:GCUGGGAUUCU腳UGGACUAUUCAAGAGAUA⑶CCAACAAGAAUCCCAGC。本發(fā)明第四方面，公開了一種人RHBDDl基因干擾核酸構(gòu)建體，包含編碼前述人RHBDDl基因小分子干擾RNA的基因片段，能表達(dá)前述人RHBDDl基因小分子干擾RNA。所述的人RHBDDl基因干擾核酸構(gòu)建體可以是將編碼前述人RHBDDl基因小分子干擾RNA的基因片段克隆入已知載體獲得。進(jìn)一步的，所述人RHBDDl基因干擾核酸構(gòu)建體為人RHBDDl基因干擾慢病毒載體，為將編碼所述人RHBDDl基因小分子干擾RNA的基因片段克隆入慢病毒載體后獲得，能產(chǎn)生人RHBDDl基因小分子干擾RNA。所述慢病毒載體可以選自:pLK0.1-purο,pLK0.1-CMV-tGFP,pLK0.1-puro-CMV-tGFP,pLK0.1-CMV-Neo,pLK0.l_Neo、pLK0.l-Neo-CMV-tGFP、pLK0.1-puro-CMV-TagCFP、pLK0.l-puro-CMV-TagYFP、pLK0.l-puro-CMV-TagRFP、pLK0.l-puro-CMV-TagFP635、pLK0.l-puro-UbC-TurboGFP、pLK0.l-puro-UbC_TagFP635、pLKO-puro-1PTG-lxLacO、pLK0-puro-1PTG_3xLac0、pLPl、pLP2、pLP/VSV-G、pENTR/U6、pLenti6/BL0CK-1T-DEST、pLenti6-GW/U6-laminshrna、pcDNAl.2/V5_GW/lacZ、pLenti6.2/N-Lumio/V5-DEST、pGCSIL-GFP或pLenti6.2/N-Lumio/V5-Gff/lacZ中的任一。本發(fā)明實施例具體列舉了以pGCSIL-GFP為載體構(gòu)建的人RHBDDl基因干擾核酸構(gòu)建體,命名為pGCSIL-GFP-RHBDD1-shRNA。進(jìn)一步的，編碼所述人RHBDDl基因小分子干擾RNA的基因片段的序列含有SEQIDNO:1-33中之任一序列及其互補(bǔ)序列。本發(fā)明的人RHBDDl基因小分子干擾RNA可用于抑制腫瘤細(xì)胞的增殖，進(jìn)一步地可以用作治療或診斷腫瘤的藥物或制劑。人RHBDDl基因干擾核酸構(gòu)建體則可用于制備所述人RHBDDl基因小分子干擾RNA。當(dāng)用作治療腫瘤的藥物或制劑時，是將安全有效量的人RHBDDl基因小分子干擾RNA施用于哺乳動物。當(dāng)然，具體劑量還應(yīng)考慮給藥途徑、病人健康狀況等因素，這些都是熟練醫(yī)師技能范圍之內(nèi)的。本發(fā)明第五方面，公開了一種人RHBDDl基因干擾慢病毒，由前述人RHBDDl基因干擾慢病毒載體在慢病毒包裝質(zhì)粒、細(xì)胞系的輔助下，經(jīng)過病毒包裝而成。該慢病毒可感染腫瘤細(xì)胞并產(chǎn)生人RHBDDl基因小分子干擾RNA，從而抑制腫瘤細(xì)胞的增殖。本發(fā)明第六方面，還公開了一種藥物組合物，含有治療有效量的人RHBDDl基因小分子干擾RNA或人RHBDDl基因干擾慢病毒。進(jìn)一步的，所述藥物組合物含有I99wt%如前所述的人RHBDDl基因小分子干擾RNA或人RHBDDl基因干擾慢病毒，以及藥學(xué)上可接受的載體、稀釋劑或賦形劑。在制備這些組合物時，通常將活性成分與賦形劑混合，或用賦形劑稀釋，或包在可以膠囊或藥囊形式存在的載體中。當(dāng)賦形劑起稀釋劑作用時，它可以是固體、半固體或液體材料作為賦形劑、載體或活性成分的介質(zhì)。