專利名稱：乳腺癌骨轉(zhuǎn)移病變前期JAGGED1的mRNA水平原位雜交檢測試劑盒及檢測方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物檢測領(lǐng)域，更具體地說，是涉及與乳腺癌骨轉(zhuǎn)移病理演變mRNA表達改變(病理演變過程)的相關(guān)檢測技木。
背景技術(shù)：
根據(jù)國內(nèi)外權(quán)威機構(gòu)提供的資料，我國毎年癌癥的新增人數(shù)260萬，死亡人數(shù)近 210萬，患者700多萬，全球每年新增癌癥患者800萬，死亡人數(shù)接近800萬，患者約有8400 多萬人，到2020年以上人數(shù)將翻一番，這是ー組可怕的數(shù)字。癌癥診治成本越來越高，按癌癥患者的年治療費用20萬(貧窮地區(qū)可能偏高，發(fā)達地區(qū)可能遠遠高出20萬)，700多萬患者，毎年的花費是1. 4萬億人民幣，扣除成本35%約4千億，每年約有1萬億人民幣白白消耗了。而且，癌癥患者大部分會在治療后不久死亡。因此，現(xiàn)有的臨床癌癥診治模式一定要改變，本發(fā)明的創(chuàng)新點是提前做到預防性篩查，然后及時介入預防性調(diào)控和預防性治療，做到基因水平癌癥的治未病。2005年美國衛(wèi)生研究院、癌癥研究院、疾控中心等八家単位做了ー個年度報告，對 1972年發(fā)起的抗癌大戰(zhàn)進行回顧，報告認為人類在抗癌大戰(zhàn)中是失敗，結(jié)論是癌癥死亡率沒有降低，其列舉出造成抗癌大戰(zhàn)失敗的幾個因素是1.腫瘤細胞異質(zhì)性(多態(tài)性);2.腫瘤細胞耐藥性；3.抗癌藥物設(shè)計思路不完善(動物模型設(shè)計不科學)等。同吋，該報告中亦提出應(yīng)重新審視現(xiàn)有診治癌癥的措施。本發(fā)明人在長期研究中發(fā)現(xiàn)，導致癌癥死亡率不降的重要原因是不能做到真正的早期診斷。依照現(xiàn)有的臨床醫(yī)學影像(B超、CT、核磁共振成像等)及和其它生化(癌抗原、 癌胚抗原、糖類激素、細胞膜因子、細胞核因子、細胞流式技木)指標來診斷癌癥，都是腫瘤形成后診斷，前者要有組織學變化或已有占位性病變，后者大部分是腫瘤形成后所分泌、釋放、或腫瘤的標記物。傳統(tǒng)臨床觀念認為占位性癌塊在2公分下是屬于早期癌癥的診斷，這一概念值得認真討論，2公分以下癌塊屬早期這ー界定科學性是不夠嚴謹?shù)?，從細胞學角度來分析，1公分的腫塊約有一億個腫瘤細胞，2公分的腫塊其三維空間的細胞疊加數(shù)遠不止 2億個腫瘤細胞，從癌變前期到單克隆癌細胞產(chǎn)生及形成2公分的癌塊，其病理演變過程相當長，可能是5年或10年、甚至是10年以上(特殊病例除外)，很難證實的是在這個病理演變過程中，腫塊是癌癥唯一的發(fā)生地和単獨的病灶，可能癌細胞早已遷移到其它組織或器官生長。臨床研究早已證實，一旦形成腫塊的同吋，其它癌細胞通過不同途徑遷移到其它部位克隆生長，一旦切除原發(fā)灶后，其它器官復發(fā)灶或多發(fā)癌塊灶先后形成。因此，在臨床上以 2公分以下的癌腫塊大小來界定早期與否，不夠嚴謹(有些病例，在發(fā)現(xiàn)原發(fā)病灶吋，同時發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)移病灶，不在我們表述的內(nèi)容中)，其實這時已經(jīng)是晚期診斷和晩期治療，這是導致癌癥死亡率不降的真正原因。隨著分子生物技術(shù)日益完善，功能基因組學，癌癥基因組學等研究的深入展開，為了尋求更早期的診斷癌癥、治療癌癥、以及預防癌癥，已取得長足進歩。至今，我們已有可能在基因的一級轉(zhuǎn)錄功能產(chǎn)物(mRNA水平)上做更精確的早期篩查和診斷，在癌變前期或癌細胞形成(單克隆)前，就可以做到早期預測和篩查。本發(fā)明采用核酸原位雜交技木，選擇多組臨床標本(癌癥病人、高危人群、正常對照)，對JAGGED1基因與乳腺癌骨轉(zhuǎn)移的早期預警進行檢測分析。晩期乳腺癌患者體內(nèi)的癌細胞經(jīng)?？梢酝ㄟ^在整個身體內(nèi)部遷移而產(chǎn)生惡性骨腫瘤。普林斯頓大學的科學家通過對ー種名為“Jaggedl”的信號傳導蛋白的研究，發(fā)現(xiàn)了腫瘤細胞如何破壞骨骼的分子機制，從而開啟了可以阻斷這種破壞性過程的藥物治療的大門?！捌駷橹?，針對此類病人我們還沒有太多的治療方法。雖然醫(yī)生能夠控制這些骨癌的癥狀，但是除此之外毫無辦法。根據(jù)臨床資料統(tǒng)計分析大約有70% 80%的晩期乳腺癌患者其乳腺癌轉(zhuǎn)移到骨頭中，此外，它們還可能轉(zhuǎn)移到大腦、肺部和肝臟等部位。在晩期列腺癌、和皮膚癌患者當中，這種轉(zhuǎn)移性骨癌也是非常普遍的。研究表明，乳腺腫瘤細胞通過細胞信號過程能夠給骨細胞錯誤的指令，從而對病人產(chǎn)生致命后果。人體內(nèi)十億細胞必須通過ー系列信號傳導的聯(lián)系才能得以正常發(fā)育并有效地維持正常的生理機能。在運作這一過程的復雜系統(tǒng)當中，細胞信號發(fā)揮著重要的作用，但是對于腫瘤病人而言，信號分子與接收信號的分子之間的聯(lián)系出現(xiàn)了錯誤。在健康人中，溶骨細胞每天會溶解一小部分舊的骨骼，并由成骨細胞合成補充新的骨骼，從而保持骨骼的健康和功能。在骨轉(zhuǎn)移中起破壞性作用的“Jaggedl”信號分子被癌細胞用來激活骨細胞中的Jaggedl信號通路，過度增強了溶骨細胞的破骨功能，同時讓成骨細胞釋放ー種叫IL-6的腫瘤生長因子，從而達到破壞骨骼并促進癌細胞生長的目的。骨骼被溶解過程中釋放出的另ー種稱為TGF-beta的生長因子能夠進一歩促使癌細胞高度表達Jaggedl，最終形成一個惡性循環(huán)。這ー發(fā)現(xiàn)將為癌細胞研究人員提供一個明確的目標，即研究ー種可以抵消Jaggedl的破壞能力以阻止其干擾骨骼正常功能的方法。”這ー研究已受到乳腺癌研究和治療的同行們的廣泛關(guān)注。美國紐約斯隆 凱特林癌癥研究中心(Memorial Sloan-Kettering Cancer Center)乳腺癌研究醫(yī)師Jacqueline Bromberg認為這ー發(fā)現(xiàn)前景光明。她說“骨轉(zhuǎn)移在晩期乳腺癌患者中極為常見，雖然有許多方法例如抑制雌性激素、輻射和化療等方法可以放慢腫瘤的生長，但是目前還是沒有有效的根除癌癥骨轉(zhuǎn)移的治療方法?！泵绹〉诎布{大學醫(yī)學院腫瘤學教授 Theresa Guise認為“這ー發(fā)現(xiàn)充分展示了腫瘤細胞和骨細胞之間的相互作用，其意義非常重大?！弊柚惯@ー破壞性通路是治療轉(zhuǎn)移性骨癌的方法之一，停止這ー過程的關(guān)鍵是必須找到抵消Jaggedl信號分子或其受體Jaddedl的方法。本發(fā)明的實驗研究證明，在乳腺癌原位(無骨轉(zhuǎn)移現(xiàn)象)與乳腺癌伴有骨轉(zhuǎn)移(晩期)及正常對照人群Jaggedl基因的mRNA表達量有明顯不同。將JAGGED1的mRNA作為早期篩查乳腺癌骨轉(zhuǎn)移變前期有非常重要的臨床診斷意義。JAGGED1的mRNA在乳腺癌骨轉(zhuǎn)移變前期及癌變過程中高表達。他作于前列癌變前期篩查、及乳腺癌骨轉(zhuǎn)移術(shù)的復發(fā)、轉(zhuǎn)移預警也有非常重要的臨床意義。發(fā)明人在長期的研究中，得出了ー種新理念，癌癥和其它臨床的重大疾病的臨床診治模式一定要改變，不能只停留現(xiàn)在治已病(發(fā)病后診治)，要做到預防性診治，做到治已病，只有這樣才能降低重大疾病的發(fā)病率和死亡率，降低社會成本和醫(yī)療成本。因此，發(fā)明人在開發(fā)和生產(chǎn)重大疾病的mRNA水平篩查試劑盒及治療藥物中，在理論和技術(shù)上都做了創(chuàng)新。特別是篩選臨床標本(正常人群、癌癥高危人群、腫瘤患者)，突破了正常組織與腫瘤
4組織比較的ー貫性研發(fā)思路，來尋找和開發(fā)癌前變的mRNA水平，與癌癥早期基因病理生理學演變密切相關(guān)，而且臨床意義非常重要靶標，將臨床上腫瘤形成后診治模式變成腫瘤的預防性診治，爭取了腫瘤診治的時間和空間，達到預防癌癥。目前對JAGGED1基因的研究都采用高通量基因芯片和蛋白譜分析技木，而這些方法多用于科研方面，不適應(yīng)臨床應(yīng)用，而檢測mRNA比基因分析更科學(DNA分析大部分在易感性的表象上，mRNA是功能性體現(xiàn))，比蛋白分析更可靠(mRNA與蛋白轉(zhuǎn)錄有時候不同歩)。 根據(jù)現(xiàn)有的文獻資料Jaggedl基因mRNA水平的檢測技術(shù)及試劑盒未見報道。本發(fā)明人在針對創(chuàng)新性發(fā)明的要求，設(shè)計了乳腺癌骨轉(zhuǎn)移患者、高危人群(未婚高齡女性)、正常女性對照不同數(shù)據(jù)例組，用原位雜交技術(shù)進行檢測，結(jié)果表明以上乳腺癌骨轉(zhuǎn)移癥病人JAGGED1基因高表達，高危人群有不同程度表達15-2596，正常女性都是低表達。 表明JAGGED1基因乳腺癌骨轉(zhuǎn)移變前期篩查的重要標志物。原位雜交技術(shù)(in situ hybridization)是將分子生物學與細胞化學技術(shù)結(jié)合起來，以標記的核酸分子為探針，在組織細胞原位檢測特異性核酸分子的技木。其原理是使含有特異序列、經(jīng)過標記的核酸單鏈(即探針)，在適宜條件下與組織細胞中的互補核酸單鏈即靶核酸發(fā)生雜交，再以放射自顯影或免疫細胞化學方法對標記探針進行探測，從而在細胞原位顯示特異的DNA或RNA分子。原位雜交的探針是已知序列的分子或序列未知但分子已知的核酸分子(雖不明確該分子全部序列，但已知其針對何靶分子)，探針的種類按核酸性質(zhì)不同又可分為DNA探針、 cDNA探針、cRNA探針和合成寡核苷酸探針。為了便于示蹤，探針必須用一定的手段加以標記，以利于以后的檢測。常用的標記物包括放射性核素和非放射性標記物兩大類。常用的同位素標記物有$、35S、125I和32P。同位素標記物雖然有靈敏性高、背底較為清晰等優(yōu)點，但是由于放射性同位素對人和環(huán)境均會造成傷害，近來有被非同位素取代的趨勢。非同位素標記物中目前最常用的有生物素、地高辛和熒光素三種。檢測這些標記物的方法都是極其靈敏的。根據(jù)所用探針及所要檢測核酸的不同又可分為DNA-DNA，RNA-DNA，RNA-RNA雜交。 但不論哪ー種形式的雜交，都必須經(jīng)過五大過程，即組織細胞的固定，預雜交、雜交、沖洗和顯示。本發(fā)明采用RNA-RNA的雜交方式，合成的探針(mRNA)和檢測的靶mRNA是采用堿基互補(雜交互補)的原理，同時經(jīng)過長時間研究和觀察，啟動和中止處得殘基對檢測的結(jié)果沒有影響(因為，發(fā)明人采用的mRNA序列都超過600bp以上)。鑒于目前臨床上癌癥的診斷(影像醫(yī)學和生化指標物都是腫瘤形成后的診斷)是晚期診斷，治療也是晩期治療，導致死亡率不降的醫(yī)治模式。本發(fā)明的初衷是想改變目前臨床上重大疾病的診治模式，從治已病變成預防性治未病，達到預防性診治，將目前影像醫(yī)學手段和眾多生化標記物無法檢測到癌前變mRNA水平量化改變技木，做了創(chuàng)新性的技術(shù)突破，提供癌前變mRNA水平篩查技木。使臨床上有了一項新的癌前變mRNA水平真正早期篩查的技木，為臨床癌癥的診治爭取時間和空間。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的首先是提供一種原位雜交檢測試劑盒，其包含原位雜交檢測探針和標記物。
其次，本發(fā)明還要提供上述試劑盒用干與乳腺癌骨轉(zhuǎn)移變前期篩查及術(shù)復發(fā)、轉(zhuǎn)移早期預警相關(guān)的原位雜交檢測方法。為實現(xiàn)本發(fā)明的目的，本發(fā)明的技術(shù)方案如下
本發(fā)明首先提供一種原位雜交檢測試劑盒，其包括雜交探針和標記物，其中，所述的雜交探針如SEQ ID NO. 1所示序列，是JAGGED1基因序列中間一段堿基序列，2000到2800bp， JAGGED 1基因序列號NM_000214，如SEQ ID NO. 2所示序列，JAGGED 1基因的RNA序列的核苷酸序列長度是5988bp，CDS是517. . 417!3bp，位于染色體20pl2. 1-pll. 23〃上。(在探針標記過程中如果基因序列太長，超過IOOObp以上，我們會用CDS的序列來設(shè)計探針，如果CDS 的序列也超過IOOObp以上，會采用基因的中間一段堿基序列來合成探針，堿基序列不少于 500bp，探針合成后要做序列檢測，并對功能進行臨床意義的分析)。本發(fā)明試劑盒的一個優(yōu)選方案是，所述的標記物選自放射性物質(zhì)、化學發(fā)光或顯色物質(zhì)、生物素、金屬鱟、熒光素、酶及納米材料。本發(fā)明試劑盒的一個優(yōu)選方案是還包括雜交液。本發(fā)明試劑盒的一個優(yōu)選方案是還包括增強劑。本發(fā)明試劑盒的一個優(yōu)選方案是還包括顯色劑。本發(fā)明的癌變前期JAGGED1基因篩查試劑盒應(yīng)用價值在干，能在mRNA水平，對乳腺癌骨轉(zhuǎn)移變前期篩查，及癌變后或術(shù)后復發(fā)、轉(zhuǎn)移、擴散發(fā)生預警，進ー步配合臨床治療。本發(fā)明還提供ー種JAGGED1基因原位雜交的檢測方法，包括以下步驟
(1)在上面所述的雜交探針與靶序列可形成穩(wěn)定雜交復合體的條件下，將底物中待測 RNA與雜交探針接觸，形成雜交復合體；和
(2)檢測所述雜交復合體。本發(fā)明所述的檢測方法，其中優(yōu)選地是，所述的可形成穩(wěn)定雜交復合體的條件為 核酸雜交的溫度為42°C ；核酸雜交的時間為16 — 24小吋。本發(fā)明所述的檢測方法，其中優(yōu)選地是，所述的底物選用人的血液白細胞標本或其它器官組織細胞標本。更優(yōu)選地是，所述的血液標本或其它器官組織細胞標本來自乳腺癌骨轉(zhuǎn)移患者、乳腺癌骨轉(zhuǎn)移高危人群、乳腺癌骨轉(zhuǎn)移癥好發(fā)家族、健康女性。本發(fā)明所述的檢測方法，其中優(yōu)選地是，所述的癌癥高危人群、癌癥好發(fā)家族、乳腺癌骨轉(zhuǎn)移患者。本發(fā)明的檢測試劑盒是采用核酸雜交技術(shù)和組化免疫方法相結(jié)合，以JAGGED1基因的一級轉(zhuǎn)錄功能產(chǎn)物mRNA為檢測對象，合成探針是JAGGED1基因的RNA序列，檢測的底物是人體血液標本白細胞或組織細胞的RNA的表達量。原位雜交技術(shù)的顯示方法能提供 JAGGED1基因的半定量或定量表達程度判定。根據(jù)雜交后免疫組化顯色判定以上基因的表達量，正常女性JAGGED1基因低表達，即小量顯色，JAGGED 1基因在乳腺癌骨轉(zhuǎn)移病人和正常女性有顯著差異，該基因的表達量比正常女性表達量都高。本發(fā)明的診斷試劑盒的組份是由雜交探針，雜交液，顯色劑，增效劑等組成。本試劑盒的核酸雜交原理是分子生物學業(yè)內(nèi)人士均熟知，具體操作步驟是標本處理、預雜交、雜交、免疫組化染色、鏡下進行定量分析、結(jié)果報告，其中雜交的具體步驟包括
1).將待測標本放入反應(yīng)槽中；
2).儀器自動棄去液體，自動加消化液；3).儀器自動棄去液體，自動后固定；
4).儀器自動棄去液體，自動預雜交(42°C);
5).儀器自動棄去液體，自動清洗；
6).儀器自動棄去液體，自動雜交(42°C);
7).儀器自動棄去液體，自動清洗；
8).儀器自動棄去液體，自動與DIG抗體培養(yǎng)(室溫)；
9).儀器自動棄去液體，自動清洗，顯色；
10).取出封片鏡檢。本發(fā)明的一個優(yōu)選實施例的方案是以JAGGED1基因為目的基因合成的核酸探針用地高辛標記(地高辛標記的cDNA、RNA和寡核苷酸探針，不但探針的具有生物素標記優(yōu)點，還克服了生物素標記的探針在原位雜交過程中受組織內(nèi)源性生物素干憂等缺點)，將該雜交探針與人體血液白細胞的待測RNA核酸進行雜交，再用免疫組化的方法顯色，在光鏡下觀察mRNA的存在和定位，根據(jù)染色的細胞數(shù)，判斷目的基因的表達量。本發(fā)明方法是目前常用的核酸原位雜交技木，該方法通過檢測底物細胞中的 JAGGED1基因表達量，用來確定乳腺癌骨轉(zhuǎn)移病理演變前期的mRNA變化量，預警乳腺癌骨轉(zhuǎn)移變是否發(fā)生及乳腺癌骨轉(zhuǎn)移患者術(shù)后是否復發(fā)、轉(zhuǎn)移的預測。因為JAGGED1基因在正常女性中低表達，如果JAGGED1基因表達量高，說明有癌變骨轉(zhuǎn)移的風險，說明癌細胞骨轉(zhuǎn)移已發(fā)生，或癌癥病人術(shù)后已經(jīng)復發(fā)、轉(zhuǎn)移，從而獲得癌癥的診斷信息。一個試劑盒可以多人份使用或一人份使用。本發(fā)明具有如下有益效果
本發(fā)明的臨床意義是更早期跟蹤檢測乳腺癌骨轉(zhuǎn)移變發(fā)生和病理演變過程中JAGGED1 基因mRNA表達量的變化，預警乳腺癌骨轉(zhuǎn)移發(fā)生、發(fā)展趨勢。本發(fā)明的診斷試劑盒與臨床上其它檢測與癌癥標志物，以及影像醫(yī)學檢查有顯著不同。本發(fā)明可以在基因轉(zhuǎn)錄的ー級功能產(chǎn)物mRNA水平檢測JAGGED1基因異常表達，在影像醫(yī)學檢查未發(fā)現(xiàn)占位性癌病灶復發(fā)之前，癌癥生化指標未產(chǎn)生異常之前，亦未形成腫瘤之前，能及早做到以上基因表達異常的信息采集，給臨床乳腺癌病患ー個真正的早期骨轉(zhuǎn)移預警以及治療后轉(zhuǎn)移復發(fā)及早預測。 這樣才有可能實施癌癥的早期篩查、早期預防、早期治療，有可能從源頭上徹底根治乳腺癌骨轉(zhuǎn)移惡疾。此外，本發(fā)明提供的試劑盒具有靈敏度高、特異性強的特點，同吋，本發(fā)明的檢測方法操作方便、簡單，能在區(qū)級以上醫(yī)院普遍使用和推廣。


圖1是本發(fā)明JAGGED 1基因原位雜交技術(shù)流程圖。圖2是本發(fā)明實施例中乳腺癌骨轉(zhuǎn)移病人JAGGED1表達降低圖片。圖3是高危人群圖片。圖4是本發(fā)明實施例中正常人JAGGED 1表達圖片。
具體實施例方式下面結(jié)合實施例，更具體地說明本發(fā)明的內(nèi)容。應(yīng)該理解，下面的實施例用于說明而非限定本發(fā)明內(nèi)容，任何形式上的改變或變通將落入本發(fā)明的保護范圍。實施例1
按照常規(guī)方法制備本實施例的原位雜交試劑盒，該試劑盒包括以JAGGED1基因為檢測目的基因設(shè)計的雜交探針、標記物、說明書，其中 本實施例的探針標記物選用地高辛。試劑盒雜交液組成
配制試劑使用濃度
1).將IOX緩沖液I用三蒸水按1:10稀釋成IX緩沖液I；
2).將20X緩沖液II用三蒸水按1:10稀釋成2 X緩沖液II ；
按1:100稀釋成0.2X緩沖液II ；按1:200稀釋成0. IX緩沖液II ；
3).將10X緩沖液III用三蒸水按1 10稀釋成1X緩沖液III ；
4).IOX緩沖液IV用三蒸水按1:10稀釋成X緩沖液IV (取1#，2#，3#各10!11レ加水至IOOmL即可)。 實施例2
應(yīng)用核酸原位雜交檢測方法對各組血液標本JAGGED1基因表達量的實施過程
1).取待測標本兩張；
2).在玻璃缸里加入消化液(消化液100μ L加IX緩沖液I 99. 9ml，即為使用濃度)50 ml，37°C水浴預熱lOmin，放進16張玻片，37°C處理12 min,再用IX緩沖液I洗5min ；
3).用O. 2 %的保護液(保護液1 m 1加1 X緩沖液
I ’ 99ml即為使用濃度)洗lOmin，三蒸水洗5min(以上過程都在玻璃缸進行)，取出玻片， 讓其自然干燥；
4).將玻片放入保濕盒內(nèi)，加預雜交液25μ L/片(加在有細胞的地方)，蓋上蓋玻片， 蓋緊保濕盒，放在42°C恒溫水浴箱中汕以上；
5).取出玻片，棄去蓋玻片，將玻片放入玻璃缸內(nèi)，用70%、90%、95%的乙醇各洗aiiin， 取出，自然干燥；
6).將玻片放入保濕盒內(nèi)，一張加正義雜交液25μ L/片，另一張加反義雜交液25 μ L/ 片，蓋上蓋玻片，蓋緊保濕盒，放在42°C恒溫水浴箱中16-24h ；
7).取出玻片，棄去蓋玻片，將玻片放入玻璃缸內(nèi)在42°C恒溫水浴箱中用2X緩沖液II洗兩次，毎次15min ； 在42°C恒溫水浴箱中用0. 2X緩沖液II洗一次，毎次15min ； 在42°C恒溫水浴箱中用0. IX緩沖液II洗兩次，毎次15min ；
8).用IX緩沖液III洗30s，取出玻片，自然干燥；
9)·將玻片放入保濕盒內(nèi)，加0. 5%封閉液(Iml封閉液加5ml 1 X緩沖液III) 100 μ L/ 片，蓋緊保濕盒，在室溫下作用30min。(此步驟不需加蓋玻片)；
10).取出玻片，用IX緩沖液III洗30s，自然干燥；
11).將玻片放入保濕盒內(nèi)，加X-AP抗體(取一管堿性磷酸酶抗體，向其中加入1.8ml 1 χ緩沖液III) 100 μ L/片，蓋緊保濕盒在室溫下作用30min，時間不能過長，否則會產(chǎn)生假陽性(此步驟不需加蓋玻片)；
12).取出玻片，用IX緩沖液III洗3次，毎次15min;
13).用IX緩沖液IV洗anin，加顯色劑(顯色劑A73.3yL，顯色劑B157. 5yL加到 30mL IX緩沖液IV中，混勻)，室溫避光16h到18h以上；
14).用三蒸水洗5min，自然干燥，(用甘油加10%的IX緩沖液I混勻)封片鏡檢。本發(fā)明的核酸原位雜交檢測方法將目的基因用地高辛標記，成為RNA核酸探針， 將探針與人體白細胞的待測RNA核酸進行雜交，再用免疫組化的方法顯色，因此在光鏡下觀察mRNA的存在和定位，根據(jù)染色的細胞數(shù)，判斷目的基因的表達量。乳腺癌骨轉(zhuǎn)移病人20名，高危(未婚高齡女性)20名，正常對照組20名。抽所有待檢人的外周血3-5毫升(分離白細胞)做原位雜交。結(jié)果表示，所有癌癥患者JAGGED1基因表達量高，細胞深染；高危人群表達稍降低，小數(shù)染色；正常對照組JAGGED1基因表達量低， 細胞多數(shù)不染色，具體結(jié)果見圖2、圖3、圖4。
權(quán)利要求
1.ー種原位雜交檢測試劑盒，包括雜交探針和標記物，其特征在干，所述的雜交探針為序列表SEQ ID NO. 1所示的序列。
2.如權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在干，所述的標記物選自放射性物質(zhì)、化學發(fā)光或顯色物質(zhì)、生物素、金屬鱟、熒光素、酶及納米材料。
3.如權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在干，該試劑盒還包括雜交液。
4.如權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在干，該試劑盒還包括增效劑。
5.如權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在干，該試劑盒還包括顯色劑。
6.ー種JAGGED1基因原位雜交檢測方法，其特征在于，該方法包括以下步驟(1)在權(quán)利要求1所述的雜交探針與靶序列可形成穩(wěn)定雜交復合體的條件下，將底物中待測RNA與雜交探針接觸，形成雜交復合體；和(2)檢測所述雜交復合體。
7.如權(quán)利要求6所述的檢測方法，其特征在干，所述的可形成穩(wěn)定雜交復合體的條件為核酸雜交的溫度為42°C ；核酸雜交的時間為16 — 24小吋。
8.如權(quán)利要求6所述的檢測方法，其特征在干，所述的底物選用人的血液白細胞標本。
9.如權(quán)利要求8所述的檢測方法，其特征在干，所述的血液白細胞標本選自癌癥、高危人群、正常人標本。
10.JAGGED1基因在制備檢測乳腺癌骨轉(zhuǎn)移病變試劑盒中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開一種原位雜交檢測試劑盒，包括雜交探針和標記物。還公開使用本試劑盒原位雜交檢測與乳腺癌骨轉(zhuǎn)移早期病理演變有密切相關(guān)的信號傳導蛋白(Jagged1)基因與的mRNA方法，包括以下步驟(1)在雜交探針與靶序列可形成穩(wěn)定雜交復合體的條件下，將底物中待測RNA與雜交探針接觸，形成雜交復合體；和(2)檢測所述雜交復合體。本發(fā)明的試劑盒和檢測方法可在mRNA水平上檢測JAGGED1基因的表達量，比影像醫(yī)學和現(xiàn)有的臨床生化檢測指標更早期，能實現(xiàn)真正的癌變前期mRNA水平篩查，同時，本發(fā)明的檢測方法簡單方便，成本低,便于縣區(qū)級醫(yī)院推廣應(yīng)用。
文檔編號C12Q1/68GK102559887SQ20111044389
公開日2012年7月11日 申請日期2011年12月27日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月27日
發(fā)明者張云福, 張玉麗, 裘建英, 裘霖 申請人:芮屈生物技術(shù)(上海)有限公司