專利名稱：用于擴(kuò)增核酸的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及將來自樣品的靶標(biāo)核酸與固體支持物上的捕獲核酸雜交，以及涉及擴(kuò)增所述雜交的核酸。
背景技術(shù)：
Illumina Solexa, AB SOLiD和Roche454的第二代測序技術(shù)通過在大量平行的模式中運(yùn)作從而實(shí)現(xiàn)了其高通量以及相對低廉的每個(gè)測序堿基的成本。其創(chuàng)建了總輸入DNA的許多隨機(jī)片段，在珠上或者在陣列上分別擴(kuò)增每個(gè)片段，在單一流通室內(nèi)讀取那些序列，并且能夠通過將所有的單個(gè)讀數(shù)與參照基因組序列匹配從而僅僅檢測突變(Margulies Met al.(2005) Nature437, 376-380)。此運(yùn)作方式具有的缺點(diǎn)是對許多基因組中不相關(guān)的部分也進(jìn)行了測序。這在臨床測序中尤其突出，其中通常僅有幾十個(gè)至幾百個(gè)基因的組才是與診斷相關(guān)的。因此，目前使用不同的技術(shù)以便在將樣品引入測序儀之前選擇基因組DNA中相關(guān)的部分。最常見地，是將DNA雜交至微陣列上特異性結(jié)合相關(guān)部分的捕獲探針。在第二步中，將未結(jié)合的不相關(guān)部分洗掉，隨后將結(jié)合的片段洗脫并準(zhǔn)備載入測序儀(Okou D.e t al.(2007) Nat Methods4, 907-909)。通常，基因組的 0.1%_1% 的革巴標(biāo)部分能夠在預(yù)先選擇的樣品中被富集至60-80%。以此種流程，信息的處理并非最佳。在陣列上進(jìn)行預(yù)先選擇期間，關(guān)于DNA片段的基因組位置信息是可以利用的，因?yàn)樗鼈兲禺愋缘亟Y(jié)合至空間上分離的探針并且是可以被鑒別的。然而，陣列的洗脫是在單一室內(nèi)進(jìn)行的過程，由此所有被選擇的片段又再次混合。因此，在測序后必需將所有的讀數(shù)單獨(dú)地與完整的參照序列進(jìn)行匹配，這需要大量的計(jì)算工作。如果可以將基因組信息從陣列預(yù)先選擇保留至測序反應(yīng)，則會(huì)顯著地降低對計(jì)算的要求。保留此信息的最簡單方式是在相同表面上的同一位點(diǎn)進(jìn)行預(yù)先選擇和測序。此方法在美國申請US2009/0117573中有描述。由于目前的測序技術(shù)需要擴(kuò)增每個(gè)單獨(dú)的DNA片段以便在測序期間獲得足夠的信號，此擴(kuò)增在相同的位點(diǎn)發(fā)生?；跇蚴綌U(kuò)增(bridge amplification)技術(shù)的原理，描述了解決此問題的方法，其中所述橋式擴(kuò)增技術(shù)是表面附著的擴(kuò)增(例如Illumina的測序技術(shù))。這可以在任何固體表面(載片、載體等)上進(jìn)行，只要能夠辨別出單獨(dú)擴(kuò)增的群落。在這些方法中，在可進(jìn)行測序前使用了不同的雜交、延伸和連接的步驟。仍舊需要更加有效和快捷的方法。發(fā)明概述本發(fā)明特定的和優(yōu)選的方面在所附的獨(dú)立和從屬權(quán)利要求中給出。從屬權(quán)利要求的特征可以視情況與獨(dú)立權(quán)利要求的特征以及與其它從屬權(quán)利要求的特征組合，而并不僅僅如權(quán)利要求中所給出的那樣。本發(fā)明描述了用于直接在捕獲探針的位點(diǎn)上對捕獲的靶標(biāo)核酸片段進(jìn)行擴(kuò)增和測序的方法。在這些方法中，將發(fā)夾銜接子連接至探針-靶標(biāo)雙鏈體，其可以被用作人工橋。特異性的捕獲探針則成為橋式擴(kuò)增所需的單一引物。本發(fā)明涉及用于擴(kuò)增靶標(biāo)核酸的方法，所述方法包括如下步驟:a)提供具有多個(gè)核酸捕獲探針的支持物，其中所述多個(gè)探針通過核酸的5’末端固定在支持物上，b)將靶標(biāo)核酸與捕獲核酸探針雜交以形成探針/靶標(biāo)復(fù)合物，c)用聚合酶延伸捕獲探針核酸，其中靶標(biāo)核酸被用作捕獲探針核酸延伸的模板，d)將經(jīng)延伸的靶標(biāo)/探針雙鏈核酸連接至發(fā)夾核酸，其中將發(fā)夾核酸的5’末端連接至經(jīng)延伸的探針的3’末端并且將發(fā)夾核酸的3’末端連接至靶標(biāo)核酸的5’末端，e)使靶標(biāo)核酸的3’末端結(jié)合至所述支持物上的所述多個(gè)核酸捕獲探針中的另外的探針，f)通過聚合酶延伸所述另外的探針的3’末端，g)通過重復(fù)步驟e)和f)擴(kuò)增步驟f)中所獲得的核酸在其它特定的實(shí)施方案中，步驟c)中的聚合酶不具有末端轉(zhuǎn)移酶活性或3’至5’校正外切核酸酶活性并且其中所述發(fā)夾核酸形成平端莖。例如，步驟c)中的聚合酶是Pfu (激烈火球菌(Pyrococcus furiosus)) DNA 聚合酶。在特定的實(shí)施方案中，步驟c)中的聚合酶具有3’末端轉(zhuǎn)移酶活性，導(dǎo)致在雙鏈核酸的3’末端的突出端，并且其中所述發(fā)夾核酸具有5’突出端，與雙鏈核酸的3’互補(bǔ)。例如，步驟c)中的聚合酶是Taq (水生棲熱菌(Thermophilus aquaticus)) DNA聚合酶，生成一個(gè)腺嘌呤的3’突出端，并且其中發(fā)夾的5’突出端是一個(gè)胸腺嘧啶核苷。在本發(fā)明另外的優(yōu)選實(shí)施方案中步驟c)中的聚合酶是Klenow聚合酶。此酶可在存在單一類型的核苷酸時(shí)使用，沿著捕獲的片段序列生成一系列相同的核苷酸。在另外的特別 優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述單一類型的核苷酸是dTTP。在另外的優(yōu)選實(shí)施方案中，步驟d)的將經(jīng)延伸的靶標(biāo)/探針雙鏈核酸連接至發(fā)夾核酸是在連接反應(yīng)中存在PEG8000時(shí)進(jìn)行的。在特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，步驟d)的將經(jīng)延伸的靶標(biāo)/探針雙鏈核酸連接至發(fā)夾核酸是在連接反應(yīng)中存在5%的PEG8000 (40w/v)時(shí)進(jìn)行的。在另外的特定實(shí)施方案中，用具有3’末端轉(zhuǎn)移酶活性的酶進(jìn)一步處理雙鏈平端核苷酸。在本發(fā)明方法特定的實(shí)施方案中，靶標(biāo)核酸是DNA.
