專利名稱：：一種利用光能生產(chǎn)乙醇的微生物的制作方法
技術領域：
：本發(fā)明涉及可再生能源和生物
技術領域：
。具體涉及一種經(jīng)過基因工程修飾后可通過光合作用高效生產(chǎn)乙醇的微生物，以及所述基因工程修飾微生物的方法和運用此基因工程微生物制備乙醇的方法。
背景技術：
：石化能源為國民經(jīng)濟與社會發(fā)展的重要物質(zhì)基礎，但石化能源具有稀缺性和不可再生性，隨著時間的推移，其價格必將因儲量的減少和開采量的下降而上漲。此外，電力行業(yè)高度依賴煤炭資源，是造成威脅著電力供應的“煤炭矛盾”長期存在的根本原因之一。因此，可再生能源具有長遠的發(fā)展?jié)摿蛷V闊的市場前景?？稍偕茉串a(chǎn)業(yè)的發(fā)展必然對相關產(chǎn)業(yè)的發(fā)展起到帶動作用，這將使我國的國民經(jīng)濟結構更加合理。目前的液體生物燃料主要有生物燃料乙醇和生物柴油。然而，生物燃料的快速發(fā)展面臨著糧食安全和土地淡水資源緊缺問題?，F(xiàn)有技術通過燃料乙醇產(chǎn)業(yè)作為替代能源，但是，隨著燃料乙醇產(chǎn)量增加，糧食供給短缺和價格上漲導致以糧食為原料的生物能源產(chǎn)業(yè)不能持續(xù)性發(fā)展。近幾年大力發(fā)展的非糧燃料乙醇和生物質(zhì)發(fā)電產(chǎn)業(yè)同樣受到客觀條件的制約，難以滿足大規(guī)模替代化石燃料的規(guī)模和成本要求。以木薯、甜高粱、纖維素為原料的燃料乙醇產(chǎn)業(yè)從本質(zhì)上說是以種植業(yè)為基礎的，需要大規(guī)模投入可耕地、淡水、化肥以獲得較高產(chǎn)量，而這些資源均為稀缺資源，用于替代化石能源將對整體資源環(huán)境造成巨大壓力。因此，迫切需要開發(fā)不占用可耕地、淡水、化肥資源的新型生物能源技術，為可再生能源產(chǎn)業(yè)發(fā)展提供具備現(xiàn)實可行性的手段，切實有效減少二氧化碳排放，替代化石能源使用，促進基于化石能源的傳統(tǒng)工業(yè)體系向基于可再生能源的綠色工業(yè)體系轉(zhuǎn)化。對微生物進行基因工程改造來生產(chǎn)能源是能源產(chǎn)業(yè)中的一個發(fā)展方向。但現(xiàn)有技術中，工業(yè)上主要是利用具有乙醇代謝途徑的異養(yǎng)微生物，例如酵母和大腸桿菌等。藍藻是一種自養(yǎng)微生物，是目前地球上最廣泛的生物體。藍藻是單細胞生物，沒有細胞核，但細胞中央含有核物質(zhì)，通常呈顆粒狀或網(wǎng)狀，染色質(zhì)和色素均勻的分布在細胞質(zhì)中。藍藻的細胞質(zhì)中都有內(nèi)膜系統(tǒng)，可以進行光合作用，產(chǎn)生自己所需要的物質(zhì)，即可以自養(yǎng)。但是，自然存在的光合細菌藍藻通常不能利用陽光和二氧化碳合成乙醇，僅在避光和無氧條件下通過發(fā)酵產(chǎn)生少量乙醇。本領域已知生產(chǎn)乙醇的微生物(例如大腸桿菌，酵母菌，運動發(fā)酵單細胞菌等)中存在乙醇生產(chǎn)的代謝途徑。已知的乙醇生產(chǎn)代謝途徑是從糖酵解途徑的丙酮酸經(jīng)過乙醛再到末端代謝產(chǎn)物乙醇，其中丙酮酸到乙醛的反應過程由丙酮酸脫羧酶(pyruvatedecarboxylase,PDC)催化，乙醒到乙醇的反應過程由乙醇脫氫酶(alcoholdehydrogenase,ADH)催化控制。藍藻的基因組中不存在丙酮酸脫羧酶基因，因而不具有產(chǎn)生乙醇的能力。本發(fā)明提供了一種利用基因工程藍藻生產(chǎn)乙醇的方法，經(jīng)過對野生藍藻的改造，從而使得藍藻能夠直接利用太陽光和二氧化碳生產(chǎn)乙醇。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明以藍藻為宿主，將外源乙醇代謝途徑的丙酮酸脫羧酶基因和乙醇脫氫酶基因?qū)胨{藻，形成具有穩(wěn)定遺傳性狀和較高乙醇產(chǎn)率的基因工程菌株，使得改造的藍藻菌株能夠利用陽光、水和二氧化碳生產(chǎn)乙醇。本發(fā)明還提供了基因工程藍藻通過光合作用利用陽光、水和二氧化碳制備乙醇的方法。本發(fā)明提供了一種利用光合作用生產(chǎn)乙醇的基因工程藍藻，其含有整合到染色體上的外源丙酮酸脫羧酶基因和乙醇脫氫酶基因。外源丙酮酸脫羧酶基因和乙醇脫氫酶基因在藍藻細胞內(nèi)編碼具有丙酮酸脫羧酶活性和乙醇脫氫酶活性的蛋白。本發(fā)明使用的宿主是藍藻，其可以是集胞藻(Synechocystis)、隱球藻屬(Aphanocaps)、魚腥藻屬(Anobaena)、念珠藻屬(Nostoc)、顫藻屬(Oscillatoria)、聚球藻屬(Synechococcus)、球藻屬(Gloeocapsa)、阿格藻屬(Agmmenellumm)、雙歧藻屬(Scytonema)或鞭枝藻屬(Mastigocladus)。本發(fā)明的藍藻優(yōu)選為集胞藻(Synechocystissp.)。在本發(fā)明的一個方面，采用的宿主是集胞藻PCC6803。本發(fā)明的基因工程藍藻含有整合到染色體上的編碼丙酮酸脫羧酶和乙醇脫氫酶的核酸。丙酮酸脫羧酶(pyruvatedecarboxylase,PDC)廣泛存在于豆類植物、麻黃等植物、釀酒酵母屬(Saccharomycesspecies)、曲霉屬等真菌中，另外運動單胞菌(Zymomonasmobilis)、醋桿菌屬(Acetobacterspecies)中也都含有丙酮酸脫羧酶。不同來源的丙酮酸脫羧酶，其編碼序列和活性有所不同。已經(jīng)對各種來源的丙酮酸脫羧酶進行了測序和活性研究，發(fā)現(xiàn)不同來源的丙酮酸脫羧酶的序列有所區(qū)別，但也具有很多保守的區(qū)域和活性位點。其中，如Genebank報道的，運動單胞菌的丙酮酸脫羧酶具有如SEQIDNO.1的氨基酸序列，其基因pdc具有如SEQIDNO.2的核酸序列。不同來源的丙酮酸脫羧酶的序列有所區(qū)別，但都具有對應于SEQIDNO.1的氨基酸序列，其中存在保守序列和活性位點。乙醇脫氫酶(alcoholdehydrogenase,ADH)大量存在于人和動物肝臟、植物及微生物細胞之中，是一種含鋅金屬酶，具有廣泛的底物特異性，其分子由兩個亞基組成，其中一個位于酶的活性中心，另一個起穩(wěn)定四級結構的作用。乙醇脫氫酶夠以煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(MD)為輔酶，催化伯醇和醛之間的可逆反應CH3CH20H+NAD+—CH3CH0+NADH+H+。在人和哺乳動物體內(nèi)，乙醇脫氫酶與乙醛脫氫酶(ALDH)構成了乙醇脫氫酶系，參與體內(nèi)乙醇代謝。酵母和細菌(乳酸菌，以及某些條件下的大腸桿菌除外)不將葡萄糖發(fā)酵為乳酸，而是將葡萄糖發(fā)酵為乙醇和二氧化碳?？偡磻綖镚lucose+2ADP+2Pi—2ethanol+2C02+2ATP+2H20。在酵母和許多細菌中，乙醇脫氫酶在發(fā)酵起著重要作用從糖酵解產(chǎn)生的丙酮酸轉(zhuǎn)化為乙醛和二氧化碳，隨后乙醛在ADHI的作用下轉(zhuǎn)化為乙醇。后一步的目的是重新產(chǎn)生NAD+，于是糖酵解的能量生成得以繼續(xù)。不同來源的乙醇脫氫酶，其編碼序列和活性有所不同。已經(jīng)對各種來源的乙醇脫氫酶進行了測序和活性研究，發(fā)現(xiàn)不同來源的乙醇脫氫酶的序列和活性有所區(qū)別。其中，如Genebank報道的，聚球藻的其中一種乙醇脫氫酶ADHB具有如SEQIDNO.3的氨基酸序列，其基因adhB具有如SEQIDNO.4的核酸序列。不同來源的乙醇脫氫酶的序列有所區(qū)別，但可具有對應于SEQIDNO.3的氨基酸序列，其中存在保守序列和活性位點。根據(jù)生物學理論知識，生物的蛋白的氨基酸序列會發(fā)生變異，所述蛋白的變異通常是由編碼該蛋白的基因的突變造成基因的突變可以是自發(fā)。現(xiàn)代基因工程技術令有目的的點突變變成可能。點突變法可經(jīng)由設計好的寡核苷酸，在任何一個基因片段上對某個核酸或多個核酸進行設計好的突變，例如通過聚合酶鏈式反應(PCR)等方法向目的DNA片段(可以是基因組，也可以是質(zhì)粒)中引入所需變化(通常是表征有利方向的變化)，包括堿基的添加、刪除、點突變等。定點突變能迅速、高效的提高DNA所表達的目的蛋白的性狀及表征，成為基因研究工作或產(chǎn)業(yè)開發(fā)中一種非常有用的手段。氨基酸蛋白質(zhì)是生物體內(nèi)重要的活性分子，例如催化各種生理生化反應的酶。氨基酸是蛋白質(zhì)的基本成分。氨基酸在結構上的差別受側鏈基團R的影響。通常根據(jù)R基團的化學結構或性質(zhì)可將20種氨基酸分為非極性氨基酸和極性氨基酸。非極性氨基酸又稱疏水氨基酸，包括丙氨酸(Ala)、纈氨酸(Val)、亮氨酸(Leu)、異亮氨酸(He)、脯氨酸(Pro)、苯丙氨酸(Phe)、色氨酸(Trp)、蛋氨酸(Met)。本發(fā)明提供了一種利用光合作用生產(chǎn)乙醇的基因工程藍藻，其含有整合到染色體上的外源基因，所述外源基因為丙酮酸脫羧酶基因和乙醇脫氫酶基因，其中所述丙酮酸脫羧酶基因編碼的丙酮酸脫羧酶具有對應于SEQIDNO.1的氨基酸序列，并且其中自N端第290位的蘇氨酸Thr具有突變，以及所述乙醇脫氫酶基因編碼的乙醇脫氫酶具有對應于SEQIDNO.3的氨基酸序列。在本發(fā)明的一個方面，本發(fā)明的基因工程藍藻染色體整合的丙酮酸脫羧酶基因編碼的丙酮酸脫羧酶具有(I)對應于SEQIDNO.1的氨基酸序列，并且其中自N端第290位的蘇氨酸Thr具有突變，或(2)在上述氨基酸序列中還引入了一個或幾個氨基酸的取代、缺失、插入、增加或倒位后所得的氨基酸序列，并具有丙酮酸脫羧酶的活性。在本發(fā)明的一個方面，本發(fā)明的基因工程藍藻染色體整合的乙醇脫氫酶基因編碼的乙醇脫氫酶具有(I)對應于SEQIDNO.3的氨基酸序列，或(2)在上述氨基酸序列中還引入了一個或幾個氨基酸的取代、缺失、插入、增加或倒位后所得的氨基酸序列，并具有丙酮酸脫羧酶的活性。在本發(fā)明的一個方面，在上述本發(fā)明的基因工程藍藻中表達的丙酮酸脫羧酶中第290位的蘇氨酸Thr突變?yōu)槔野彼?Tyr)、半胱氨酸(Cys)、甘氨酸(Gly)、絲氨酸(Ser)、天冬酰胺(Asn)或谷氨酰胺(Gln)。在本發(fā)明的一個方面，上述第290位的蘇氨酸Thr突變?yōu)槔野彼?Tyr)。在本發(fā)明的一個方面，上述第290位的蘇氨酸Thr突變?yōu)樘於０?Asn)。在本發(fā)明的一個方面，上述第290位的蘇氨酸Thr突變?yōu)楦拾彼?Gly)。在本發(fā)明的一個方面，上述第290位的蘇氨酸Thr突變?yōu)榻z氨酸(Ser)。氨基酸是由多核苷酸編碼的。多核苷酸中的信使RNA鏈上決定一個氨基酸的相鄰的三個堿基叫做一個“密碼子”，亦稱三聯(lián)體密碼。具體的，其中幾個氨基酸的密碼子如下蘇氨酸(Thr):ACU，ACC,ACA,ACG；半胱氨酸(Cys)UGU,UGC；甘氨酸(Gly)GGU,GGC,GGA,GGG；絲氨酸(Ser):UCU，UCC,UCA，UCG；天門冬酰胺(Asn)AAU,AAC；谷氨酰胺(Gln):Ckk，CAG。在本發(fā)明的一個方面，所述基因工程藍藻帶有的所述丙酮酸脫羧酶基因具有SEQIDNO.2的堿基序列的多核苷酸，并且其中編碼對應于SEQIDNO.1氨基酸序列中自N端第290位的酪氨酸(Tyr)的堿基序列由TAC改變?yōu)榫幋a蘇氨酸(Thr)、半胱氨酸(Cys)、甘氨酸(Gly)、絲氨酸(Ser)、天冬酰胺(Asn)或谷氨酰胺(Gln)的堿基序列。在本發(fā)明的一個方面，其中所述編碼對應于SEQIDNO.1氨基酸序列中自N端第290位的蘇氨酸的堿基序列由TAC替換為ACC、ACA、ACT或ACG，優(yōu)選替換為ACC。在本發(fā)明的又一個方面，所述基因工程藍藻帶有的所述丙酮酸脫羧酶基因具有與上述堿基序列或其互補堿基序列組成的多核苷酸在嚴格條件下雜交的多核苷酸。在本發(fā)明的一個方面，基因工程藍藻帶有的所述外源乙醇脫氫酶基因具有SEQIDNO.4的堿基序列的多核苷酸，或是與SEQIDNO.4的堿基序列或其互補堿基序列組成的多核苷酸在嚴格條件下雜交的多核苷酸。在本發(fā)明的一個方面，本發(fā)明的基因工程藍藻中所述丙酮酸脫羧酶基因選自來源于運動發(fā)酵單胞菌、酵母、藍藻和大腸桿菌的丙酮酸脫羧酶基因，優(yōu)選來源于運動發(fā)酵單胞菌。在本發(fā)明的一個方面，本發(fā)明的基因工程藍藻中所述乙醇脫氫酶基因選自來源于運動發(fā)酵單胞菌、酵母、藍藻、嗜熱醋酸菌、綠屈撓菌、聚球藻的乙醇脫氫酶基因，優(yōu)選來源于聚球藻。在本發(fā)明的一個方面，本發(fā)明的基因工程藍藻中含有整合到染色體上的外源丙酮酸脫羧酶基因和外源乙醇脫氫酶基因，所述外源丙酮酸脫羧酶基因選自來源于運動發(fā)酵單胞菌，并且所述外源乙醇脫氫酶來源于聚球藻。在本發(fā)明的一個方面，基因工程藍藻帶有的所述外源乙醇脫氫酶基因具有SEQIDNO.4的堿基序列的多核苷酸，或是與SEQIDNO.4的堿基序列或其互補堿基序列組成的多核苷酸在嚴格條件下雜交的多核苷酸。在本發(fā)明的一個方面，基因工程藍藻的染色體上還整合有表達所述丙酮酸脫羧酶和乙醇脫氫酶所需的啟動子，所述啟動子與丙酮酸脫羧酶和乙醇脫氫酶可操作地連接。本發(fā)明對藍藻進行的基因修飾是通過引入外源基因?qū)崿F(xiàn)的。引入外源基因是通過制備構建體和轉(zhuǎn)化到藍藻細胞中，并進一步整合到藍藻的染色體。制備的構建體包含至少一種調(diào)控序列，優(yōu)選的調(diào)控序列是啟動子。啟動子是基因調(diào)控中普遍存在的順式作用元件，是RNA聚合酶能夠識別并與之結合而起始基因轉(zhuǎn)錄的一段DNA序列，通常位于基因5’端上游。它能決定轉(zhuǎn)錄的方向和效率，以及RNA聚合酶類型，并引導RNA聚合酶與模板的正確結合。啟動子是基因表達調(diào)控的重要元件，它與RNA聚合酶及其他反式作用因子的相互作用是通過基因轉(zhuǎn)錄實施基因調(diào)控轉(zhuǎn)錄的關鍵。在本發(fā)明中，對藍藻進行的基因修飾包括導入表達丙酮酸脫羧酶和乙醇脫氫酶所需啟動子，并整合到藍藻染色體上。所述啟動子與丙酮酸脫羧酶和乙醇脫氫酶可操作地連接。多種啟動子可用于本發(fā)明的構建體，可根據(jù)所需結果來選擇啟動子，并且可包括用于在藍藻中表達的組成型啟動子、細胞特異性啟動子、誘導型啟動子或其他啟動子。在本發(fā)明的一個方面，本發(fā)明使用的所述啟動子為來源于藻類的PrbC(ribUl0Se-l，5-bisphosphatecarboxylase,rbc)啟動子、表達基因光誘導啟動子、硝酸鹽誘導啟動子或溫度誘導啟動子。啟動子Prbc是藍細菌體內(nèi)的強啟動子，具備在藍細菌體內(nèi)高效表達基因的能力，被成功應用在多種藍細菌菌株中。另一種光誘導啟動子PsbA位于藍藻光系統(tǒng)蛋白psbA上游。光誘導啟動子在藍藻光合作用和細胞代謝的研究中作為表達外源基因的強啟動子使用。硝酸鹽啟動子位于硝酸鹽還原酶(nitratereductase,NR)上游。硝酸鹽還原酶NR是一種誘導酶，硝酸鹽對NR的活性有明顯誘導作用，而銨則能抑制NR的表達，因此NR的啟動子已經(jīng)成為轉(zhuǎn)基因研究中比較理想的可控性啟動子。本領域的研究發(fā)現(xiàn)NR啟動子來驅(qū)動外源基因表達，顯示了其具有可誘導性和高效性表達的特點，在藻類基因工程研究中應用廣泛。熱誘導啟動子PgroESL位于藍藻熱休克基因groESL上游。由于groESL啟動子具高效性，人們一直試圖利用其提高宿主細胞中外源基因的表達水平。優(yōu)選的，本發(fā)明采用了Prbc啟動子。在本發(fā)明的一個方面，本發(fā)明的基因工程藍藻產(chǎn)生的乙醇由細胞中擴散到培養(yǎng)液中。本發(fā)明的基因工程藍藻的培養(yǎng)液中，溶液中乙醇濃度達到O.lg/L，優(yōu)選的，達到O.5g/L，更優(yōu)選的，達到1.5到5g/L。在本發(fā)明的一個方面，本發(fā)明的基因工程藍藻保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏時間為2011年12月02日，其保藏號為CGMCCNo.5533。在本發(fā)明的一個方面，本發(fā)明提供了制備上述基因工程藍藻的方法，其包括將外源丙酮酸脫羧酶基因和乙醇脫氫酶基因，以及表達所述外源丙酮酸脫羧酶和/或乙醇脫氫酶所需啟動子導入藍藻，并整合到藍藻染色體上。本發(fā)明的制備基因工程藻類包括以下主要步驟。通過PCT或合成的方法獲得目的基因或目的核苷酸片段，包外源丙酮酸脫羧酶基因、啟動子和/或抗性標記基因等核苷酸片段。將帶有目的基因的DNA片段連接到能夠獨立復制并具有選擇標記的載體上，如質(zhì)粒、噬菌體和病毒等，以形成重組DNA分子。DNA片斷與載體的連接方式主要有同聚末端連接、粘性末端連接、平齊末端連接及人工接頭分子連接。重組DNA必須進入宿主細胞DNA中，才能得到擴增和表達。根據(jù)載體的性質(zhì)不同，可采用轉(zhuǎn)染、轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)導等方式，將重組DNA分子導入宿主細胞內(nèi)，并使其大量繁殖。應用于藍藻遺傳轉(zhuǎn)化的供體DNA大體可分為三類第一類是直接利用未修飾的外源質(zhì)粒，可將外源DNA導入藍藻。第二類是利用自身染色體或基因組，通過同源重組作為插入突變的有效方法。第三類是使用穿梭載體。穿梭質(zhì)?？梢院兴{藻質(zhì)粒復制起點，能夠以復制子形式獨立存在。穿梭質(zhì)粒還可以帶有與藍藻基因組相同的序列，從而在進入藍藻后與發(fā)生染色體同源重組，從而穩(wěn)定存在和表達。在本發(fā)明的一個方面，本發(fā)明提供了通過培養(yǎng)上述基因工程藍藻制備乙醇的方法。經(jīng)過上述基因工程的改造，本發(fā)明的藍藻的細胞內(nèi)能夠有效地表達具備了催化丙酮酸到乙醛的反應活性的丙酮酸脫羧酶，從而能夠利用陽光、水和二氧化碳生產(chǎn)乙醇。本發(fā)明的基因工程藍藻在含有碳源(例如二氧化碳)的培養(yǎng)液中，在光照條件下進行繁殖和光反應，產(chǎn)生乙醇，然后進行分離、收集和提純，例如采取傳統(tǒng)蒸餾和氣提等工藝。本發(fā)明中的外源基因是通過載體導入藍藻的，所述載體包括(a)核酸，其包含丙酮酸脫羧酶基因和乙醇脫氫酶基因，其中所述丙酮酸脫羧酶基因編碼的丙酮酸脫羧酶具有(I)對應于SEQIDNOI的氨基酸序列，并且其中自N端第290位的蘇氨酸Thr具有突變，或(2)在上述氨基酸序列中還引入了一個或幾個氨基酸的取代、缺失、插入、增加或倒位后所得的氨基酸序列，并具有丙酮酸脫羧酶的活性；以及，其中所述乙醇脫氫酶基因編碼的乙醇脫氫酶具有(I)對應于SEQIDNO3的氨基酸序列；或(2)在上述氨基酸序列中引入了一個或幾個氨基酸的取代、缺失、插入、增加或倒位后所得的氨基酸序列，并具有乙醇脫氫酶的活性。和(b)啟動子，所述啟動子與所述丙酮酸脫羧酶和乙醇脫氫酶基因可操作地連接。在本發(fā)明的一個方面，所述第290位的蘇氨酸Thr可以突變?yōu)槔野彼?Tyr)、半胱氨酸(Cys)、甘氨·酸(Gly)、絲氨酸(Ser)、天冬酰胺(Asn)或谷氨酰胺(Gln)，優(yōu)選的，突變?yōu)槔野彼?Tyr)。在本發(fā)明的一個方面，所述載體帶有的其中啟動子為來源于藍藻的Prbc啟動子、光誘導啟動子、硝酸鹽誘導啟動子或溫度誘導啟動子，優(yōu)選為Prbc啟動子。本發(fā)明提供的一種具有上述特征的載體，此載體具有抗生素標記(優(yōu)選抗性基因Ω片段)，啟動子(例如Prbc啟動子)、具有290Tyr點突變的運動單胞菌丙酮酸脫羧酶pdc基因和乙醇脫氫酶基因adhB片段。其中突變的pdc基因是通過點突變技術獲得的，將編碼PDC的pdc基因上的TAC突變?yōu)锳CC，從而將TOC的290位的酪氨酸Tyr置換為蘇氨酸Thr。本發(fā)明提供的另一種具有上述特征的載體是用于轉(zhuǎn)化藍藻的穿梭質(zhì)粒，此載體帶有抗生素標記、啟動子、具有290Tyr點突變的運動單胞菌丙酮酸脫羧酶pdc基因和乙醇脫氫酶基因adhB片段。在本發(fā)明的有一個方面，上述載體還包括藍藻基因組片段，從而使得所述丙酮酸脫羧酶基因、乙醇脫氫酶基因和所述啟動子在轉(zhuǎn)換藍藻后可重組到藍藻的染色體上。本發(fā)明還提供了一種分離的蛋白，其具有丙酮酸脫羧酶活性。所述分離的蛋白具有(I)對應于SEQIDNO.1的氨基酸序列，并且其中自N端第290位的蘇氨酸Thr具有突變，或(2)在上述氨基酸序列中還引入了一個或幾個氨基酸的取代、缺失、插入、增加或倒位后所得的氨基酸序列，并具有丙酮酸脫羧酶的活性。在本發(fā)明的一個方面，在上述本發(fā)明的分離的蛋白中，所述第290位的蘇氨酸Thr突變?yōu)槔野彼?Tyr)、半胱氨酸(Cys)、甘氨酸(Gly)、絲氨酸(Ser)、天冬酰胺(Asn)或谷氨酰胺(Gln)。在本發(fā)明的又一個方面，所述第290位的蘇氨酸Thr突變?yōu)槔野彼?Tyr)。在本發(fā)明的又一個方面，所述第290位的蘇氨酸Thr突變?yōu)樘於０?Asn)。在本發(fā)明的又一個方面，所述第290位的蘇氨酸Thr突變?yōu)楦拾彼?Gly)。在本發(fā)明的又一個方面，所述第290位的蘇氨酸Thr突變?yōu)榻z氨酸(Ser)。本發(fā)明還提供了編碼上述分離的蛋白的分離的核酸。所述核酸為(I)具有SEQIDNO.2的堿基序列的多核苷酸，并且其中編碼對應于SEQIDNO.1氨基酸序列中自N端第290位的蘇氨酸的堿基序列由TAC改變?yōu)榫幋a酪氨酸(Tyr)、半胱氨酸(Cys)、甘氨酸(Gly)、絲氨酸(Ser)、天冬酰胺(Asn)或谷氨酰胺(Gln)的堿基序列；或(2)與上述堿基序列或其互補堿基序列組成的多核苷酸在嚴格條件下雜交的多核苷酸。在本發(fā)明的一個方面，所述分離的核酸中編碼對應于SEQIDNO.1氨基酸序列中自N端第290位的蘇氨酸的堿基序列由TAC替換為ACC、ACA、ACT或ACG，優(yōu)選替換為ACC。圖1為構建本發(fā)明基因工程藍藻的示意圖。圖2為構建本發(fā)明基因工程藍藻的示意圖。圖3為本發(fā)明基因工程藍藻在培養(yǎng)液中的生物量、乙醇含量和時間的關系圖。具體實施例方式實施例1帶有抗生素標記、啟動子和運動單胞菌pdc基因的載體pXT117的獲得采用商購的pET28b(Novagen,美國)做為構建的載體。rbc啟動子(即Prbc)核酸序列是根據(jù)已報道的集胞藻屬的序列信息(如Genebank的BA000022.2，X65960.1)合成，其序列如SEQIDNo.5所示。pdc基因的核酸序列是根據(jù)已報道的運動單胞菌的pdc基因的核酸序列(如Genebank的X59558.1)合成，其序列如SEQIDNo.2所示。為了克隆到pET28b以及后期的構建需要，合成時在Pdc基因序列的3’端增加SpeI位點，NotI位點。另外采用帶有抗壯觀霉素和抗鏈霉素的抗性基因的omegainterposon,即Ω片段(參見Prentki,P.,andH.M.Krisch；1984；InvitroinsertionalmutagenesiswithaselectableDNAfragment；Gene29:303-313；以及XiaomingTan,LunYaoetc.,2011,Photosynthesisdrivenconversionofcarbondioxidetofattyalcoholsandhydrocarbonsincyanobacteria,MetabolicEngineering13,169176)作為抗性標記。合成的Ω片段的序列如SEQIDNo.6所示。將Ω片段，啟動子Prbc和pdc基因順次連接克隆到pET28b載體上，通過抗性篩選得到質(zhì)粒PXT117。pXT117結構見圖1。通過PCR核查，確認得到帶有Ω-Prbc-pdc的插入片段的質(zhì)粒。質(zhì)粒pXT117轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α(大腸埃希氏菌，Escherichiacoli),保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號，保藏日期為2011年10月14日，保藏號為CGMCCNO.5348。實施例2將PDC蛋白的290Tyr進行點突變通過點突變技術，把編碼PDC的pdc基因上的TAC突變?yōu)锳CC，從而將PDC的290位的酪氨酸Tyr置換為蘇氨酸Thr。利用步驟I得到的pXT117質(zhì)粒作為模板進行overlapPCR(重疊PCR)，采用的引物包括I號引物5，-ATGAGTTATACTGTCGGTACC-3，；2號引物3，-TTCGGACAATTGTTCGAGGAGATC-5，；3號引物3’-AGAAGTTGCTGTGGAGGTGGTGACCAA-5，；4號引物5’-TCTTCAACGACACCTCCACCACTGGTT-3’。其中下劃線部分即用于產(chǎn)生TAC(編碼Tyr)突變?yōu)锳CC(編碼Thr)點突變的位置。先利用I和3號引物，2和4號引物分別PCR，擴增出上片段和下片段。然后利用上片段和下片段同時做模板，用I和2號引物合成全長片段，合成全長片段后通過凝膠電泳進行DNA片段回收。利用XhoI對PXT117載體酶切，然后利用T4DNA聚合酶補平，通過凝膠電泳進行DNA片段回收。將合成片段與酶切后的PXT117載體用T4DNA連接酶連接，然后轉(zhuǎn)化大腸桿菌。用抗生素篩選出陽性克隆，然后提取質(zhì)粒，用kpnl酶切進行鑒定。得到的陽性克隆載體命名為PXT117-T290。pXT117結構見圖1。利用類似的方式構建其它具有Υ290位點的點突變的質(zhì)粒，包括(l)pXT117_G290，其采用的引物為3號引物3，-AGAAGTTGCTGCCTAGGTGGTGACCAA-5，；4號引物5’-TCTTCAACGACGGATCCACCACTGGTT-3’。(2)pXT117_S290，其采用的引物為3號引物3’-AGAAGTTGCTGAGGAGGTGGTGACCAA-5，；4號引物5’-TCTTCAACGACTCCTCCACCACTGGTT-3’。(3)pXT117_Q290，其采用的引物為3號引物3，-AGAAGTTGCTGGTTAGGTGGTGACCAA-5，；4號引物5’-TCTTCAACGACCAATCCACCACTGGTT-3’。實施例3帶有抗生素標記、啟動子和具有290Tyr點突變的運動單胞菌pdc基因的用于轉(zhuǎn)化藍藻的穿梭質(zhì)粒的獲得用SphI和NotI雙酶切PXT117-T290，補平粘性接口，回收Ω-Prbc-pdc的片段。用EcoRI酶切用于轉(zhuǎn)染藍藻的穿梭載體PKW1188SL，該質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α(大腸埃希氏菌，Escherichiacoli),保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號，保藏日期為2011年10月14日，保藏號為CGMCCNo.5349。其構建和結構參見XiaomingTan,LunYaoetc.,2011,Photosynthesisdrivenconversionofcarbondioxidetofattyalcoholsandhydrocarbonsincyanobacteria,MetabolicEngineering13，169-176),用T4DNAPolymerase補平，回收約5.4kb的片段。將獲得的Ω-Prbc-pdc的片段與前述pKW1188SL經(jīng)EcoRI酶切后得到的片段連接，經(jīng)篩選得到穿梭質(zhì)粒PXT122-T290。pXT122_T290結構參見圖1。利用類似的方式構建其它具有Υ290位點的點突變的質(zhì)粒，包括pXT122-G290、PXT122-S290、pXT122_Q290。實施例4聚球藻的adhB序列的獲得根據(jù)已報道的聚球藻的adhB序列的DNA序列(如Genebank的AP008231.1，X04616.2)，合成帶有SEQIDNo.4的核酸序列。為了克隆到pXT117，在合成時在該序列的5’和3’端分別添加SpeI位點和NotI位點。實施例5帶有抗生素標記、啟動子、具有290Tyr點突變的運動單胞菌pdc和聚球操的adhB基因的載體的獲得對實施例2獲得的pXT117系列質(zhì)粒(包括pXT117_T290、pXT117_G290、PXT117-S290、pXT117-Q290)和實施例4得到的adhB片段分別用SpeI和NotI進行雙酶切，連接后得到PXT119系列質(zhì)粒(包括pXT119-T290、pXT119_G290、pXT119_S290、pXTl19-Q290)。其中pXTl19-T290結構見圖1。通過凝膠電泳和測序，確認得到帶有Ω-Prbc-pdc-adhB插入片段的質(zhì)粒。實施例6帶有抗生素標記、啟動子、運動單胞菌pdc基因和聚球藻的adhB基因的用于轉(zhuǎn)化藍藻的穿梭質(zhì)粒的獲得用SphI和NotI雙酶切ρΧΤ119-Τ290，補平粘性接口，回收約5.8kb的片段(即Ω-Prbc-pdc-adhB的片段)。用EcoRI酶切質(zhì)粒PKW1188SL，該質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a，保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號為CGMCCNo.5349。其構建和結構參見XiaomingTan,LunYaoetc.,2011,Photosynthesisdrivenconversionofcarbondioxidetofattyalcoholsandhydrocarbonsincyanobacteria,MetabolicEngineering13,169176)，T4DNAPolymerase補平，回收約5.4kb的片段。將獲得的Ω-Prbc-pdc-adhB的片段與pKW1188SL經(jīng)EcoRI酶切后得到的片段連接，經(jīng)篩選得到如圖1所示的質(zhì)粒PXT123-T290。利用類似的方式構建其它具有Y290位點的點突變的質(zhì)粒，包括pXT123-G290、PXT123-S290、pXT123_Q290。以上步驟中PCR、酶切、補平、連接等分子克隆技術操作按照常規(guī)方法進行，其中典型操作包括以下方法。PCR:反應條件為94°C先變性5min;然后94°C變性lmin，62°C退火30s，72°C延伸2min，共25個循環(huán)；最后72°C反應lOmin。DNA片段連接反應，其中IOul連接體系，以TA連接為例外源DNA8ulT載體0.5ulIOX緩沖液IulT4DNA連接酶O.5ul混勻體系后，16°C連接過夜。對一般性連接反應，片段載體摩爾比為31-10I。實施例7藍藻細胞的轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)化野生型集胞藻PCC6803為宿主，將實施例中6獲得的帶Ω-Prbc-pdc-adhB的PXT123質(zhì)粒系列和將實施例3中獲得的帶Ω-Prbc-pdc的pXT122質(zhì)粒系列轉(zhuǎn)化到集胞藻中。其中，按照以下條件培養(yǎng)野生型集胞藻PCC6803:培養(yǎng)溫度30°C;光照強度50μE.m_2.s.1;培養(yǎng)方式500ml三角瓶培養(yǎng)，通5%C02，接種濃度OD730=O.5;培養(yǎng)基配制BG-1I培養(yǎng)基300ml，高壓蒸汽滅菌后，溫度降低到室溫，加入壯觀霉素，濃度20μg.mL—1。然后把質(zhì)粒pXT123-T290通過以下步驟轉(zhuǎn)化到PCC6803。5000g離心5分鐘收集藻細胞；用新鮮BG-1l液體培養(yǎng)基洗滌細胞兩次后，按IXIO9Cells.mr1(0D730=2.5)的濃度將細胞重懸于BG-1l培養(yǎng)基中;溫育，取O.4mL濃縮后的藻液到新的無菌EP管，加入質(zhì)粒pXT123-T290(終濃度10μg.mL_l)混勻，30μE.m_2·s—1光照30°C溫育45hr;涂膜將藻-DNA混合物涂在含有硝酸纖維素膜的BG-1l平板上，光照條件下，30μΕ.ΠΜ.ηