專利名稱：基因編碼的光調(diào)控的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及提供有用的籠蔽基團(caging group),及其在位點特異性引入蛋白質(zhì)的方法中的用途及所述方法的用途。
背景技術(shù)：
生物活性化合物可通過使用光可去除的保護基團來保護，改變分子中的重要官能團以阻斷其生物功效。已知保護所述基團的一種方式是籠蔽。通過例如對于系統(tǒng)的照射而去籠蔽，從而去除保護(籠蔽)基團并恢復(fù)分子的本征性質(zhì)。
可通過位點特異性引入籠蔽基團而實現(xiàn)蛋白質(zhì)功能的精確光化學調(diào)控U。化學和酶方法，包括體外翻譯3和化學連接4已經(jīng)用于在體外光籠蔽蛋白質(zhì)。這些方法已經(jīng)被擴展為允許通過透化5或微注射6將籠蔽蛋白引入細胞，但是細胞遞送仍舊存在挑戰(zhàn)。
最近，已經(jīng)對于數(shù)種鄰硝基芐基(ONB)籠蔽形式的氨基酸進行了基因編碼，以使其響應(yīng)琥珀終止密碼子7’8。ONB基團在生理條件下是穩(wěn)定的，但容易在250-365nm的紫外 (UV)光下被去除。
應(yīng)用ONB的不利之處在于，使用紫外光范圍內(nèi)250-365nm的較低部分可用于有效的光解，但該范圍的紫外光對于細胞具有毒性，原因是其導(dǎo)致核酸光反應(yīng)、破壞二硫鍵以及其他細胞損害，這可以在使用單個ONB基團籠蔽賴氨酸時發(fā)生8。
賴氨酸殘基是核定位序列的關(guān)鍵決定子9，是關(guān)鍵的翻譯后修飾(包括泛素化、甲基化以及乙?；?的靶，并且是許多重要酶活性位點中的關(guān)鍵殘基。然而，將ONB籠蔽應(yīng)用至賴氨酸殘基還是不利的，原因是ONB籠蔽賴氨酸殘基的光解產(chǎn)物導(dǎo)致不期望的賴氨酸的氨基縮合。
因此，本領(lǐng)域中存在提供有效的賴氨酸籠蔽分子的問題。還存在提供允許將所述籠蔽分子位點特異性地摻入蛋白質(zhì)中的方法和/或系統(tǒng)的問題。進一步的問題還在于提供產(chǎn)生所述蛋白同時減輕細胞遞送籠蔽蛋白中存在的問題的方法。發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明涉及一種籠蔽賴氨酸分子，其中通過供電子取代基誘導(dǎo)籠蔽基團，以通過使用340nm以上的紫外光照射有效地去籠蔽。
本發(fā)明還涉及在表I的達5個位置具有突變的正交吡咯賴氨酰-tRNA合成酶及由此所產(chǎn)生的正交吡咯賴氨酰-tRNA合成酶/tRNA對，其中所述突變存在于殘基M241、A267、 Y27UL274 以及 C313。
本發(fā)明的另一方面涉及將本發(fā)明的籠蔽賴氨酸摻入真核細胞的蛋白質(zhì)中的體外方法，其中，所述方法包括如下步驟
i)在編碼所述蛋白質(zhì)的核苷酸序列中的所需位點引入琥珀密碼子，或取代編碼所述蛋白質(zhì)的核苷酸序列中的特定密碼子；
ii)將本文所述的表達系統(tǒng)引入細胞；
iii)使用存在于培養(yǎng)基中的本文所述的籠蔽賴氨酸在所述培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述細胞。
本發(fā)明還一方面涉及本發(fā)明的籠蔽賴氨酸在通過340nm以上的紫外光照射測定或改變蛋白質(zhì)的至少一種性質(zhì)中的用途。
本發(fā)明涉及一種籠蔽賴氨酸分子，其中通過供電子取代基誘導(dǎo)籠蔽基團，以通過使用340nm以上的紫外光照射而有效地去籠蔽。合適地，籠蔽基團在355nm以上的紫外光照射下、優(yōu)選365nm的紫外光照射下有效去籠蔽。
合適地，光解副產(chǎn)物不發(fā)生與賴氨酸氨基的縮合。
合適地，籠蔽賴氨酸為式(I)
權(quán)利要求
1.一種籠蔽賴氨酸或其鹽，其中所述籠蔽賴氨酸如式(I)所示。