在本發(fā)明方法另外的特定實(shí)施方案中，發(fā)夾核酸在其環(huán)中包含用于罕見的限制性內(nèi)切核酸酶的序列。在另外的特定實(shí)施方案中，支持物是平面支持物(planar support),包含不同的區(qū)別(distinct)區(qū)域，每個(gè)區(qū)域包含多個(gè)不同的探針。在本發(fā)明方法特定的實(shí)施方案中，支持物是微載體，其中所述微載體包含多個(gè)一種核酸捕獲探針(a plurality of one nucleic acid capture probe)。本文中的微載體任選包含可檢測的標(biāo)記，其中所述可檢測的標(biāo)記限定了附著至微載體的捕獲探針的序列。在本發(fā)明方法另外的特定實(shí)施方案中，在步驟g)中的擴(kuò)增之后進(jìn)行相應(yīng)于靶標(biāo)核酸的核酸序列確定，以及還包括將確定的序列與平面支持物上的區(qū)域或微載體上的標(biāo)記相關(guān)聯(lián)的步驟。附圖簡述本發(fā)明上文以及其它的特性、特征和優(yōu)勢將通過如下的詳細(xì)描述結(jié)合附圖而顯現(xiàn)，其通過實(shí)施例的方式說明了本發(fā)明的原理。本說明書僅僅是為了進(jìn)行舉例說明，而并非是要局限本發(fā)明的范圍。如下所引用的參考圖是指所附的圖片。

圖1顯示了本發(fā)明所描述的方法的實(shí)施方案。A)靶標(biāo)DNA的雜交；B)捕獲探針的延伸；C)發(fā)夾的連接；D)變性與重退火；E)橋式擴(kuò)增；F)線性化;G)序列確定。圖2顯示了圖1的C部分所描述的方法步驟實(shí)施方案的兩個(gè)實(shí)施例。左半部分說明了用不具有末端轉(zhuǎn)移酶活性或具有3’至5’外切核酸酶活性的酶所進(jìn)行的延伸，其中生成了平端雙鏈DNA用于與平端發(fā)夾核酸連接。右半部分說明了用具有3’末端轉(zhuǎn)移酶活性的酶如Taq DNA聚合酶所進(jìn)行的延伸，其中產(chǎn)生了具有單一腺嘌呤3’突出端的雙鏈用于與具有單一 5’胸腺嘧啶核苷突出端的發(fā)夾核酸連接圖3顯示了比較實(shí)例，其中對于將發(fā)夾連接至單鏈DNA的連接效率(左半部分)和將平端發(fā)夾連接至平端雙鏈DNA的連接效率進(jìn)行了比較。圖4說明了使用Klenow聚合酶和單一類型核苷酸的引物延伸實(shí)施方案。圖5顯示了在與熒光標(biāo)記的發(fā)夾連接之后的熒光測量，其中以不同的核苷酸使用Klenow聚合酶。圖6顯示了在用dATP或dTTP進(jìn)行末端修復(fù)之后用dNTP_C*混合物所獲得的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，表明4nt的突出端完全是由dATP或dTTP所填充的。獲得了參照(用dNTP-C*末端修復(fù))的熒光點(diǎn)(中間的兩排)，但是當(dāng)用未標(biāo)記的ATCG進(jìn)行初始末端修復(fù)時(shí)，僅僅獲得A或者僅僅獲得T核苷酸而未從dNTP- C*混合物獲得熒光信號。這表明末端在初始末端修復(fù)反應(yīng)中已經(jīng)完全填充，而與此反應(yīng)中所使用的核苷酸無關(guān)，因?yàn)樵诘诙€(gè)反應(yīng)中并沒有經(jīng)標(biāo)記的C-核苷酸被構(gòu)建進(jìn)去。在不同的附圖中，相同的參照標(biāo)記指代相同的或者相似的元件。本發(fā)明將依照特定的實(shí)施方案并參考某些附圖來進(jìn)行說明，但是本發(fā)明并不局限于此，而是由權(quán)利要求所限定。權(quán)利要求中的任何參照標(biāo)記不應(yīng)被理解為對范圍的限定。所描述的附圖僅僅是示意圖并且是非限定性的。在附圖中，基于說明的目的，一些元件的尺寸可以是被擴(kuò)大的而并非按照比例描繪。當(dāng)本發(fā)明的說明書和權(quán)利要求中使用術(shù)語“包含”時(shí)，其并不排除其它的元件或步驟。當(dāng)使用不定冠詞或者定冠詞(例如"a"或"an"、"the")描述單數(shù)名詞的時(shí)候，其包括了該名詞的復(fù)數(shù)，除非另有其它具體陳述。此外，說明書和權(quán)利要求中的術(shù)語第一、第二、第三等，是用于區(qū)別類似的元件而并不必然用于描述排序順序或時(shí)間順序。應(yīng)理解所使用的術(shù)語在適當(dāng)?shù)那闆r下可以互換，并且本文所描述的本發(fā)明的實(shí)施方案能夠用于本文所描述的序列之外的其它序列。以下所給出的術(shù)語或定義僅僅用于幫助理解本發(fā)明。這些定義不應(yīng)被理解為其具有的范圍小于本領(lǐng)域技術(shù)人員所理解的范圍。實(shí)施方案詳述定義“捕獲探針”或“捕獲寡核苷酸”是指附著于固體支持物的核酸?！鞍袠?biāo)DNA”或“靶標(biāo)核酸”是指從樣品中獲得的核酸?！昂怂帷笔侵窪NA以及RNA，并且可以含有非天然存在的核苷酸或修飾?！靶Ｕ?proofreading) ”是用于具有3’至5’外切核酸酶活性的DNA聚合酶的背景。