因此，組合物可以是片劑、丸劑、粉劑、溶液劑、糖漿劑、滅菌注射溶液等。合適的賦形劑的例子包括:乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、淀粉、微晶纖維素、聚乙烯吡咯烷酮、纖維素、水、等。制劑還可包括:濕潤劑、乳化劑、防腐劑(如羥基苯甲酸甲酯和丙酯)、甜味劑等。綜上所述，本發(fā)明設(shè)計了針對人RHBDDl基因的33個RNAi靶點序列，構(gòu)建相應(yīng)的RHBDDlRNAi載體，其中編碼序列SEQIDNO:21的RNAi載體pGCSIL-GFP-RHBDDl-shRNA能夠顯著下調(diào)RHBDDI基因在mRNA水平和蛋白水平的表達(dá)。使用慢病毒(lentivirus，簡寫為Lv)作為基因操作工具將針對RHBDDl基因的shRNA序列高效導(dǎo)人肝癌H印G2細(xì)胞、人舌鱗狀細(xì)胞癌Tca8113細(xì)胞、人乳腺癌MCF-7細(xì)胞、人胰腺癌Panc-1細(xì)胞、人胃癌SGC7901細(xì)胞和人肺癌％D細(xì)胞，降低RHBDDl基因的表達(dá)水平，顯著抑制上述腫瘤細(xì)胞的增殖能力。因此慢病毒介導(dǎo)的RHBDDl基因沉默是惡性腫瘤潛在的臨床非手術(shù)治療方式。本發(fā)明提供的siRNA或者包含該siRNA序列的核酸構(gòu)建體、慢病毒能夠特異性抑制人RHBDDl基因的表達(dá)，尤其是慢病毒，能夠高效侵染靶細(xì)胞，高效率地抑制靶細(xì)胞中RHBDDl基因的表達(dá)，進(jìn)而抑制腫瘤細(xì)胞的生長，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡，在腫瘤治療中具有重要意義。圖1表示pGCSIL-GFP質(zhì)粒DNA圖譜圖2表示RHBDDl-shRNA慢病毒侵染人肝癌H印G2、人舌鱗狀細(xì)胞癌Tca8113細(xì)胞、人乳腺癌MCF-7細(xì)胞、人胰腺癌Panc-1細(xì)胞、人胃癌SGC7901細(xì)胞和人肺癌％D細(xì)胞5天后，與對照慢病毒侵染組相比，RHBDDlmRNA的表達(dá)水平顯著降低。圖3表示RHBDDl-shRNA慢病毒侵染人舌鱗狀細(xì)胞癌Tca8113細(xì)胞4天后，顯著抑制細(xì)胞增殖。圖4表示RHBDDl-shRNA慢病毒侵染人肝癌H印G2細(xì)胞5天后，顯著抑制細(xì)胞增殖。圖5表示RHBDDl-shRNA慢病毒侵染人肺癌％D細(xì)胞5天后，顯著抑制細(xì)胞增殖。圖6表示RHBDDl-shRNA慢病毒侵染人乳腺癌MCF-7細(xì)胞5天后，顯著抑制細(xì)胞增殖。圖7表示RHBDDl-shRNA慢病毒侵染人胃癌SGC7901細(xì)胞5天后，顯著抑制細(xì)胞增殖。圖8表示RHBDDl-shRNA慢病毒侵染人胰腺癌Panc-1細(xì)胞5天后，顯著抑制細(xì)胞增殖。圖9使用RHBDDl抗體在腫瘤組織樣本上的免疫組化檢測結(jié)果a、b乳腺癌，d、c胰腺癌，e、f胃癌具體實施例方式本發(fā)明基于Rhomboid家族相關(guān)的研究,認(rèn)為RHBDDl作為一個新發(fā)現(xiàn)的Rhomboid家族成員可能參與了惡性腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。本發(fā)明涉及了一組針對人RHBDDl基因的小分子干擾RNA(siRNA)序列、RNA干擾載體和RNA干擾慢病毒。