專利名稱：結(jié)腸直腸癌的微rna標志物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
所公開的主題通常涉及結(jié)腸直腸癌的標志物和檢測結(jié)腸直腸癌的方法。
背景技術(shù)：
已知在一些腫瘤中某些微RNA具有改變的表達。以下現(xiàn)有技術(shù)出版物是著名的Ahmed, et al. “Diagnostic MicroRNA Markers for Screening SporadicHumanColon Cancer and Active Ulcerative Colitis in Stool and Tissue (幾便和組織中用于篩查偶發(fā)性人結(jié)腸癌和活動性潰瘍性結(jié)腸炎的診斷用微RNA標志物)”Cancer Genomicsand Proteomics 6:281-296(2009)； 2007 年 I 月 3 日提交的 WO 2007/081470MICR0-RNA BASEDMETH0DS ANDCOMPOSITIONS FOR THE DIAGNOSIS ANDTREATMENT OF SOLID CANCERS (用于診斷和治療實體癌的基于微RNA的方法和組合物)，Croce, et al.。發(fā)明概述在一個實施方案中，公開了對生物樣品中的結(jié)腸直腸癌細胞進行診斷或提供預(yù)后的方法，所述方法包括檢測所述生物樣品中RNA序列存在的步驟，所述RNA序列在全序列長度上與選自由SEQ. ID. N0S: 1-7構(gòu)成的組的序列至少有約98%相似性，其中所述RNA序列的存在指示所述樣品中結(jié)腸直腸癌細胞的存在。在可選實施方案中，所述方法還可以包括將樣品中所述序列的水平與對照中所述序列的水平進行比較。在可選實施方案中，所述在全序列長度上的相似性可以為至少約99%。在可選實施方案中，所述在全序列長度上的相似性可以為約100%。在可選實施方案中，所述方法還可以包括檢測至少2個所述序列。在可選實施方案中，所述方法還可以包括檢測至少4個所述序列。在可選實施方案中，所述生物樣品可以是糞便樣品。在可選實施方案中，所述組可以由SEQ. ID. NOS :4-7構(gòu)成。在可選實施方案中，所述檢測可以包括擴增所述序列。在可選實施方案中，公開了對生物樣品中的結(jié)腸直腸癌進行診斷或提供預(yù)后的方法，所述方法包括檢測所述樣品中在高嚴緊性條件下與選自由SEQ. ID. N0S: 1-7構(gòu)成的組的序列雜交的RNA序列，其中所述RNA序列的存在指示所述樣品中結(jié)腸直腸癌細胞的存在。在可選實施方案中，所述方法可以包括將所述樣品中所述序列的水平與對照中所述序列的水平進行比較。在可選實施方案中，所述方法還可以包括檢測至少2個序列或可以包括檢測至少4個所述序列。在可選實施方案中，所述樣品可以是糞便樣品。在可選實施方案中，所述組可以由SEQ. ID. NOS :4-7構(gòu)成。在可選實施方案中，公開了用于對生物樣品中的結(jié)腸直腸癌細胞進行診斷或提供預(yù)后的試劑盒，所述試劑盒包含
適于逆轉(zhuǎn)錄與SEQ. ID. NOS: 1_7中的任一項在至少15個連續(xù)堿基對上具有至少約98%相似性的RNA的引物。在試劑盒的可選實施方案中，在序列全長度上的序列相似性可以為約100%。在試劑盒的可選實施方案中，所述生物樣品可以為糞便樣品。在試劑盒的可選實施方案中，所述逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生DNA序列，并且所述試劑盒還包含適于擴增所述逆轉(zhuǎn)錄的DNA序列的引物對。在可選實施方案中，公開了用于對生物樣品中的結(jié)腸直腸癌進行診斷或提供預(yù)后的探針，所述探針包括選自SEQ. ID. N0S: 1-7的序列，其中所述序列在高嚴緊性條件下與所述樣品中存在的RNA序列雜交，并且其中所述RNA序列的存在指示所述樣品中結(jié)腸直腸癌 細胞的存在。附圖簡要描述圖IA是來自對照和CRC受累個體的糞便中miR-221 (SEQ. ID. NO:2)豐度的圖示。圖IB是來自CRC患者和對照的糞便樣品中miR-221 (SEQ. ID. NO:2)的ROC分析。圖2A是來自對照和CRC受累個體的糞便中miR-135b(SEQ. ID. NO:2)豐度的圖示。圖2B是來自CRC患者和對照的糞便樣品中miR-135b (SEQ. ID. NO: I)的ROC分析。圖3A是來自對照和CRC受累個體的糞便中miR_18a(SEQ. ID. NO:3)豐度的圖示。圖3B是來自CRC患者和對照的糞便樣品中miR_18a(SEQ. ID. NO:3)的ROC分析。圖4A是來自對照和CRC受累個體的糞便中miR_19a(SEQ. ID. NO:4)豐度的圖示。圖4B是來自CRC患者和對照的糞便樣品中miR_19a(SEQ. ID. NO:4)的ROC分析。圖5A是來自對照和CRC受累個體的糞便中miR_223(SEQ. ID. NO:5)豐度的圖示。圖5B是來自CRC患者和對照的糞便樣品中miR-223 (SEQ. ID. NO:5)的ROC分析。圖6A是來自對照和CRC受累個體的糞便中miR_301a(SEQ. ID. NO:6)豐度的圖示。圖6B是來自CRC患者和對照的糞便樣品中miR_301a(SEQ. ID. NO:6)的ROC分析。圖7A是來自對照和CRC受累個體的糞便中miR-592(SEQ. ID. NO:7)豐度的圖示。圖7B是來自CRC患者和對照的糞便樣品中miR-592 (SEQ. ID. NO:7)的ROC分析。圖8顯示了實施方案的一系列人miRNA序列。圖9是實施方案中ROC分析和診斷分析的參數(shù)表。實施方案的詳細描述術(shù)語在本公開中，以下術(shù)語具有如下所示的含義在本公開中，術(shù)語“或”通常的含義包括“和/或”，除非文中內(nèi)容指明并非如此。在本公開中，術(shù)語“生物標志物”或“標志物”表示與疾病相關(guān)的諸如基因的物質(zhì)或變量測量，所述物質(zhì)或變量測量可以作為該疾病的指示物或預(yù)測物。生物標志物或標志物是參數(shù)，從中可以推知疾病的存在或風險，并且在實施方案中可以用于確定疾病的預(yù)后或提供疾病的檢測。在本公開中，術(shù)語“核酸”、“核酸序列”等表示多核苷酸，其可以是gDNA、cDNA或RNA，并且可以是單鏈的或雙鏈的。該術(shù)語還包括肽核酸(PNA)，或任何化學上的DNA樣或RNA樣物質(zhì)?！癱DNA”是指由細胞中天然存在的mRNA制備而來的拷貝DNA?！癵DNA”是指基因組DNA。以上的組合也是可能的(即，部分是gDNA且部分是cDNA的重組核酸)。