“黏著(Sticky) ”是指雙鏈核酸的末端其中5’或3’末端具有一或多個(gè)核苷酸的延伸而其并未形成堿基對。其與“平端(blunt)”相反，平端中末端的5’核苷酸與3’末端核苷酸形成堿基對?！鞍l(fā)夾核酸”是指具有在3’末端在5’末端的回文序列從而形成分子內(nèi)堿基對的寡核苷酸。這些堿基對序列代表了“莖(stem) ”。在這些回文序列之間存在保持不配對的核苷酸區(qū)段，形成環(huán)。環(huán)和莖形成類發(fā)夾的結(jié)構(gòu)。本發(fā)明所使用的"(微)載體"涉及具有0.1至1000微米直徑的固體顆粒。同義詞有〃(微)珠〃，〃(微)顆粒"或〃(微)球〃。微珠的形狀并不看作是對本發(fā)明的限制。本發(fā)明描述的方法涉及固體支持物上靶標(biāo)核酸的擴(kuò)增。從前的擴(kuò)增方法使用溶液中的引物，導(dǎo)致在溶液中相等的擴(kuò)增產(chǎn)物。近來的擴(kuò)增方法使用附著至支持物的引物，從而使擴(kuò)增的產(chǎn)物保持相等地附著至支持物。這在多重方法(multiplexing method)中具有優(yōu)勢，因?yàn)橛貌煌囊锼@得的不同的擴(kuò)增產(chǎn)物保持附著在支持物上。這使得可以將擴(kuò)增的產(chǎn)物與支持物上引物的位置相關(guān)聯(lián)。可以設(shè)想不同的方式來提供支持物上的引物。在某些實(shí)施方案中，將引物附著至陣列上專門的位置?，F(xiàn)代固定技術(shù)使得可以將高達(dá)數(shù)百萬的不同的引物附著至I至100 μ Hi2范圍的表面上?；蛘?，可以將引物附著至玻璃的、塑料的或金屬的微顆粒。在某些實(shí)施方案中，此種顆粒是磁性顆粒，使得可以在磁場中進(jìn)行操作?？梢杂霉鈱W(xué)條形碼、圖案、文字?jǐn)?shù)字編碼、顏色(例如量子點(diǎn)(quantum dot))等來標(biāo)記微顆粒，以便鑒別出微顆粒和已經(jīng)附著至該微顆粒的引物。本發(fā)明描述的方法不依賴于使用PCR反應(yīng)中通常所用的寡核苷酸對。在本發(fā)明的方法中，通過5’末端將寡核苷酸附著至支持物。這些探針還稱作“捕獲探針”。本發(fā)明所使用的核酸捕獲探針通常具有大約15至150個(gè)核苷酸的長度，例如20至1000個(gè)核苷酸或20至個(gè)核苷酸，以使得可以特異性地結(jié)合至設(shè)想的靶標(biāo)核酸而沒有或很少有錯(cuò)配。在本發(fā)明方法另外的步驟中，將靶標(biāo)核酸雜交至核酸捕獲探針。相同序列的多個(gè)探針被應(yīng)用為支持物上的位點(diǎn)，從而使幾千、幾萬、幾十萬或幾百萬拷貝出現(xiàn)在彼此附近，使得可以進(jìn)行本發(fā)明所進(jìn)一步解釋的克隆擴(kuò)增。此種位點(diǎn)的形狀可以是圓形、矩形、橢圓形、楔形，并通常具有100 μ m2至10.000 μ m2、I至100 μ m2,或者甚至0.1至I μ m2的面積。根據(jù)位點(diǎn)的尺寸以及其在支持物上的密度，高達(dá)100，000、500，000、I百萬、2百萬、5百萬、I千萬、2千萬、5千萬或者甚至I億個(gè)不同的位點(diǎn)可以應(yīng)用于支持物上，每個(gè)位點(diǎn)包含多個(gè)相同的祀標(biāo)探針。靶標(biāo)核酸通常源自基因組DNA并且通過機(jī)械方法(例如超聲處理、剪切)，化學(xué)方法(用金屬復(fù)合物或酸處理)或酶方法(用普通限制性內(nèi)切核酸酶或者DNase短暫消化以及用“罕見切割(rare cutter) ”酶集中消化)來制備。基因組DNA片段的平均長度通常在50至5000bp之間變化，通常在100至500之間，例如大約200bp?；蚪MDNA與捕獲探針的雜交在微陣列技術(shù)中熟知的標(biāo)準(zhǔn)條件下發(fā)生。
在另外的實(shí)施方案中，將RNA (例如mRNA或miRNA)雜交至DNA捕獲探針。用具有反轉(zhuǎn)錄酶活性的酶來延伸捕獲探針，導(dǎo)致DNA-RNA雜化物(hybrid)。另外的步驟類似于對DNA靶標(biāo)和DNA捕獲探針?biāo)龅哪切┎襟E。靶標(biāo)DNA和捕獲探針的雜化物可以包含捕獲探針的部分，其仍舊是單鏈的或者可以包含一部分單鏈靶標(biāo)DNA從捕獲探針的5’末端延伸。但是這對本發(fā)明方法的其它步驟并沒有影響。在本發(fā)明方法另外的步驟中，用聚合酶在捕獲探針的3’末端對其進(jìn)行延伸。本文中靶標(biāo)核酸被用作捕獲探針延伸的模板。根據(jù)所使用的聚合酶，另外兩個(gè)實(shí)施方案是可能的。A)沒有末端轉(zhuǎn)移酶活性或具有校正活性的聚合酶。用這些DNA聚合酶 進(jìn)行的DNA聚合導(dǎo)致具有平端的雙鏈DNA，在3’末端沒有突出端或者隱性(recessive)末端。此類別中的酶例如有Klenow聚合酶以及在95° C以下具有聚合酶活性的若干種聚合酶如Pfu聚合酶。作為結(jié)果，生成了具有捕獲探針的延伸的3’末端和靶標(biāo)DNA的原始5’末端的平端雙鏈核酸。如上文所解釋的，根據(jù)所形成的雜化物的類型，也可以發(fā)生靶標(biāo)DNA的3’末端的延伸。在平端雙鏈連接中可以無需其它步驟而使用通過這些酶所獲得的經(jīng)延伸的平端DNA。在此種實(shí)施方案中，將平端發(fā)夾連接至經(jīng)延伸的靶標(biāo)/探針核酸，其中將發(fā)夾核酸的5’末端連接至經(jīng)延伸的靶標(biāo)探針核酸的3’末端，并且其中將發(fā)夾核酸的3’末端連接至靶標(biāo)核酸的5’末端(參見圖2，左半部分)。B)具有末端轉(zhuǎn)移酶活性和不具有校正活性的聚合酶.
DNA聚合酶如Taq聚合酶，不具有上文所述的外切核酸酶活性但是卻具有3’末端轉(zhuǎn)移酶活性，由此并入了額外的突出端核苷酸。使用Taq聚合酶獲得一個(gè)腺嘌呤的3’突出端。因此，用這些聚合酶進(jìn)行的DNA聚合導(dǎo)致黏附末端。根據(jù)這些特定的實(shí)施方案，使用了發(fā)夾核酸，其在其莖之上具有5’突出端，與DNA聚合酶所產(chǎn)生的3’突出端互補(bǔ)(參見圖2，右半部分)。在其中使用Taq聚合酶并獲得一個(gè)腺嘌呤的3’突出端的實(shí)施方案中，具有胸腺嘧啶核苷的5’突出端的發(fā)夾核酸被連接。此連接類似于所謂的TA克隆，其中將PCR產(chǎn)物克隆至具有5’ T突出端的載體內(nèi)(Invitrogen的TA克隆試劑盒)。此種單一核苷酸的連接被認(rèn)為比平端雙鏈DNA的連接更有效率。然而，除了在克隆具有黏附末端的DNA時(shí)的優(yōu)勢之外，諸如Taq聚合酶的酶具有缺點(diǎn)，也即其聚合的出錯(cuò)率相較于校正酶要高得多。在測序計(jì)劃中，用黏附末端所獲得的連接效率的改善，可以彌補(bǔ)DNA聚合酶的出錯(cuò)率，因?yàn)檫B接在樣品中以低頻率出現(xiàn)的靶標(biāo)DNA的機(jī)會(huì)會(huì)增加。在序列的準(zhǔn)確性更加關(guān)鍵的方法中，例如在遺傳診斷中，聚合酶的校正方面則會(huì)優(yōu)于其它類型聚合酶的末端轉(zhuǎn)移酶活性。在需要額外的方法步驟的另外的實(shí)施方案中，可以利用兩種酶的優(yōu)勢。本文中使用靶標(biāo)DNA對捕獲探針的延伸是由校正酶來進(jìn)行的，從而生成具有最少量錯(cuò)誤的序列。用具有末端轉(zhuǎn)移酶活性的聚合酶以及適當(dāng)?shù)膁NTP來進(jìn)一步處理生成的平端雙鏈核酸，得到具有3’突出端的黏附末端使得可以進(jìn)行黏附末端連接。在另外的實(shí)施方案中，步驟c)中所使用的聚合酶可以是Klenow聚合酶。此酶可在存在單一類型的核苷酸(例如dATP、dGTP、dCTP、dTTP)時(shí)使用。由此可以沿著捕獲的片段序列生成一系列相同的或類似的核苷酸。優(yōu)選使用單一核苷酸如dATP和dTTP。最優(yōu)選一起使用Klenow聚合酶和dTTP。在本發(fā)明對發(fā)夾結(jié)構(gòu)進(jìn)行后續(xù)連接的另外的具體實(shí)施方案中，當(dāng)加入與捕獲的片段最后的核苷酸互補(bǔ)的序列特異性核苷酸時(shí)，可以改善結(jié)果。序列特異性核苷酸可以是A、G或C。因此，在具體的實(shí)施方案中，Klenow聚合酶可以與dTTP和dATP的組合、或者與dTTP和dGTP的組合、或者與dTTP和dCTP的組合一起使用。在另一實(shí)施方案中，在存在高分子量的聚合物分子的情況下進(jìn)行步驟d):將延伸的靶標(biāo)/探針雙鏈核酸連接至發(fā)夾核酸。特別優(yōu)選在連接反應(yīng)中使用PEG8000。特別優(yōu)選在存在大約2%至15%的PEG8000 (40w/v)時(shí)將經(jīng)延伸的靶標(biāo)/探針雙鏈核酸連接至步驟d)的發(fā)夾核酸，更優(yōu)選在存在大約3%至7%的PEG8000 (40w/v)時(shí)進(jìn)行，更優(yōu)選在存在大約5%的PEG8000 (40w/v)時(shí)進(jìn)行。在這些步驟中，其中在用聚合酶延伸之后立即用發(fā)夾核酸進(jìn)行連接，這與如Affymetrix的‘573申請中所描述的現(xiàn)有技術(shù)的方法有很大的不同。在現(xiàn)有技術(shù)中，發(fā)夾的連接之后總是進(jìn)一步延伸發(fā)夾核酸。現(xiàn)有技術(shù)中尚未理解或者設(shè)想連接發(fā)夾(平端或具有5’突出端)從而獲得不需要進(jìn)一步延伸的雙鏈核酸的可能性。此種不同使得可以顯著縮短進(jìn)行方法的所有步驟所需的時(shí)間，因?yàn)樵谶B接反應(yīng)后無需進(jìn)行額外的延伸步驟。另外，已經(jīng)證實(shí)用發(fā)夾核酸連接雙鏈核苷酸核酸的產(chǎn)率，高于用發(fā)夾連接自由的、單鏈3’末端的產(chǎn)率。以此種方式，測序計(jì)劃會(huì)使樣品中存在的靶標(biāo)DNA表現(xiàn)出更多的部分(fraction)。在用發(fā)夾核酸連接之后， 本發(fā)明所述的方法得到了始于支持物上在捕獲探針的5’末端沿原始捕獲探針序列的連續(xù)序列、經(jīng)延伸的捕獲探針序列、源于發(fā)夾的序列、以及如現(xiàn)有技術(shù)中所獲得的截至靶標(biāo)序列3’末端的靶標(biāo)DNA序列。與現(xiàn)有技術(shù)中類似，此序列適于橋式擴(kuò)增以及后續(xù)的序列確定。橋式擴(kuò)增在現(xiàn)有技術(shù)中是已知的，例如US6300070、Westin et al.(2000)Nat.Biotechnol.18，199-204、Walker et al., (1992) Proc Natl Acad Sci USA89; 392-396、Shapero et al., (2001) Genome Res.11，1926-1934 以及 Ju et al.(2006) Proc Natl AcadSci USA.103, 19635-19640。在本文中，要擴(kuò)增的靶標(biāo)的一個(gè)末端通過第一個(gè)探針而被束縛(tethered)而另一末端則可自由與第二個(gè)探針雜交，所述第二個(gè)探針物理上與第一個(gè)探針足夠接近從而使雜交可以發(fā)生。第二個(gè)探針在何種距離內(nèi)可被定位將由靶標(biāo)的長度來確定。序列確定可以在表面本身上進(jìn)行?；蛘?，將DNA從表面洗脫并測序。本發(fā)明所使用的平面載體或微載體的表面是由這樣的材料制成或者經(jīng)過這樣的材料功能化，所述材料使得寡核苷酸可以結(jié)合至表面。將寡核苷酸偶合至表面是本領(lǐng)域內(nèi)熟知的。這種偶合可以是可逆的或者不可逆的(例如通過巰基、酸性、或堿性不穩(wěn)定基團(tuán))。在某些實(shí)施方案中，微顆粒所具有的尺寸和形狀使得可以在微觀流體裝置中操作顆粒。微載體可具有電荷以使得可以在電場中進(jìn)行操作。
在其它實(shí)施方案中，載體是磁性的或者可磁化的顆粒，使得可以在磁場中進(jìn)行操作、旋轉(zhuǎn)或定位。在其它實(shí)施方案中，使用光鑷(optical tweezer)來對顆粒進(jìn)行定位和或操作。當(dāng)使用微載體時(shí)，它們可以包含標(biāo)記或編碼，其使得可以在多個(gè)載體中鑒別出個(gè)別的載體。載體的編碼在多重方法中早已熟知，其中用具有不同的吸收或發(fā)射峰(maxima)的發(fā)色(例如突光的)標(biāo)記來將載體功能化。例如Luminex(Austin, Texas)提供包含不同濃度的兩種染料的微載體，導(dǎo)致100種不同的組合(blend)。在本發(fā)明的方法中，(并且這與微陣列技術(shù)相反)，捕獲探針并不是通過其在基體(matrix)上的坐標(biāo)來鑒別的，而是通過微載體的編碼或者特性來鑒別的。因此，經(jīng)編碼的具有捕獲探針的微載體可以至少在所述方法的一個(gè)步驟(甚至是所有步驟)中存在于溶液中。更高復(fù)雜度的編碼是通過使用例如量子點(diǎn)來實(shí)現(xiàn)的，使得10種強(qiáng)度和6種顏色可用于高達(dá)一百萬的復(fù)雜度。不同類型的條形碼在本領(lǐng)域內(nèi)是熟知的并且包括使用射頻標(biāo)簽的電子條形碼、激光蝕刻的條形碼、金屬納米視桿(metallic nanorods)(在 Jain K.(2003)Expert Rev MolDiagn.3, 153-161;Lehmann(2002)Nature Materialsl, 12-13;Braeckmans et al.(2002)Nature review, drug discoveryl, 447-448中有綜述)。在金屬納米視桿中，通過制造載體的不同材料來獲得條形碼。在特定的實(shí)施方案中，條形碼是任意幾何形狀、設(shè)計(jì)或符號的小型化可讀取編碼，其可以寫在表面甚至內(nèi)部并且可以從微載體上讀取。例如，編碼可以寫成數(shù)字或字母、或者符號形式的編碼、圖片、條形碼、環(huán)形碼(ring code)、或三維編碼。環(huán)形碼類似于條形碼，除了其所使用的是同心圓而非直線。或者，使用二維的圖案來表示編碼。在特定的實(shí)施方案中，通過使用條形碼來獲得高復(fù)雜度，所述條形碼通過熒光顆粒的部分光漂白而寫到微載體上或其內(nèi)。此方法允許在顆粒上寫符號、線、數(shù)字等?？梢栽谖⑤d體上寫線圖案 從而獲得可由光學(xué)裝置讀取的條形碼圖案。微載體的空間選擇性光漂白在 Braeckmans et al.(2003)Nature Materials〗，169-173 和 Serveaux(2007)Langmuir.2510272-10279中有詳細(xì)描述。條形碼可以多次寫在微載體上，使得無論微載體的朝向如何都可以讀取條形碼。在另外的特定實(shí)施方案中，微載體還包含磁性材料，其使得可以對顆粒進(jìn)行磁性操作。此種顆粒的制作在專利申請W02007115815、EP1346224和W00063695中有詳細(xì)描述。對于用于臨床診斷的典型的靶標(biāo)測序工作，需要對高達(dá)1000個(gè)基因進(jìn)行測序。對于此種直接的捕獲測序方法，對探針進(jìn)行稠密堆砌(dense tiling)達(dá)到每個(gè)堿基是必要的，因?yàn)槿绻谂c捕獲探針的3’末端互補(bǔ)的片段中有突變則反應(yīng)就不會(huì)進(jìn)行。這意味著對平均每個(gè)1000個(gè)堿基的100個(gè)基因進(jìn)行測序，需要100x1000x2鏈=200，000個(gè)不同的探針，對1000個(gè)基因測序則需要2，000, 000個(gè)探針。對于正確的及定量的突變檢測，則可能需要對每個(gè)鏈的每個(gè)堿基進(jìn)行200x或更多的測序覆蓋。假設(shè)每次讀數(shù)可以測序10個(gè)堿基并且80%的讀數(shù)由于錯(cuò)誤而丟失，那么需要捕獲覆蓋每個(gè)堿基的1000個(gè)DNA片段。這可以被分為超過10個(gè)不同的重疊探針，因此每個(gè)探針100個(gè)捕獲的片段可能是足夠的。Illumina的測序方法能夠檢測每個(gè)μ m2上0.1-1個(gè)擴(kuò)增的群落，因此對于100個(gè)擴(kuò)增的DNA片段則需要100-1000 μ m2的表面面積，這還在微陣列探針位」(6 - 36 μ η 0)的大小范圍內(nèi)。對于有效率的橋式擴(kuò)增，捕獲探針的密度可需要比片段的濃度高100-1000倍(8)，但是10-1000探針每μ m2還在大多數(shù)微陣列生產(chǎn)技術(shù)的可能性范圍之內(nèi)(美國專利 7，115，400;Kawasaki E.(2006)J.Biom.Techniquesl7, 200-206)。實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的其它的體系安排和方法對于本領(lǐng)域技術(shù)人員將是顯而易見的。應(yīng)理解盡管本文中對本發(fā)明的裝置討論了其優(yōu)選的實(shí)施方案、具體的構(gòu)建和配置、以及材料，依然可以進(jìn)行各種形式和細(xì)節(jié)的改變或修飾而不偏離本發(fā)明的范圍和宗
旨
實(shí)施例實(shí)施例1下文討論了 呈現(xiàn)本發(fā)明典型實(shí)施方案的應(yīng)用于基因組DNA樣品的實(shí)施例。本文的不同步驟描述了其中使用不具有末端轉(zhuǎn)移酶活性的DNA聚合酶的實(shí)施方案。1.1.將靶標(biāo)片段捕獲至陣列表面上5’結(jié)合的捕獲探針上(圖1A)捕獲的片段應(yīng)當(dāng)是充分間隔的，從而使其在擴(kuò)增后能夠在測序反應(yīng)中被成像為單個(gè)的群落。靶標(biāo)DNA的片段長度被選為長于捕獲探針，從而使得片段的5’突出端一般都可以呈現(xiàn)。除了捕獲和靶標(biāo)核酸之間的完美匹配之外，捕獲探針還可以被設(shè)計(jì)為允許特異性地結(jié)合稍微突變的DNA片段。在后者的情況中，此種捕獲探針通常需要大約60個(gè)核苷酸的長度。對于將靶標(biāo)DNA雜交至捕獲探針，可以如本領(lǐng)域內(nèi)熟知的那樣使用標(biāo)準(zhǔn)的雜交緩沖液、條件以及雜交后清洗條件。如果設(shè)想與突變的靶標(biāo)核酸雜交，則相應(yīng)地調(diào)整為嚴(yán)格條件。1.2.捕獲探針的延伸(圖1B)將雜交的捕獲探針的3’末端延伸從而形成平端的靶標(biāo)DNA/捕獲探針雙鏈體。這可以通過標(biāo)準(zhǔn)的末端修復(fù)酶混合物來完成，所述酶混合物至少含有5’ -3’聚合酶和5’激酶以將雙鏈體的5’末端磷酸化用以進(jìn)一步連接至其它核酸片段。末端修復(fù)方案通常用于片段化的DNA。