2.—種多肽,其包含權(quán)利要求I所述的籠蔽賴氨酸。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的多肽，其中所述籠蔽賴氨酸在所述多肽中的位置對應(yīng)于野生型多肽中的賴氨酸殘基的位置。
4.根據(jù)權(quán)利要求2或權(quán)利要求3所述的多肽，所述多肽是三磷酸核苷酸結(jié)合蛋白。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的多肽，所述多肽是激酶。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的多肽，其中，所述籠蔽賴氨酸存在于所述激酶的催化位點。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的多肽，其中所述賴氨酸的去籠蔽使得所述多肽具有激酶活
8.一種制備包含權(quán)利要求I所述的籠蔽賴氨酸的多肽的方法，所述方法包括翻譯編碼所述多肽的RNA，其中所述RNA包含正交密碼子，其中所述翻譯在識別所述正交密碼子并且能夠負載權(quán)利要求I所述的籠蔽賴氨酸的 tRNA的存在下，且在能夠使所述tRNA負載權(quán)利要求I所述的籠蔽賴氨酸的tRNA合成酶的存在下以及在權(quán)利要求I所述的籠蔽賴氨酸的存在下進行。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其中所述tRNA合成酶包括吡咯賴氨酰-tRNA合成酶， 其中相對于野生型序列，所述吡咯賴氨酰-tRNA合成酶在表I的1-5個位置具有突變，其中所述突變存在于對應(yīng)于選自M241、A267、Y271、L274以及C313的1_5個殘基的位置。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其中所述tRNA合成酶包含4個突變，其中所述突變?yōu)?M241F、A267S、Y271C 以及 L274M。
11.根據(jù)權(quán)利要求8至10任一項所述的方法，其中所述正交密碼子為琥珀密碼子 (TAG)。
12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法，其中所述正交tRNA為PyltRNAeuA。
13.—種制備包含權(quán)利要求I所述的籠蔽賴氨酸的多肽的方法，所述方法包括修飾編碼所述多肽的核酸以在對應(yīng)于所述多肽中期望摻入權(quán)利要求I所述的籠蔽賴氨酸的位置的一個或多個相應(yīng)位置提供琥珀密碼子。
14.根據(jù)權(quán)利要求13所述的方法，其中，修飾所述核酸包括將賴氨酸密碼子突變?yōu)殓昝艽a子(TAG)。
15.均一的重組的權(quán)利要求2所述的多肽，其中，所述多肽通過權(quán)利要求8至14任一項所述的方法制備。
16.一種吡咯賴氨酰-tRNA合成酶，其相對于野生型序列在表I的1-5個位置具有突變，其中所述突變存在于對應(yīng)于選自M241、A267、Y271、L274以及C313的1_5個殘基的位
17.根據(jù)權(quán)利要求16所述的正交吡咯賴氨酰-tRNA合成酶，其包含4個突變，其中，所述突變?yōu)?M241F、A267S、Y271C 以及 L274M。
18.一種正交吡咯賴氨酰-tRNA合成酶/tRNA對，其中所述正交吡咯賴氨酰-tRNA合成酶是權(quán)利要求16或17所述的正交吡咯賴氨酰-tRNA合成酶，并且其中所述正交tRNA是 Py It RNAcua。
全文摘要
本發(fā)明涉及籠蔽賴氨酸，其中所述籠蔽賴氨酸為式(I)或其鹽。本發(fā)明還涉及包含籠蔽賴氨酸的多肽及其制備方法。本發(fā)明還涉及能夠使tRNA負載籠蔽賴氨酸的tRNA合成酶。
文檔編號C12N9/10GK102939375SQ201180022081
公開日2013年2月20日 申請日期2011年3月4日 優(yōu)先權(quán)日2010年3月5日
發(fā)明者賈森·欽, 維·P·阮, 阿諾·戈蒂埃, 亞歷山大·戴特斯 申請人:醫(yī)藥研究委員會, 北卡羅來納州大學