在本公開中，術(shù)語“微RNA”或“miRNA”或等同術(shù)語表示短的RNA序列，其長度可以是約15-30個核苷酸(或更長或更短)，并且可以是非編碼的。在本公開中，術(shù)語“R0C”表示“受試者工作特征(receiveroperatingcharacteristic) ”,并且是指核酸分析的方法。ROC分析可以用于評估測試的診斷性能。ROC圖是測試在不同截止值的靈敏性％和特異性％的圖。ROC曲線可以用于區(qū)分2個樣品組，例如具有特定特性的對照或正常樣品和測試或?qū)嶒灅悠?。通常?個樣品中所見的分布會重疊，這使其成為確定它們之間是否存在真實差異的很好的工具。如果將ROC分析的區(qū)別閾值或特異性設(shè)高，則該測試不太可能產(chǎn)生假陽性，即不太可能錯誤地鑒定2個樣品間的差異。然而，在這些情況下，該測試更可能遺漏樣品間存在真實差異的情況，并因此更可能會鑒定不出某些病例。如果測試的靈敏性增加，則特異性會相應(yīng)地下降。因此，如果使測試更敏感，則該測試更可能鑒定出患病人群中的大部分或全部，但是也會在更多未患病人群中鑒定出疾病。ROC曲線上的每個點代表靈敏性及其各自的特異性?？梢曰赗OC曲線選擇截止值，從而鑒定出靈敏性和特異性均具有可接受的值的點，并且該點可以用于進行用于診斷 目的的測試。當使用者能夠以本領(lǐng)域技術(shù)人員能容易理解的方式修改參數(shù)時，對于在本公開中所述的實例，選擇每個閾值來獲取均合理的靈敏性和特異性。但具體情況下，靈敏性和特異性都保持在約60%-90%，但是更低的和更高的值也是可能的。ROC的另一有用的特征是曲線下面積(AUC)值，其可以定量該測試區(qū)分不同的樣品性質(zhì)的總能力，在本情況下，可以定量該測試區(qū)分患有結(jié)腸直腸癌的個體和未患結(jié)腸直腸癌的個體的總能力。鑒定出真陽性幾乎等于隨機可能性的測試會產(chǎn)生面積為O. 5的ROC曲線。具有完美特異性和靈敏性的不產(chǎn)生假陽性和假陰性的測試的面積為I. 00。現(xiàn)實情況下，任何測試的面積都會在這兩個值之間。在本文所用的一個應(yīng)用中，可以基于CRC患者和對照個體的糞便樣品中特定微RNA的檢測結(jié)果來繪制ROC圖，從而產(chǎn)生相應(yīng)糞便miRNA測試在不同截止值下的靈敏性％和特異性％的圖。本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠容易地理解和應(yīng)用進行ROC分析的應(yīng)用。使用統(tǒng)計學軟件(Prism)基于癌癥組和非癌癥組的miRNA水平的輸入數(shù)據(jù)生成ROC曲線。在本公開中，術(shù)語“嚴緊的雜交條件”和“高嚴緊性”是指探針與其靶標子序列雜交而不與其它序列雜交時所處于的條件，所述靶標子序列通常處于核酸的復(fù)合混合物中。嚴緊的條件是序列依賴性的，并且在不同情況下會不同。較長的序列在較高的溫度時特異性地雜交。核酸雜交的廣泛指導(dǎo)見于Ti jssen, Techniques in Biochemistry andMolecularBiology—Hybridization with Nucleic Probes (生物化學和分子生物學技術(shù)-核酸探針的雜交)，"Overview of principles of hybridization and the strategyofnucleic acid assays (雜交原理和核酸測定策略的概述)〃(1993),并且會被本領(lǐng)域技術(shù)人員容易理解。通常，將嚴緊的條件選擇為低于在限定的離子強度、pH下特定序列的熱熔點(Tm)約5-10° C。Tm是平衡時與靶標互補的探針中的50%與靶序列雜交的溫度(在限定的離子強度、pH和核酸濃度下)(因為靶序列是過量存在的，所以在Tni下，在平衡時，50%的探針被占據(jù))。添加諸如甲酰胺的去穩(wěn)定劑也可以實現(xiàn)嚴緊的條件。對于選擇型雜交或特異性雜交，陽性信號至少是背景的2倍，優(yōu)選為10倍于背景的雜交。示例性的嚴緊雜交條件可以如下50%甲酰胺，5父35(和1%505，42° C下孵育，或5XSSC，1%SDS，65° C下孵育，在65。(下0.2父55(和0.1%505中洗滌。對于在嚴緊的條件下不彼此雜交的核酸，如果它們編碼的多肽是基本上相同的，則所述核酸仍然是基本上相同的。例如，當使用遺傳密碼所允許的最大密碼簡并性產(chǎn)生核酸拷貝時，會發(fā)生這種情況。在這些情況下，所述核酸通常在中等嚴緊的雜交條件下雜交。示例性的“中等嚴緊的雜交條件”包括在37° C下40%甲酰胺、IM NaCl、1%SDS的緩沖液下雜交，和在37° C下IXSSC中洗滌。陽性雜交至少是背景的兩倍。本領(lǐng)域技術(shù)人員會容易地認識到，可選的雜交和洗滌條件可以用于提供相似的嚴緊性條件。用于確定雜交參數(shù)的其它指導(dǎo)可見于很多參考文獻中，例如，Current Protocols in Molecular Biology(現(xiàn)代分子生物學實驗方法)，ed. Ausubel, et al。對于PCRJ^ 36° C的溫度通常用于低嚴緊性擴增，但是根據(jù)引物長度，退火溫度可以在約32° C和48° C之間變化。對于高嚴緊性PCR擴增，通常是約62° C的溫度，但是根據(jù)引物長度和特異性，高嚴緊性退火溫度可以為約50° C-約65° C。高和低嚴緊性擴增的通常的循環(huán)條件包括持續(xù)30秒-2分鐘的90 ° C-95 ° C的變性期，持續(xù)30秒-2分鐘的退火期，和持續(xù)1-2分鐘的約72° C的延伸期。低和高嚴緊性擴增反應(yīng)的方法和指導(dǎo) 是本領(lǐng)域公知的，并且見于，例如 Innis et al. (1990)PCR Protocols, A Guide toMethodsand Applications (PCR 手冊-方法和應(yīng)用指南)，Academic Press, Inc. N. Y.。在本公開中，術(shù)語“基因表達”和“蛋白表達”表示并包括涉及樣品中存在的基因轉(zhuǎn)錄本或蛋白的量的任何信息，以及關(guān)于基因、RNA或蛋白表達或積累或降解的速率的信息(例如，報告基因數(shù)據(jù)、核失控實驗的數(shù)據(jù)、脈沖追蹤數(shù)據(jù)等)。某些種類的數(shù)據(jù)可以視為與基因和蛋白表達都有關(guān)。例如，細胞中的蛋白水平反映蛋白水平以及轉(zhuǎn)錄水平，并且意圖將這樣的數(shù)據(jù)包括在短語“基因或蛋白表達信息”中?？