在此過程中，捕獲的靶標(biāo)還可以在其3’末端進(jìn)行延伸，但卻對方法中的另外的步驟沒有影響。為了使捕獲探針延伸，在3’末端需要自由的羥基?；诖嗽?，在本發(fā)明的方法中捕獲探針用其5’末端附著至支持物。5’末端的附著通常是通過直接合成、通過單個(gè)寡核苷酸點(diǎn)樣(spotting)隨后化學(xué)附著5’末端、或者通過表面上合成的探針的反轉(zhuǎn)來實(shí)現(xiàn)的(Kwiatkowski M.et al.(1999)Nucleic Acid Res.27，4710-4714)。1.3.發(fā)夾銜接子連接至探針/片段雙鏈體(圖1C)發(fā)夾銜接子的平端連接在本領(lǐng)域內(nèi)是熟知的例如參見Ref.7。雙鏈DNA發(fā)夾銜接子至少具有至少6-7個(gè)堿基對的莖(雙鏈部分)和類似數(shù)目堿基的環(huán)以允許折疊。對于本發(fā)明的方法，一般使用具有更長長度的發(fā)夾分子，從而可以包括大約20個(gè)核苷酸的特異性的引物結(jié)合位點(diǎn)(通常大約15-25個(gè)核苷酸)(在步驟7中進(jìn)一步解釋)，以及基因組中一般不存在的限制性內(nèi)切核酸酶位點(diǎn)，如1-SceI (步驟5、18個(gè)核苷酸)。具有類似特性的其它酶可以從商業(yè)途徑獲得。另外，需要總長度200至500個(gè)核苷酸的橋聯(lián)分子(探針+延伸+發(fā)夾+靶標(biāo))以允許橋式擴(kuò)增(在步驟4中進(jìn)一步解釋)。這會(huì)意味著，有了 50-200bp的靶標(biāo)和探針+延伸的長度，需要大約100個(gè)核苷酸的發(fā)夾。一種相同的發(fā)夾核酸可用于連接不同的經(jīng)延伸的靶標(biāo)DNA/捕獲探針核酸。1.4.變性并隨后雜交至相鄰的捕獲探針，以及橋式擴(kuò)增(圖1D)具有發(fā)夾的經(jīng)延伸的探針/靶標(biāo)復(fù)合物，可以在變性后與其自己雜交。在本發(fā)明的方法中，附著至支持物的鄰近的靶標(biāo)探針數(shù)目在變性后相當(dāng)高，源自靶標(biāo)DNA的DNA序列更可能結(jié)合至鄰近的捕獲探針而不是源自捕獲探針核酸的序列的互補(bǔ)部分。這些復(fù)合物通過所謂的“橋式擴(kuò)增”用標(biāo)準(zhǔn)的熱循環(huán)以熱穩(wěn)定聚合酶進(jìn)行擴(kuò)增或者通過等溫?cái)U(kuò)增來進(jìn)行擴(kuò)增。與使用大約20-40個(gè)核苷酸的引物的PCR反應(yīng)相比，橋式擴(kuò)增中的復(fù)性步驟可能需要更長的時(shí)間，因?yàn)樘结?引物長于標(biāo)準(zhǔn)的PCR引物。為了有效地進(jìn)行橋式擴(kuò)增，一般使用200-500個(gè)堿基的總的橋長度。這可以通過調(diào)整捕獲探針、DNA片段、以及發(fā)夾分子的長度來實(shí)現(xiàn)。重復(fù)上述的變性、雜交和延伸的步驟?！阈枰?0至60循環(huán)的擴(kuò)增以產(chǎn)生可以很好檢測的群落。在擴(kuò)增之后，繼而用標(biāo)準(zhǔn)的緩沖液洗掉PCR試劑。1.5.雙鏈體橋的切割(圖1E)用限制性內(nèi)切核酸酶在源自發(fā)夾銜接子的序列內(nèi)的特異性識別位點(diǎn)切割擴(kuò)增步驟之后獲得的雙鏈DNA。典型的限制性內(nèi)切核酸酶識別位點(diǎn)是經(jīng)選擇的，在基因組序列中很罕見。具有大的識別位點(diǎn)的酶如1-SceI適宜于此種目的。

1.6.經(jīng)切割的DNA的變性(圖1F)經(jīng)切割的雙鏈體被變性(通過加熱或者化學(xué)手段)并用標(biāo)準(zhǔn)緩沖液洗掉未附著至表面的DNA。得到了附著的分子，其由捕獲探針核酸(底部的實(shí)線)、與靶標(biāo)DNA互補(bǔ)的未知核酸(虛線)以及發(fā)夾銜接子核酸的部分(上面線上的實(shí)線)所組成。1.7.未知靶標(biāo)DNA的測序(圖1G)使用與發(fā)夾銜接子互補(bǔ)的通用引物(generic primer),由任意適宜的測序化學(xué)來進(jìn)行測序反應(yīng)，如一個(gè)堿基一個(gè)堿基地添加可逆終止核苷酸。實(shí)施例2.方法的實(shí)驗(yàn)細(xì)節(jié)2.1.靶標(biāo)DNA與捕獲探針的雜交市售氨基甲硅烷載片上具有58個(gè)核苷酸長度的捕獲探針位點(diǎn)的內(nèi)部點(diǎn)樣陣列被用于40個(gè)核苷酸的靶標(biāo)DNA的雜交，全部互補(bǔ)于捕獲探針。該陣列與5’末端經(jīng)Atto700熒光標(biāo)記所標(biāo)記的靶標(biāo)DNA的IOpM或IOnM溶液雜交。用不能與靶標(biāo)DNA雜交的參照探針(其是具有Atto700標(biāo)記的非結(jié)合性DNA部分)和具有不相關(guān)序列的探針(非結(jié)合性探針)的位點(diǎn)進(jìn)行了對照。用靶標(biāo)DNA在3x SSC;0.1%SDS中于50° C進(jìn)行了 30min雜交。對于基因組DNA(具有50-5000bp的片段長度)的雜交，適合進(jìn)行更長時(shí)間(1-64小時(shí))的雜交。用Ix SSC; 0.2%SDS于室溫將雜交的探針洗滌3x5min。對標(biāo)記的檢測顯示出，在參照探針之外，靶標(biāo)DNA結(jié)合至捕獲探針，而非結(jié)合性探針則未被檢測到。
2.2.延伸修復(fù)進(jìn)行另外的雜交試驗(yàn)，其中使用上述的條件、以及具有捕獲探針(無熒光標(biāo)記)參照和非結(jié)合性探針的類似的經(jīng)點(diǎn)樣陣列:-1OnM的62個(gè)核苷酸的靶標(biāo)DNA具有與捕獲探針互補(bǔ)的40個(gè)核苷酸以及包含鳥嘌呤的4個(gè)核苷酸的5’突出端。-OnM的58個(gè)核苷酸的靶標(biāo)DNA具有與捕獲探針互補(bǔ)的40個(gè)核苷酸且無5’突出端。雜交之后，用Klenow酶和dATP、dGTP、dTTP及Cy5_標(biāo)記的dCTP在Klenow緩沖液+0.5%BSA中于37。C使捕獲探針延長30-60min。通過用Ix SSC; 0.2%SDS洗滌3x5min而使反應(yīng)停止。Cy5熒光標(biāo)記僅與具有5’突出端的靶標(biāo)探針一起被檢測。形成平端復(fù)合物的無突出端的探針，并無核苷酸摻入(具有和不具有突出端的探針都在其3’有與捕獲探針不互補(bǔ)的18bp的尾巴，其封閉了核苷酸在分子這一邊的摻入)。2.3.銜接子連接.
用未標(biāo)記的核苷酸重復(fù)上述的實(shí)驗(yàn)，并將500nM的5’磷酸化的發(fā)夾寡核苷酸(具有20個(gè)核苷酸的環(huán)和6個(gè)堿基對的莖或者具有28個(gè)核苷酸的環(huán)和33個(gè)堿基對的莖)按照如下進(jìn)行連接:于37° C在連接酶緩沖液+0.5%BSA中用T4連接酶使探針-靶標(biāo)雙鏈體進(jìn)行磷酸化 45_60min。在連接酶緩沖液+0. 5%BSA中用T4連接酶和發(fā)夾寡核苷酸于室溫進(jìn)行連接。通過用Ix SSC; 0.2%SDS洗滌3x5min來去除未連接的發(fā)夾發(fā)夾在其環(huán)區(qū)域含有內(nèi)部Atto700標(biāo)記以使得可以檢測連接的發(fā)夾和評估連接產(chǎn)率。2.4.橋式擴(kuò)增的第一步作為原理的證據(jù)，以未標(biāo)記的發(fā)夾用IOnM的靶標(biāo)DNA (40個(gè)核苷酸與捕獲探針互補(bǔ)，無突出端)重復(fù)上述的實(shí)驗(yàn)。之后按照如下進(jìn)行第一輪的橋式擴(kuò)增:在3x SSC;0.1%SDS中于95° C將具有連接的發(fā)夾的雙鏈體變性3min并于50° C重雜交(rehybridize) 30mino用Klenow 酶和 dATP、dGTP、dTTP 及 Cy5_ 標(biāo)記的 dCTP 在 Klenow 緩沖液 +0.5%BSA中于37° C進(jìn)行第二鏈合成30-60min。標(biāo)記的檢測證明了第二鏈的合成已經(jīng)發(fā)生。實(shí)施例3.替代的銜接子連接步驟的實(shí)驗(yàn)細(xì)節(jié)經(jīng)若干修改后重復(fù)實(shí)施例2 (見上文)所述的實(shí)驗(yàn):使用組合了超結(jié)構(gòu)(Schott)的Nexterion P MPX-16 載片(SCHOTT)代替 SAL-載片。此載片產(chǎn)生很低的背景、良好的信號-背景比；另外，不需要封閉。相應(yīng)地，進(jìn)行包括如下步驟的SCHOTT洗滌方案:洗滌緩沖液I (PBST，2.0%):具有2.0% Tween 20的PBS:由于該載片(包括超結(jié)構(gòu))已在緩沖液中完全浸潰，在緩沖液中去除了超結(jié)構(gòu)的密封，導(dǎo)致洗滌緩沖液即刻流入。
洗滌緩沖液2 (PBS T, 1.0%):具有 1.0% Tween 20 的 PBS: 5min 并搖動(dòng)洗滌緩沖液3 (PBS T, 0.5%):具有 0.5% Tween 20 的 PBS: 2min 并攪動(dòng)洗滌緩沖液4 (PBS T, 0.1%):具有 0.1% Tween_ 20 的 PBS: 2min 并攪動(dòng)PBS:2x2min 并攬動(dòng)在37° C同時(shí)進(jìn)行核酸的末端修復(fù)和磷酸化反應(yīng)大約lh。4個(gè)核苷酸的末端修復(fù)可于5分鐘內(nèi)進(jìn)行。隨后，通過將5%的PEG8000 (40%w/v)加入至反應(yīng)溶液來進(jìn)行連接反應(yīng)。連接在室溫進(jìn)行大約lh、2h、或 4h或者過夜。實(shí)驗(yàn)證明在室溫連接大約2h足以產(chǎn)生良好的連接結(jié)
果O實(shí)施例4.延伸修復(fù)使用實(shí)施例2和3所述的條件、及具有捕獲探針(無熒光標(biāo)記)參照和非結(jié)合性探針的類似的經(jīng)點(diǎn)樣的陣列來進(jìn)行另外的雜交反應(yīng):IOnM的74個(gè)核苷酸的靶標(biāo)DNA具有與捕獲探針互補(bǔ)的40個(gè)核苷酸以及包含鳥嘌呤殘基的16個(gè)核苷酸的5’突出端。在雜交之后，用Klenow酶和dATP或者dTTP或者dATP和dCTP或dTTP和dCTP的混合物在Klenow緩沖液+0.5%BSA中使捕獲探針于37° C延長30-60min。作為參照，進(jìn)行了含有所有四種核苷酸的延長反應(yīng)。在延長反應(yīng)期間還進(jìn)行了磷酸化反應(yīng)以使用T4激酶在激酶緩沖液+0.5%BSA中對探針-靶標(biāo)雙鏈體進(jìn)行磷酸化。用T4連接酶和發(fā)夾寡核苷酸在連接酶緩沖液+0.5%BSA和5%PEG8000 (40w/v)中于室溫進(jìn)行2小時(shí)的連接。通過使用Schott洗滌方案去除未連接的發(fā)夾。發(fā)夾在其環(huán)中含有內(nèi)部Atto700標(biāo)記以使得可以檢測連接的發(fā)夾以及評估連接的產(chǎn)率。由于連接僅可以在平端上發(fā)生，檢測到標(biāo)記證明了 16-核苷酸的突出端完全被核苷酸所填充。如圖5中所示，當(dāng)使用正常核苷酸混合物(A、C、T和G)進(jìn)行末端修復(fù)時(shí)(參照)發(fā)生連接，僅使用A核苷酸進(jìn)行末端修復(fù)后不發(fā)生連接，而僅使用T核苷酸進(jìn)行末端修復(fù)后發(fā)生不太理想的連接。對于僅使用T核苷酸進(jìn)行末端修復(fù)后此特異性的序列連接，當(dāng)將C核苷酸加入至末端修復(fù)反應(yīng)時(shí)，可改善至參照反應(yīng)的水平。因此，對于隨后的發(fā)夾結(jié)構(gòu)的連接，當(dāng)加入序列特異性核苷酸時(shí)可以改善結(jié)果，例如本實(shí)施例的情況中互補(bǔ)于最后的核苷酸的C。對于其它序列，最終的核苷酸可以是不同的，因此，可以向包含T核苷酸的反應(yīng)溶液中加入不同的核苷酸。該實(shí)例表明，可以用Klenow聚合酶與僅僅T核苷酸或者與包含T核苷酸的組合一起進(jìn)行引物延伸步驟，以防止橋式擴(kuò)增期間的自我雜交。實(shí)施例5.用ATCG、僅有A或僅有T核苷酸的延伸修復(fù)進(jìn)行了另一個(gè)陰性對照實(shí)驗(yàn)，其中將具有4個(gè)核苷酸的突出端的片段序列雜交至壓印在玻璃載片上的捕獲探針。用Klenow聚合酶在分別在:存在全部四種核苷酸(A、T、C和G)時(shí)、在僅存在A核苷酸時(shí)或僅存在T核苷酸時(shí)進(jìn)行末端修復(fù)反應(yīng)。在此末端修復(fù)反應(yīng)之后，用含有所有四種核苷酸(其中C-核苷酸被熒光標(biāo)記)的核苷酸混合物進(jìn)行第二個(gè)末端修復(fù)反應(yīng)。在此第二個(gè)末端修復(fù)反應(yīng)之后的熒光信號表明并不是所有的末端在第一個(gè)反應(yīng)中都完成了，因此僅用A或T核苷酸進(jìn)行的末端修復(fù)并未發(fā)揮作用(參見圖6)，正如所預(yù)期的那樣。此結(jié)果因此確認(rèn)了實(shí)施例4所述的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)。實(shí)施例表明可以用Klenow聚合酶以及ATCG、僅有A或僅有T核苷酸來進(jìn)行引物延伸反應(yīng)。實(shí)施例6.比較實(shí)施例將平端發(fā)夾出個(gè)堿基對的莖和20個(gè)核苷酸的環(huán))連接至單鏈捕獲探針的效率與相同發(fā)夾核酸連接至雜交的因而是雙鏈的捕獲探針的效率進(jìn)行比較(圖3)。根據(jù)所測量的熒光信號(作為參照探針的％以糾正掃描之間的差異)并取若干個(gè)實(shí)驗(yàn)的平均，連接至雙鏈探針的效率比連接至單鏈探針高10 倍。
權(quán)利要求
1.用于擴(kuò)增靶標(biāo)核酸的方法，所述方法包括如下步驟: a)提供具有多個(gè)核酸捕獲探針的支持物，其中所述多個(gè)探針通過核酸的5’末端固定在支持物上， b)將靶標(biāo)核酸與捕獲核酸探針雜交以形成探針/靶標(biāo)復(fù)合物， c)用聚合酶延伸捕獲探針核酸，其中靶標(biāo)核酸被用作捕獲探針核酸延伸的模板， d)將經(jīng)延伸的靶標(biāo)/探針雙鏈核酸連接至發(fā)夾核酸，其中將發(fā)夾核酸的5’末端連接至經(jīng)延伸的探針的3’末端并且將發(fā)夾核酸的3’末端連接至靶標(biāo)核酸的5’末端， e)使靶標(biāo)核酸的3’末端結(jié)合至所述支持物上的所述多個(gè)核酸捕獲探針中的另外的探針， f)通過聚合酶延伸所述另外的探針的3’末端， g)通過重復(fù)步驟e)和f)擴(kuò)增步驟f)中所獲得的核酸。
2.權(quán)利要求1的方法，其中步驟c)的聚合酶具有3’至5’的校正外切核酸酶活性并且其中所述發(fā)夾核酸形成平端莖。
3.權(quán)利要求1或2的方法,其中步驟c)的聚合酶是Pfu(激烈火球菌(Pyrococcusfuriosus)) DNA 聚合酶。
4.權(quán)利要求1的方法，其中步驟c)的聚合酶具有3’末端轉(zhuǎn)移酶活性，導(dǎo)致在雙鏈核酸的3’末端的突出端，并且其中所述發(fā)夾核酸具有5’突出端，與雙鏈核酸的3’互補(bǔ)。
5.權(quán)利要求1或3的方法，其中步驟c)的聚合酶是Taq(水生棲熱菌)DNA聚合酶，生成腺嘌呤的3’突出端，并且其中發(fā)夾的5’突出端是胸腺嘧啶核苷。
6.權(quán)利要求1的方法，其中步驟c)中的聚合酶是Klenow聚合酶，其在存在單一類型的核苷酸時(shí)使用，沿著捕獲的片段序列生成一系列相同的核苷酸。
7.權(quán)利要求6的方法，其中所述單一類型的核苷酸是dTTP。
8.權(quán)利要求1的方法，其中步驟d)的將經(jīng)延伸的靶標(biāo)/探針雙鏈核酸連接至發(fā)夾核酸是在連接反應(yīng)中存在PEG8000時(shí)進(jìn)行的。
9.權(quán)利要求1至8任一項(xiàng)的方法，其中所述靶標(biāo)核酸是DNA。
10.權(quán)利要求1至9任一項(xiàng)的方法，其中發(fā)夾序列在其環(huán)中包含用于罕見的限制性內(nèi)切核酸酶的序列。
11.權(quán)利要求1至10任一項(xiàng)的方法，其中支持物是平面支持物，包含不同的區(qū)別區(qū)域，每個(gè)區(qū)域包含多個(gè)不同的探針。
12.權(quán)利要求1至10任一項(xiàng)的方法，其中支持物是微載體，其中所述微載體包含多個(gè)一種核酸捕獲探針。
13.權(quán)利要求12的方法，其中所述微載體包含可檢測標(biāo)記并且其中該可檢測標(biāo)記限定了附著至微載體的捕獲探針的序列。
14.權(quán)利要求1至13任一項(xiàng)的方法，其中在權(quán)利要求1的步驟g)中的擴(kuò)增之后進(jìn)行相應(yīng)于靶標(biāo)核酸的核酸序列確定。
15.權(quán)利要求14的方法，其中所述序列確定是在平面支持物上或者在權(quán)利要求13的標(biāo)記的微載體上進(jìn)行的，還包括將確定的序列與平面支持物上的區(qū)域或微載體上的標(biāo)記相關(guān)聯(lián)的步驟。
全文摘要
本發(fā)明描述了用于擴(kuò)增靶標(biāo)核酸的方法，其中靶標(biāo)核酸與通過5'末端固定在支持物上的捕獲探針核酸雜交。用聚合酶進(jìn)一步延伸雜交產(chǎn)物以形成雙鏈核酸。將發(fā)夾核酸連接至此雙鏈核酸。將此連接產(chǎn)物進(jìn)一步擴(kuò)增并測序。
文檔編號C12Q1/68GK103221552SQ201180042450
公開日2013年7月24日 申請日期2011年8月31日 優(yōu)先權(quán)日2010年9月1日
發(fā)明者H·M·費(fèi)特斯馬, M·J·奧弗戴克, A·范德斯托爾佩, P·J·范德扎格 申請人:皇家飛利浦電子股份有限公司