選取人RHBDDlmRNA編碼區(qū)序列作為siRNA的靶位點，根據(jù)靶位點中連續(xù)的10-30(優(yōu)選15-27，更優(yōu)選19-23)個堿基序列設(shè)計siRNA靶點序列。通過基因克隆，構(gòu)建表達(dá)上述siRNA的核酸構(gòu)建體，包裝表達(dá)上述siRNA的慢病毒。細(xì)胞實驗證明，上述siRNA序列能夠特異性沉默人腫瘤細(xì)胞中內(nèi)源RHBDDl基因的表達(dá)。發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，采用RNAi方法下調(diào)人RHBDDl基因的表達(dá)后可有效地抑制腫瘤細(xì)胞的增殖，這一研究成果表明RHBDDl基因是原癌基因，可作為腫瘤治療的靶點。發(fā)明人進(jìn)一步合成和測試了多種針對RHBDDl基因的siRNA，篩選出了可有效抑制RHBDDl的表達(dá)進(jìn)而抑制人肝癌H印G2細(xì)胞、人舌鱗狀細(xì)胞癌Tca8113細(xì)胞、人乳腺癌MCF-7細(xì)胞、人胰腺癌Panc-1細(xì)胞、人胃癌SGC7901細(xì)胞和人肺癌％D細(xì)胞增殖和生長的siRNA，在此基礎(chǔ)上完成了本發(fā)明。本發(fā)明提供了一系列干擾人RHBDDl基因的小干擾RNA(siRNA)序列，構(gòu)建了可特異性沉默RHBDDl基因表達(dá)的慢病毒。本發(fā)明研究發(fā)現(xiàn)，針對人RHBDDl基因設(shè)計的小干擾RNA及表達(dá)人RHBDDlsiRNA的慢病毒，穩(wěn)定并特異地下調(diào)RHBDDl基因的表達(dá)，并有效地抑制人腫瘤細(xì)胞的增殖。本發(fā)明表明RHBDDl基因可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞生長，有望成為腫瘤早期診斷和治療的靶點。而且，通過RNAi方式沉默RHBDDl基因的表達(dá)，可作為抑制腫瘤發(fā)展的有效手段。本發(fā)明的設(shè)計思路為:本發(fā)明通過如下方法來篩選獲得一種人RHBDDl(NM_032276)基因RNAi慢病毒:從Genbank中調(diào)取人RHBDDl基因序列；預(yù)測siRNA位點；合成針對RHBDDl基因的有效的siRNA序列，兩端含酶切位點粘端的雙鏈DNAOligo;慢病毒載體雙酶切后與雙鏈DNAOligo連接，構(gòu)建表達(dá)RHBDDl基因siRNA序列的RNAi質(zhì)粒；將RNAi質(zhì)粒和慢病毒包裝需要的輔助載體(PackingMix,Sigma-aldrich公司)共轉(zhuǎn)染人胚腎細(xì)胞293T,包裝產(chǎn)生病毒顆粒，即可制得高效沉默RHBDDl基因的慢病毒?；谏鲜龇椒ǎ景l(fā)明提供了33個干擾RHBDDl基因的有效靶點(具體如SEQIDNO1-33所示)，構(gòu)建了特異干擾人RHBDDl基因的慢病毒。同時本發(fā)明還公開一種人RHBDDl基因的RNAi慢病毒及其制備與應(yīng)用。本研究發(fā)現(xiàn)，利用慢病毒介導(dǎo)的RNAi方法，在降低腫瘤細(xì)胞中內(nèi)源性RHBDDl基因的表達(dá)后，可以有效抑制腫瘤細(xì)胞的增殖和生長。本研究表明，RHBDDl基因是一個原癌基因，可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖，在腫瘤發(fā)生和發(fā)展中具有重要的生物學(xué)功能，RHBDDl基因可以為腫瘤治療的靶標(biāo)，慢病毒介導(dǎo)的RHBDDl基因特異性沉默可作為腫瘤治療的一種新手段。下面結(jié)合實施例進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，實施例僅用于說明本發(fā)明，而非限制本發(fā)明的范圍。實施例中未注明具體條件的實驗方法及未說明配方的試劑均為按照常規(guī)條件，如[美]Sambrook.J等著；黃培堂等譯。分子克隆試驗指南，第三版。北京:科學(xué)出版社2002中所述的條件或者制造商建議的條件進(jìn)行或配置。實施例1:針對人RHBDDl基因RNAi慢病毒的制備1.篩選針對人RHBDDl基因的有效的siRNA靶點從Genbank調(diào)取RHBDDl(NM_032276)基因信息；利用上海吉凱基因化學(xué)技術(shù)有限公司的設(shè)計軟件Genechem設(shè)計針對RHBDDl基因的有效的siRNA靶點。在RHBDDl基因的編碼序列(CDS)區(qū)域內(nèi)，每隔一個堿基起始獲得33個堿基的序列，表I列出了其中33條針對RHBDDl基因的有效siRNA靶點序列。表I靶向于人RHBDDl基因的siRNA靶點序列[qq73]權(quán)利要求1.人RHBDDl基因在制備或篩選腫瘤治療藥物，或者在制備腫瘤診斷藥物中的用途。2.如權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于，所述的腫瘤為其腫瘤細(xì)胞的增殖與人RHBDDl基因的表達(dá)相關(guān)的任一種腫瘤。3.如權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于，所述的腫瘤選自:肝癌、舌鱗狀細(xì)胞癌、乳腺癌、胰腺癌、胃癌和肺癌。4.一種分離的人RHBDDl基因小分子干擾RNA靶標(biāo)片段，其序列為SEQIDN0:l_33中任意一條序列。5.一種人RHBDDl基因小分子干擾RNA，能夠特異性沉默人RHBDDl基因的表達(dá)，所述人RHBDDl基因小分子干擾RNA以選自SEQIDNO:1_33之任一的序列作為特異性沉默人RHBDDl基因表達(dá)的靶點序列。6.如權(quán)利要求4所述人RHBDDl基因小分子干擾RNA，其特征在于，所述人RHBDDl基因小分子干擾RNA包含正義RNA片段和反義RNA片段，所述正義RNA片段和所述反義RNA片段互補(bǔ)，所述正義RNA片段含有SEQIDNO:1_33中之任一序列編碼的RNA。7.如權(quán)利要求6所述人RHBDDl基因小分子干擾RNA，其特征在于，所述正義RNA片段和反義RNA片段的長度均為15-27個核苷酸。8.如權(quán)利要求6所述人RHBDDl基因小分子干擾RNA，其特征在于，所述人RHBDDl基因小分子干擾RNA為發(fā)夾型單鏈RNA，所述正義RNA片段和所述反義RNA片段中間由莖環(huán)片段分隔。9.如權(quán)利要求8所述人RHBDDl基因小分子干擾RNA，其特征在于，所述莖環(huán)片段的序列選自以下任一:UUCAAGAGA、AUG、CCC、UUCG、CCACC、CTCGAG、AAGCUU、CCACACC。10.如權(quán)利要求4所述人RHBDDl基因小分子干擾RNA，其特征在于，所述人RHBDDl基因小分子干擾RNA的序列為SEQIDNO:34。11.一種人RHBDDl基因干擾核酸構(gòu)建體，包含編碼權(quán)利要求5-10任一權(quán)利要求所述人RHBDDl基因小分子干擾RNA的基因片段，能表達(dá)人RHBDDl基因小分子干擾RNA。12.如權(quán)利要求11所述人RHBDDl基因干擾核酸構(gòu)建體，其特征在于，所述人RHBDDl基因干擾核酸構(gòu)建體為人RHBDDl基因干擾慢病毒載體。13.如權(quán)利要求12所述人RHBDDl基因干擾核酸構(gòu)建體，其特征在于，所述慢病毒載體選自:pLK0.1-purο,pLK0.1-CMV-tGFP、pLK0.l-puro-CMV-tGFP、pLK0.1-CMV-Neo,pLK0.l-Neo、pLK0.l-Neo-CMV-tGFP、pLK0.l-puro-CMV-TagCFP、pLK0.l-puro-CMV-TagYFP、pLK0.1-puro-CMV-TagRFP,pLK0.l-puro-CMV_TagFP635、pLK0.1-puro-UbC-TurboGFP,pLK0.l-puro-UbC-TagFP635>pLKO-puro-1PTG-lxLacO、pLK0-puro-1PTG-3xLac0>pLPl、pLP2、pLP/VSV-G、pENTR/U6、pLenti6/BL0CK-1T_DEST、pLenti6-GW/U6_laminshrna、pcDNAl.2/V5-GW/lacZ、pLenti6.2/N-Lumio/V5_DEST、pGCSIL-GFP或pLenti6.2/N-Lumio/V5-Gff/lacZ中的任一。14.一種人RHBDDl基因干擾慢病毒，由權(quán)利要求11_13任一權(quán)利要求所述人RHBDDl基因干擾慢病毒載體在慢病毒包裝質(zhì)粒、細(xì)胞系的輔助下，經(jīng)過病毒包裝而成。15.一種藥物組合物，含有治療有效量的權(quán)利要求5-10任一權(quán)利要求所述人RHBDDl基因小分子干擾RNA或權(quán)利要求14所述人RHBDDl基因干擾慢病毒，以及藥學(xué)上可接受的載體、稀釋劑或賦形劑。16.如權(quán)利要求15所述藥物組合物，其特征在于，所述藥物組合物用于治療腫瘤，所述的腫瘤為其腫瘤細(xì)胞的增殖與人RHBDDl基因的表達(dá)相關(guān)的任一種腫瘤。17.如權(quán)利要求16所述藥物組合物，其特征在于，所述腫瘤為惡性腫瘤，選自肝癌、舌鱗狀細(xì)胞癌、乳腺癌、胰腺癌、胃癌和肺癌之任一。全文摘要本發(fā)明公開了人RHBDD1基因的用途及其相關(guān)藥物。本發(fā)明公開了人RHBDD1基因在腫瘤治療、腫瘤診斷及藥物制備中的用途。本發(fā)明還進(jìn)一步構(gòu)建了人RHBDD1基因小分子干擾RNA、人RHBDD1基因干擾核酸構(gòu)建體、人RHBDD1基因干擾慢病毒并公開了他們的用途。本發(fā)明提供的siRNA或者包含該siRNA序列的核酸構(gòu)建體、慢病毒能夠特異性抑制人RHBDD1基因的表達(dá)，尤其是慢病毒，能夠高效侵染靶細(xì)胞，高效率地抑制靶細(xì)胞中RHBDD1基因的表達(dá)，進(jìn)而抑制腫瘤細(xì)胞的生長，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡，在腫瘤治療中具有重要意義。文檔編號C12N15/113GK103157115SQ20121000512公開日2013年6月19日申請日期2012年1月10日優(yōu)先權(quán)日2011年12月19日發(fā)明者朱向瑩,韓海雄,孫琴,譚暢,楊敏,高博,沈浩,金楊晟,瞿紅花,曹躍瓊申請人:上海吉凱基因化學(xué)技術(shù)有限公司