梢砸悦總€細胞的量，相對于對照基因或蛋白的量，無單位測量等形式給出這樣的信息；術(shù)語“信息”不應(yīng)限制為任何特定表示手段，并且意圖表示提供相關(guān)信息的任何表示。術(shù)語“表達水平”是指基因或蛋白表達數(shù)據(jù)中反映出的或從基因或蛋白表達數(shù)據(jù)中可推斷出的量，無論該數(shù)據(jù)是關(guān)于基因轉(zhuǎn)錄本積累或蛋白積累或蛋白合成速率等在本公開中，術(shù)語“寡核苷酸”表示由2個或更多個核苷酸，優(yōu)選多于3個核苷酸組成的分子。寡核苷酸的精確大小取決于很多因素，反過來，這些因素取決于寡核苷酸的最終功能和用途。在具體實施方案中，寡核苷酸的長度可以為約10個核苷酸-100個核苷酸或10和100之間的任何整數(shù)。在實施方案中，寡核苷酸的長度可以為約10-30個核苷酸，或長度可以為約20-25個核苷酸。在實施方案中，為了特異性，寡核苷酸的長度可以大于約10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24 或 25 個核苷酸。在某些實施方案中，短于這些長度的寡核苷酸可以是合適的。在本公開中，術(shù)語“引物”表示當置于能誘發(fā)與核酸鏈互補的引物延伸產(chǎn)物的合成的條件下，即在核苷酸和諸如DNA或RNA聚合酶的誘發(fā)劑的存在下并且在合適的溫度和pH下，能夠作為合成起始點的寡核苷酸，無論它是純化的限制性消化物中天然存在的或合成產(chǎn)生的。引物可以是單鏈或雙鏈的，并且必須足夠長而在誘發(fā)劑的存在下能引發(fā)所需延伸產(chǎn)物的合成。引物的確切長度取決于多種因素，包括溫度、引物來源和所用的方法。例如，為了診斷和預(yù)后應(yīng)用，根據(jù)靶序列的復(fù)雜性，寡核苷酸引物通常含有至少或多于約10、或15、或20、或25或更多個核苷酸，但是其可以含有更少核苷酸或更多核苷酸。確定引物合適長度中涉及的因素是本領(lǐng)域技術(shù)人員容易理解的。在本公開中，術(shù)語“引物對”表示與靶DNA分子相反鏈雜交至位于待擴增的核苷酸序列的側(cè)翼的靶DNA的區(qū)的引物對。在本公開中，術(shù)語“引物位點”表示引物雜交的靶DNA的區(qū)域。在本公開中，所描述的和要求保護的核酸是指所有形式的核酸序列，包括但不限于如下所述的基因組核酸、前mRNA、mRNA、miRNA、cDNA、cRNA、多態(tài)性變體、等位基因、突變體和種間同系物
(I)在嚴緊的雜交條件下與公開的核酸序列或編碼公開的氨基酸序列及其保守型修飾的變體的核酸序列特異性地雜交，(2)具有優(yōu)選在至少約15、25、30、35、40、50、100或更多核苷酸的區(qū)上與參考核酸序列的核苷酸序列同一性大于約95%,優(yōu)選大于約96%、97%、98%、99%或100%的核酸序列。在本公開中，術(shù)語“生物樣品”或“樣品”包括諸如活檢和尸檢樣品的組織的切片或樣品，和為了組織學目的而獲得的冷凍切片和樣品，或任何這些樣品的處理后形式。生物樣品包括血液和血液組分或產(chǎn)物(例如，血清、血漿、血小板、紅細胞等)，痰液或唾液，淋巴和舌組織，諸如原代培養(yǎng)物、外植體和轉(zhuǎn)化的細胞的培養(yǎng)的細胞，糞便，尿液，胃活檢組織等。生物樣品通常獲自真核生物，可以是哺乳動物，可以是靈長類并且可以是人類個體。為了使用可以通過任何常規(guī)步驟對生物樣品進行處理和加工，所有的這些常規(guī)步驟是本領(lǐng)域技術(shù)人員能容易理解和進行的。在具體的可選實施方案中，可以使用多種方法、合適的試劑從糞便提取微RNA。在具體實施方案中，所述試劑可以包括以下任何試劑(均根據(jù)生產(chǎn)商或其他人描述或建議的方法使用)=TRIzol試劑(Invirogen，Carlsbad, CA，UCA)，TRIzol LS試劑(Invirogen, Carlsbad, CA, UCA)，miRNeasy 小型試劑盒(Qiagen, Valencia, CA, USA)，mirVana miRNA 分離試劑盒(Applied Biosystems, Foster City, CA, US), miRCURY RNA 分離試劑盒(Exiqon,Vedbaek,Denmark)。在具體實施方案中，可以使用適于從生物樣品分離微RNA的任何可商購的試劑盒或試劑。在本公開中，術(shù)語“活檢”是指為了診斷或預(yù)后評估而移除組織樣品的過程，并且也指組織樣本自身。本領(lǐng)域已知的的任何合適的活檢技術(shù)可以用于本發(fā)明的診斷和預(yù)后方法。所用的活檢技術(shù)取決于待評估的組織類型(例如，舌、結(jié)腸、前列腺、腎、膀胱、淋巴結(jié)、肝、骨髓、血細胞、胃組織等)等因素。代表性的活檢技術(shù)包括但不限于，切除活檢、切口活檢、針吸活檢、手術(shù)活檢和骨髓活檢，并且可以包括結(jié)腸鏡檢查。多種活檢技術(shù)是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的，他們需要進行很少的實驗便可以從這些技術(shù)中選擇并使用。在本公開中，術(shù)語“分尚的”核酸分子表不從通常與該分尚的核酸分子相關(guān)聯(lián)的其它核酸分子中分尚出的核酸分子。因此，“分尚的”核酸分子包括但不限于這樣的核酸分子其不具有在分離的核酸來源于的生物體的基因組中天然地位于該核酸的一個或兩個末端側(cè)翼的序列(例如，通過PCR或限制性核酸內(nèi)切酶消化而產(chǎn)生的cDNA或基因組DNA片段)。通常將這樣的分離的核酸分子引入載體(例如，克隆載體或表達載體)，以便于操控或產(chǎn)生融合核酸分子。此外，分離的核酸分子可以包括基因工程的核酸分子，例如重組的或合成的核酸分子。存在于諸如核酸文庫(例如cDNA或基因組文庫)或含有限制性消化的基因組DNA的凝膠(例如，瓊脂糖或聚丙烯酰胺)的一部分中的數(shù)百至數(shù)百萬其它核酸分子中的核酸分子不被認為是分離的核酸。
在本公開中，“細胞”可以是分離的，可以被包含在細胞群體中，可以在培養(yǎng)物中，或可以被包含在活的個體中，并且可以是哺乳動物細胞，可以是人的細胞。同樣，“組織”可以包括任何數(shù)目的細胞，并且可以被包含在活的個體中或可以從其中被分離出。在本公開中，“癌癥”表示并包括任何惡性腫瘤(malignancy)、或惡性細胞分裂或惡性腫瘤(malignant tumour),或具有不受控制的或不適當?shù)募毎鲋车娜魏渭膊顟B(tài)，并且包括但不限于特征為不受控制的或不適當?shù)募毎鲋车娜魏渭膊?。在本公開中，術(shù)語“結(jié)腸癌”、“結(jié)腸直腸癌”和“CRC”具有相同的含義，并且表示結(jié)腸或直腸的癌癥，并且包括具有結(jié)腸直腸癌特征的細胞。結(jié)腸直腸癌可以是，但不限于，腺癌、平滑肌肉瘤、淋巴瘤、黑色素瘤和神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤，并且包括癌癥前期細胞和細胞群體。
·
在本公開中，術(shù)語“結(jié)腸癌細胞”或“結(jié)腸直腸癌細胞”或“CRC細胞”表示具有結(jié)腸癌或結(jié)腸直腸癌特征的細胞，并且包括癌癥前期細胞。在本公開中，術(shù)語“癌癥前期”表示處于轉(zhuǎn)化為癌細胞的早期階段或傾向于轉(zhuǎn)化為癌細胞的細胞。這樣的細胞可以表現(xiàn)出一種或多種具有癌細胞特征的表型性狀。在本公開中，術(shù)語“純化的”或“基本純化的”或“提取的”，當用來指核酸或多肽時，表示從它們的天然環(huán)境中分離出的核酸或多肽，使得它們占給定樣品中全部核酸或多肽或有機化學物的至少約50%、55%、60%、65%、70%、75%、80、85、90或95%。本文中，可以通過SDS-PAGE和銀染評估蛋白純度?？梢酝ㄟ^瓊脂糖凝膠和EtBr染色評估核酸純度。在本公開中，術(shù)語“檢測”表示觀察生物樣品中的標志物或標志物改變(例如標志物甲基化狀態(tài)的改變或核酸或蛋白序列的表達水平)的任何過程，無論實際上是否檢測到標志物或標志物改變。換言之，探測樣品的標志物或標志物改變的行為是“檢測”，即使標志物被測定為不存在或低于靈敏度水平。檢測可以是定量、半定量或非定量觀察，并且可以基于與一個或多個對照樣品的比較。應(yīng)當理解，檢測本文公開的結(jié)腸癌包括檢測癌癥前期細胞，所述癌癥前期細胞開始發(fā)展為結(jié)腸癌細胞或?qū)⒁l(fā)展為結(jié)腸癌細胞，或具有增加的發(fā)展為結(jié)腸癌細胞的傾向。檢測結(jié)腸癌還可以包括檢測可能的死亡概率或疾病條件的可能的預(yù)后。在本公開中，術(shù)語“同源性”、“同一性”和“相似性”表示2個肽或2個核酸分子之間的序列相似性?？梢员容^每個序列中的位置來測定“同源性”、“同一性”或“相似性”，為了比較的目的可以將所述序列進行比對。當比較的序列中的等同位置被相同堿基占據(jù)時，所述分子在該位置是相同的。同源性/相似性或同一性的百分比表達是指比較的序列所共享的位置上相同堿基數(shù)的函數(shù)?！盁o關(guān)的”或“非同源的”序列與本發(fā)明的序列共享小于40%同一'丨生,優(yōu)選小于25%同一'丨生。在比較2個核酸序列時,殘基的缺失或多余殘基的存在也降低同一性和同源性/相似性。在具體實施方案中，對于2個或更多序列或子序列，如果按照使用具有下文所述的默認參數(shù)的BLAST或BLAST 2. O序列比較算法進行測定或通過例如國家生物技術(shù)信息中心(National Center for Biotechnology Information(NCBI))在線提供的手動比對和肉眼檢查進行測定，當在比較窗或指定區(qū)上為最大對應(yīng)性進行比較和比對時，如果它們的序列在規(guī)定的區(qū)上是約60%，或約65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一的，可以認為是基本或顯著同源的、相似的或同一的。該定義也涉及或可以用于測試序列的互補物。因此，在本文背景允許的程度下，例如，如果核苷酸序列可以預(yù)測為天然存在于DNA雙鏈體中，或可以以互補鏈中的一條或兩條的形式天然存在，則與特定靶序列或其變體互補的核苷酸序列自身被視為與靶序列“相似”，并且當涉及“相似的”核酸序列時，包括單鏈序列、其互補序列、雙鏈的鏈復(fù)合物、能夠編碼相同或相似多肽產(chǎn)物的序列、以及上述任意一項的任何容許的變體。如果相似性必須限制為單一核酸鏈序列的分析，情況可以包括例如細胞中特定RNA序列或編碼序列的表達的檢測和定量。該定義還包括具有缺失和/或添加的序列，以及具有取代的序列。在實施方案中，同一性或相似性可以是在長度為至少約10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、10、
21、22、23、24、25或更多氨基酸或核苷酸的區(qū)上，或在長度為多于約10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或多于約100個氨基酸或核苷酸的區(qū)上。在本公開中，術(shù)語“擴增”表示由核酸的一個特定基因座得到多個拷貝的過程，所述核酸例如基因組DNA或cDNA。可以使用多種已知手段中的任何一種實現(xiàn)擴增，所述手段包括但不限于聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR)、基于轉(zhuǎn)錄的擴增和鏈置換擴增(SDA)，并且可以包括從RNA模板產(chǎn)生cDNA鏈，然后擴增由此產(chǎn)生的DNA鏈。
在本公開中，術(shù)語“聚合酶鏈式反應(yīng)”或“PCR”表示這樣的技術(shù)變性、與引物的退火和與DNA聚合酶的延伸的循環(huán)被用于將靶DNA序列的拷貝數(shù)擴增至約106倍或更多。用于擴增核酸的聚合酶鏈式反應(yīng)過程可參見美國專利第4，683，195號和第4，683，202號。本領(lǐng)域技術(shù)人員可容易地選擇和采用合適的弓I物和弓I物對，從而當需要時產(chǎn)生cDNA鏈，和視情況擴增所需的DNA和RNA序列。在本公開中，“標記”或“可檢測的部分”是可通過分光鏡、光化學、生物化學、免疫化學、化學或其它物理手段檢測的組分。例如，有用的標記包括32P、熒光染料、電子致密試齊U、酶(例如，ELISA中常用的酶)、生物素、地高辛或半抗原和可以被制備為可檢測的蛋白。在本公開中，術(shù)語“重組”，當涉及例如細胞、或核酸、蛋白、或載體時，表示已經(jīng)通過引入異源核酸或蛋白或改變天然核酸或蛋白對所述細胞、核酸、蛋白或載體進行了修飾，或表示所述細胞來源于如此修飾的細胞。因此，例如，重組細胞表達不見于天然(非重組)形式的細胞中的基因或表達異常表達的、低表達的或根本不表達的天然基因。某些序列的排除:應(yīng)當理解，在具體實施方案中，序列、探針、引物、多肽等的個體實例可以除外。核酸的檢測多種檢測具體核酸序列的方法及其應(yīng)用對于本領(lǐng)域技術(shù)人員是顯而易見的。使用多種不同方法可以檢測核酸分子。核酸檢測方法包括，例如，PCR和核酸雜交(例如，Southern印跡、Northern印跡或原位雜交)。具體而言，能夠擴增祀核酸的寡核苷酸(例如，寡核苷酸引物)可以用于PCR反應(yīng)。PCR方法通常包括以下步驟獲得樣品、從所述樣品分離核酸(例如，DNA、RNA或二者)和使所述核酸與一種或多種寡核苷酸引物接觸，所述引物能在模板核酸發(fā)生擴增的條件下特異性地與模板核酸雜交。在模板核酸的存在下，產(chǎn)生擴增產(chǎn)物。核酸擴增和擴增產(chǎn)物檢測的條件是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。已開發(fā)出多種對于基礎(chǔ)PCR技術(shù)的改進，包括但不限于，錨定PCR、RACE PCR、RT-PCR和連接酶鏈反應(yīng)(LCR)。擴增反應(yīng)中的引物對必須與模板核酸的相反鏈退火，并且應(yīng)該彼此保持合適的距離，使得聚合酶能有效地跨過區(qū)域進行聚合并使得可以使用例如電泳容易地檢測擴增產(chǎn)物。例如，可以使用諸如 OLIGO (MolecularBiology Insights Inc. ,Cascade,Colo.)的計算機程序設(shè)計寡核苷酸引物，以助于設(shè)計具有相似熔解溫度的引物。通常，寡核苷酸引物長度為 10-30 或 40 或 50 個核苷酸(例如，長度為 10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、
22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50個核苷酸)，但是可以更長或更短，只要使用合適的擴增條件。應(yīng)當理解，可以通過以下檢測RNA序列通過逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生合適的cDNA鏈，并隨后使用合適的方法擴增或檢測得到的DNA序列。在本公開中，術(shù)語“標準擴增條件”是指擴增反應(yīng)混合物的基本組分和循環(huán)條件，所述循環(huán)條件包括模板核酸變性、寡核苷酸引物與模板核酸退火和通過聚合酶的引物延伸以產(chǎn)生擴增產(chǎn)物的多個循環(huán)。通常使用可檢測的標記實現(xiàn)擴增產(chǎn)物或雜交復(fù)合物的檢測。術(shù)語“標記”，當涉及核酸時，意圖包括通過將可檢測的物質(zhì)偶聯(lián)(即，物理連接)至核酸的核酸直接標記，以及通過與直接標記了可檢測的物質(zhì)的另一試劑進行反應(yīng)的核酸間接標記?？蓹z測的物質(zhì)包括 各種酶、輔基、熒光材料、冷光材料、生物冷光材料和放射性材料。合適的酶的實例包括辣根過氧化物酶、堿性磷酸酶、半乳糖苷酶或乙酰膽堿酯酶；合適的輔基復(fù)合物的實例包括抗生物素蛋白鏈菌素/生物素和抗生物素蛋白/生物素；合適的熒光材料的實例包括傘形酮、熒光素、異硫氰酸熒光素、羅丹明、二氯代三嗪基胺熒光素、丹磺酰氯或藻紅蛋白；冷光材料的實例包括魯米諾；生物冷光材料的實例包括熒光素酶、蟲熒光素和水母蛋白；合適的放射性材料的實例包括125I、131I、35S或3h。間接標記的實例包括用生物素將核酸末端標記，使得可以用熒光標記的抗生物素蛋白鏈菌素檢測該核酸。術(shù)語“探針”，當涉及核酸序列時，以其通常含義使用，表示在規(guī)定條件下會與靶序列雜交并且可以用于檢測該靶序列的存在的選擇的核酸序列。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當理解，在某些情況下，探針也可以用作引物，并且引物可以用作探針。產(chǎn)品本公開包括含有一種或多種核酸分子或編碼核酸分子的一種或多種載體的產(chǎn)品(例如，試劑盒)。所述核酸分子是制備用于本文所述的用途，并且可以按照計劃的使用模式適當?shù)貑为毎b或共同包裝。例如，核酸分子或編碼核酸分子的載體可以包含在合適的緩沖液或合適的標記試劑或檢測系統(tǒng)中或伴隨有合適的緩沖液或合適的標記試劑或檢測系統(tǒng)。實施方案的試劑盒可以包含其它試劑(例如，緩沖液、協(xié)同因子、酶檢測系統(tǒng))。試劑盒還可以包含可以測定并與生物樣品進行比較的一個對照樣品或一系列對照樣品。試劑盒的每個組分可以封裝在單獨的容器中，并且所有不同的容器可以位于單一的包裝中。實施方案全面參考

圖1-9描述要求保護的主題的實施方案。在第一實施方案中，公開了對生物樣品中的結(jié)腸直腸癌進行診斷或提供預(yù)后的方法。在實施方案中，所述方法包括檢測所述生物樣品中RNA序列的存在，所述RNA序列在全序列長度上與選自由SEQ. ID. N0S: 1-7構(gòu)成的組的序列至少約98%相似，圖8中列出了序列及其標識符以及用于檢測所述序列的TaqMan微RNA測定。在該方法的實施方案中，所述序列的升高的水平指示結(jié)腸直腸癌的存在。序列的所述升高的水平的檢測可以包括將測試樣品中所述序列的水平與參考水平進行比較?？梢酝ㄟ^與對照進行比較來確定所述參考水平，所述對照可以是或可以包括非癌的對照樣品、或癌的對照樣品、或人工產(chǎn)生或提取的樣品、或參考標準品或可以包括將所述受試樣品的序列水平與預(yù)定的參考水平進行比較。在可選實施方案中，序列相似性可以為至少約99%或至少約100%，并且可以表現(xiàn)在全序列長度上。在可選實施方案中，所述方法可以包括檢測至少I個、2個、3個、4個、5個、6個、7個或8個選自SEQ. ID. NO: 1-7的序列。在可選實施方案中，SEQ. ID. NO: 1-7中的任意一個或多個的檢測可以與檢測其它序列或進行其它診斷或預(yù)后測試相聯(lián)合。在可選實施方案中，可以將一個或多個選擇的序列的水平進行定量，或獨立地或共同地與合適的對照進行比較。在具體實施方案中，測試序列可以選自SEQ. ID. NO: 1-7。在具體實施方案中，生物樣品可以取自個體，所述個體可以是人類個體。在實施方案中，所述生物樣品可以是糞便樣品。在實施方案中，所述檢測可以包括擴增相關(guān)的一個序列或多個序列，或可以包括任何其它形式的檢測方法，本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠容易地理解和使用所有合適的方法。在具體實施方案中，特定微RNA的擴增使用TaqMan微RNA測定(型號442797， Applied Biosystems, Foster City, CA, US)進行。每個微RNA測定的測定號在圖8中不出。每個試劑盒包含用于特定微RNA的逆轉(zhuǎn)錄的引物和用于該微RNA的qPCR的引物/探針混合物。公司未公開引物和探針序列，但是這些序列已知是高嚴緊性和高特異性的。關(guān)于該測定系統(tǒng)的其它資料可以訪問https: //products, appliedbiosystems. com/ab/en/US/adirect/ab cmd=catNaviRate2&catID=601803&tab=DetailInfOo 在具體實施方案中，備選的測定系統(tǒng)可以用于進行測定，例如Qiagen提供的試劑盒。在一個實施方案中，合適的測定系統(tǒng)和試劑盒可以提供2個分析步驟。一個步驟可以是逆轉(zhuǎn)錄(RT)，從而通過連接具體的RT引物將短的miRNA序列轉(zhuǎn)錄為加長的cDNA序列。分析的第二個步驟是定量PCR，所述定量PCR使用添加的序列的正向和反向引物對和用于檢測擴增產(chǎn)物的探針來擴增所述加長的序列。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當理解，許多其它方法可以用于檢測和定量miRNA序列，并且應(yīng)當理解，可以按照需要或視情況對這些方法中的任意一種進行常規(guī)調(diào)整后使用。本文公開的并要求保護的主題不受使用的獲取、檢測、分析、擴增、修飾或定量miRNA的任何特定技術(shù)方法的限制，并且同樣不受引物或引物序列的任何特定選擇的限制。在可選實施方案中，可以使用用戶限定的引物，并且本領(lǐng)域技術(shù)人員利用常規(guī)技術(shù)能夠容易地設(shè)計和使用所述引物。在可選實施方案中，公開了對生物樣品中的結(jié)腸直腸癌進行診斷或提供預(yù)后的方法，所述方法包括檢測所述樣品中在高嚴緊性條件下與選自SEQ. ID. NO: 1-7的序列雜交的序列。應(yīng)當理解，在實施方案的變形中，可以按照對本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見的方式來調(diào)整所用的具體的嚴緊性。應(yīng)當理解，在實施方案中，樣品中的序列相對于對照的升高的水平可以認為指示結(jié)腸直腸癌的存在。在實施方案中，所述方法可以包括檢測至少約I個、2個、3個、4個、5個、6個、7個或8個選自SEQ. ID. NO: 1-7的序列。在具體實施方案中，所述序列可以選自SEQ. ID. NO: 1-3。在具體實施方案中，所述序列可以選自 SEQ. ID. NO: 1-3，或 SEQ. ID. NO:2_7、3-7、4-7、5_7、6 和 7，或 SEQ. ID. NO: I 和 2、1-3、1-4、1-5、1-6、1-5、1-4、1-3或I和2。在其它實施方案中，相關(guān)的序列可以包括SEQ.ID. N0:l、2、3、4、5、6和7中的任意選擇的一個或多個，并且可以包括這些序列的任意組合，并且可以包括或去除這些序列中的任意一個或多個。在可選實施方案中，可以使用試劑盒進行所述方法，并因此在一個實施方案中，公開了用于對生物樣品中的結(jié)腸直腸癌進行診斷或提供預(yù)后的試劑盒，所述試劑盒包含至少2個引物，所述引物適于擴增與SEQ. ID. NO: 1-7中的任一項在至少15個連續(xù)堿基對上具有至少約98%相似性的DNA區(qū)。在實施方案中，所述方法可以包括檢測至少約I個、2個、3個、4個、5個、6個、7個選自SEQ. ID. NO: 1-7的序列。在具體實施方案中，所述序列可以選自 SEQ. ID. NO: 1-3，或 SEQ. ID. NO: 2_7、3-7、4-7、5_7、6 和 7，或 SEQ. ID. NO: I 和 2、1-3、1-4、1-5、1-6、1-5、1-4、1-3或I和2。在其它實施方案中，相關(guān)的序列可以包括SEQ. ID. NO: 1、2、3、4、5、6和7中的任意選擇的一個或多個，并且可以包括這些序列的任意組合，并且可以包括或去除這些序列中的任意一個或多個。在其它實施方案中，在全長度序列上的序列相似性可以為約100%。在實施方案中，所述生物樣品可以是糞便樣品。在本文公開的方法和序列的具體實施方案中，結(jié)腸直腸癌測試的靈敏性為至少約60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%,99%和100%。在本文公開的方法和序列的具體實施方案中，結(jié)腸直腸癌測試的特異性 為至少約 60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 和 100%。在本文公開的方法和序列的具體實施方案中，結(jié)腸直腸癌測試的靈敏性可以為約60%-約 90%、約 60%-約 70%、約 70%-約 80%、約 80%-約 90%、約 90%-約 100%、約 65%-約 75%、約75%-約85%、約85%-約95%或約95%-約100%。在本文公開的方法和序列的具體實施方案中，結(jié)腸直腸癌測試的特異性可以為約60%-約90%、約60%-約70%、約70%-約80%、約80%-約 90%、約 90%-約 100%、約 65%-約 75%、約 75%-約 85%、約 85%-約 95% 或約 95%-約
100% ο在本文公開的方法和序列的具體實施方案中，按照每納克糞便RNA中miRNA的拷貝數(shù)測定的、為確定結(jié)腸直腸癌測試結(jié)果而選擇的截止值可以為至少約5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1100、1200、1300、1400、1500、1600、1700、1800、1900、2000、2100、2200、2300、2400、2500、2600、2700、2800、2900、3000、3500、4000、4500、5000、5500、6000、6500、7000、7500、8000、8500、9000、9500、10000、11000、12000、13000、14000、15000、16000、17000、18000、19000、20000、21000、22000、23000、24000、25000、26000、27000、28000、29000、30000、31000、32000、33000、34000、35000、36000、37000、38000、39000、40000、41000、42000、43000、44000、45000、46000、47000、48000、49000、50000 或可以大于約 60000、70000、80000、90000、100000、200000、300000、400000、500000、600000、700000、800000、900000、1000000。在本文公開的方法和序列的具體實施方案中，按照每納克糞便RNA中miRNA的拷貝數(shù)測定的、為確定結(jié)腸直腸癌測試結(jié)果而選擇的截止值可以小于約5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1100、1200、1300、1400、1500、1600、1700、1800、1900、2000、2100、2200、2300、2400、2500、2600、2700、2800、2900、3000、3500、4000、4500、5000、5500、6000、6500、7000、7500、8000、8500、9000、9500、10000、I1000、12000、13000、14000、15000、16000、17000、18000、19000、20000、21000、22000、23000、24000、25000、26000、27000、28000、29000、30000、31000、32000、33000、34000、35000、36000、37000、38000、39000、40000、41000、42000、43000、44000、45000、46000、47000、48000、49000、50000 或可以小于約 60000、70000、80000、90000、100000、200000、300000、400000、500000、600000、700000、800000、900000、1000000。使用SEQ. ID. NO: 1-7 的 ROC 分析提供在圖 1B、2B、3B、4B、5B、6B 和 7B 中，％ 特異性顯示在X軸，%靈敏性顯示在I軸。同一微RNA的豐度數(shù)據(jù)提供在圖1A、2A、3A、4A、5A、6A和7A，這些圖顯示了每納克總RNA中相關(guān)miRNA的拷貝數(shù)。應(yīng)當注意到，在這些圖中，術(shù)語“CRC”用于指代包含結(jié)腸直腸癌細胞的癌癥，術(shù)語“正?！庇糜谥复鷮φ栈蚍前┑臉悠?。在實施方案中，結(jié)腸直腸癌中SEQ.ID.N0:1、2、3、4、5、6和7(單獨地或共同地)的表達水平可以高于其相鄰正常組織或其它對照組織。在具體實施方案中，在合適的截止水平下，SEQ. ID. N0:l(hsa-miR-135b)對結(jié)腸直腸癌的靈敏性和特異性可以分別高達約74. 1%和70.8%，SEQ. ID. N0:2(hsa-miR-221)對結(jié)腸直腸癌的靈敏性和特異性可以分別為至少約81. 5%和68. 8%，SEQ. ID. NO: 3 (hsa-miR-18a)對結(jié)腸直腸癌的靈敏性和特異性可以分別為至少約70. 4%和77. 1%。當用于結(jié)腸直腸癌的檢測、診斷或預(yù)后時，在合適的截止值下，SEQ. ID. N0:4(has-miR-19a)對結(jié)腸直腸癌的靈敏性可以高達約90%并且特異性可以高達約100% ;在合適的截止值下，SEQ. ID. N0:5(has-miR-223)的靈敏性可以高達約80%并且特異性可以高達約100% ;在合適的截止值下，SEQ. ID. N0:6(has-miR-301a)的靈敏性可以高達約70%并且特異性可以高達約100%并且SEQ. ID. NO: 7 (has-miR-592)的靈敏性可以高達約70%并且特異性可以高達約100%。圖9顯示了對照樣品和包含結(jié)腸直腸癌細胞的樣品的Mann-Whitney比較的P值。同一張圖還給出了 SEQ. ID. NO: 1-7中每一個的AUC(曲線下面積)、截止值、靈敏性和特異性數(shù)據(jù)。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當容易理解到，可以調(diào)整截止值，分析的特異性和靈敏性也會隨之改變。本領(lǐng)域技術(shù)人員能容易地調(diào)整這些參數(shù)以適合具體應(yīng)用和要求。在實施方案中，公開的材料和方法可以用于評價癌癥或與癌癥相關(guān)的其他因素的存在或預(yù)后。所有這些都是本領(lǐng)域技術(shù)人員能容易理解的。
實施例以下實施例舉例說明用于實踐公開的實施方案的主題的材料、方法和操作。應(yīng)當 理解，本文所述的實施例和實施方案僅是舉例說明的目的，并且根據(jù)它們進行的各種改動或變化對于本領(lǐng)域技術(shù)人員是顯而易見的，并且將包括在本申請的實質(zhì)和范圍內(nèi)。方法和材料樣品類別和處理用50ml樣本杯收集新鮮的人糞便樣品，在RNA提取之前貯存在4° C。在排便后3小時內(nèi)提取總RNA。定義了糞便粘稠度的4個類別“堅實的”(糞便具有輪廓清晰的邊緣，在處理時保持其自體的形狀但是受壓時變形)，“柔軟的”(糞便具有均勻的粘稠度，但是自然邊緣較少或較不明顯，保持其自體的形狀但是輕度處理時變形)，“松散的”(糞便具有半固體粘稠度并且能夠接受容器的形狀)，“水樣的”(沒有固體碎塊，完全液態(tài))。僅有“堅實的”、“柔軟的”和“松散的”糞便用于提取總RNA并進一步分析。
微RNA提取將O. 2-0. 3g(濕重)的幾便添加至 2ml 管(Invitrogen , Carlsbad, CA, USA)中的 Iml TriZol LS 試劑。利用無 RNA 酶的杵(USA Scientific , Woodland, CA, USA)將堅實粘稠度的樣品搗勻，以允許其完全變形。將2ml管渦旋30秒以允許糞便樣品在TriZol LS試劑中變得均勻。將300 μ I氯仿添加至2ml管中。將2ml管再渦旋15秒，然后在4° C下12，OOOg離心15分鐘。將上層水相轉(zhuǎn)移至新的2ml管，添加I. 5倍體積的100%乙醇并使用移液管充分混合。將2ml管的全部內(nèi)容物轉(zhuǎn)移至miRNeasy 小型試劑盒(Qiagen ，Valencia, CA，USA)的RNeasy 小型離心柱。按照生產(chǎn)商的說明書進行后續(xù)的總RNA提取。將總 RNA 洗脫在 50 μ I 無核酸酶的水中。利用 Nanodrop 2000 (Thermo Fisher Scientific,Wilmington, DE, USA)測量 RNA 濃度。逆轉(zhuǎn)錄 使用TaqMan 微 RNA 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Applied Biosystems , FosterCity, CA, US)和修改的流程進行逆轉(zhuǎn)錄(RT)。簡言之，在一個RT反應(yīng)中使用6nmole的dNTP (使用dTTP)、2單位逆轉(zhuǎn)錄酶、I. 2單位RNA酶抑制劑、0. 6 μ I RT緩沖液、0. 6 μ I TaqMan 微RNA RT弓丨物和3ng-6ng總RNA，總體積為6 μ I。熱循環(huán)條件如下16° C持續(xù)30分鐘，42° C持續(xù)30分鐘，85° C持續(xù)5分鐘和保持在4° C。將RT產(chǎn)物添加18 μ I無核酸酶的水，以補足24 μ I 的總體積。使用 TaqMan 微 RNA 測定(型號:442797, Applied Biosystems, FosterCity, CA，US)進行特定微RNA的擴增，用于特定miRNA序列(即SEQ. ID. NO: 1-7)的微RNA測定的測定號在圖8中給出。每個試劑盒包含用于特定微RNA的逆轉(zhuǎn)錄的引物和用于該微RNA的qPCR的引物/探針混合物。實時定量PCR使用TaqMan 微 RNA 測定(Applied Biosystems , Foster City, CA, US)和修改的流程進行特定微RNA的實時定量PCR(qPCR)。簡言之，反應(yīng)混合物含有6 μ I TaqMan Universal PCR Master Mix (無 AmpErase UNG) (Applied Biosystems , Foster City, CA,US)，0. 3 μ I微RNATaqManTM測定和2. 4 μ I稀釋的RT產(chǎn)物和3. 3 μ I無核酸酶的水。使用Applied Biosystems 7500 實時 PCR 系統(tǒng)(Applied Biosystems, FosterCity, CA, US)進行實時qPCR。通過使用從已知加入量的合成DNA寡核苷酸(Invitrogen , Carlsbad, CA,USA)的稀釋系列獲得的標準曲線，將Ct值轉(zhuǎn)化為拷貝數(shù)/ng RNA的絕對值。結(jié)果將微RNA用于篩杳結(jié)腸盲腸癌(“CRC”)篩查結(jié)果顯示在圖9中，其中可見，SEQ. ID. NO: 1-7對結(jié)腸直腸癌具有高特異性和敏感性。不同miRNA的ROC曲線的截止值和AUC值以及Man-Whitney U檢驗的P值也在圖9中示出，這指示癌樣品和正常對照之間的差異的顯著性水平。本文提供的實施方案和實施例舉例說明所公開的主題的一般性質(zhì)，而并非限制。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當理解，可以以不脫離公開的主題的實質(zhì)和范圍的各種方式容易地修改和/或調(diào)整這些實施方案以用于不同的應(yīng)用。本文的主題應(yīng)理解為包括但不限于所有備選實施方案和等同物。本文所用的短語、詞語和術(shù)語是說明性質(zhì)的，而并非限制。在法律允許的情況下，通過引用將本文引用的所有參考文獻整體并入本文。應(yīng)當理解，在多種可能的備選實施方案和特征的備選組合中可以將本文公開的不同實施方案的任何方面進行組合，特征的所有不同組合應(yīng)理解為構(gòu)成要求保護的主題的一部分。具體實施方案可以任選地包括公開的任意一種或多種元件，或由公開的任意一種或多種元件組成，或不包括公開的任意 一種或多種兀件。
權(quán)利要求
1.對生物樣品中的結(jié)腸直腸癌細胞進行診斷或提供預(yù)后的方法，所述方法包括檢測所述生物樣品中RNA序列存在的步驟，所述RNA序列在全序列長度上與選自由SEQ.ID. NOS: 1-7構(gòu)成的組的序列至少有約98%相似性，其中所述RNA序列的存在指示所述樣品中結(jié)腸直腸癌細胞的存在。
2.如權(quán)利要求I所述的方法，還包括將所述樣品中所述序列的水平與對照中所述序列的水平進行比較。
3.如權(quán)利要求I所述的方法，其中所述在全序列長度上的相似性為至少約99%。
4.如權(quán)利要求I所述的方法，其中所述在全序列長度上的相似性為約100%。
5.如權(quán)利要求I所述的方法，還包括檢測至少2個所述序列。
6.如權(quán)利要求I所述的方法，還包括檢測至少4個所述序列。
7.如權(quán)利要求I所述的方法，其中所述生物樣品是糞便樣品。
8.如權(quán)利要求I所述的方法，其中所述組由SEQ.ID. N0S:4-7構(gòu)成。
9.如權(quán)利要求I所述的方法，其中所述檢測包括擴增所述序列。
10.對生物樣品中的結(jié)腸直腸癌進行診斷或提供預(yù)后的方法，所述方法包括檢測所述樣品中在高嚴緊性條件下與選自由SEQ. ID. N0S: 1-7構(gòu)成的組的序列雜交的RNA序列，其中所述RNA序列的存在指示所述樣品中結(jié)腸直腸癌細胞的存在。
11.如權(quán)利要求10所述的方法，還包括將所述樣品中所述序列的水平與對照中所述序列的水平進行比較。
12.如權(quán)利要求10所述的方法，還包括檢測至少2個所述序列。
13.如權(quán)利要求12所述的方法，還包括檢測至少4個所述序列。
14.如權(quán)利要求10所述的方法，其中所述樣品是糞便樣品。
15.如權(quán)利要求10所述的方法，其中所述組由SEQ.ID. N0S:4-7構(gòu)成。
16.用于對生物樣品中的結(jié)腸直腸癌細胞進行診斷或提供預(yù)后的試劑盒，所述試劑盒包含 適于逆轉(zhuǎn)錄與SEQ. ID. N0S: 1-7中的任一項在至少15個連續(xù)堿基對上具有至少約98%相似性的RNA的引物。
17.如權(quán)利要求16所述的試劑盒，其中所述在序列全長度上的序列相似性為約100%。
18.如權(quán)利要求16所述的試劑盒，其中所述生物樣品是糞便樣品。
19.如權(quán)利要求16所述的試劑盒，其中 所述逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生DNA序列，并且 所述試劑盒還包含適于擴增所述逆轉(zhuǎn)錄的DNA序列的引物對。
20.用于對生物樣品中的結(jié)腸直腸癌進行診斷或提供預(yù)后的探針，所述探針包括選自SEQ. ID. N0S: 1-7的序列，其中所述序列在高嚴緊性條件下與所述樣品中存在的RNA序列雜交，并且其中所述RNA序列的存在指示所述樣品中結(jié)腸直腸癌細胞的存在。
全文摘要
公開了對生物樣品中的結(jié)腸直腸癌細胞進行診斷或提供預(yù)后的方法，所述方法包括檢測所述生物樣品中RNA序列存在的步驟，所述RNA序列在全序列長度上與選自由SEQ.ID.NOS:1-7構(gòu)成的組的序列至少有約98%相似性，其中所述RNA序列的存在指示所述樣品中結(jié)腸直腸癌細胞的存在。還公開了用于對結(jié)腸直腸癌進行檢測和提供預(yù)后的探針。
文檔編號C12Q1/68GK102985563SQ201180030109
公開日2013年3月20日 申請日期2011年6月22日 優(yōu)先權(quán)日2010年6月23日
發(fā)明者沈祖堯, 于君, 吳宗華 申請人:香港中文大學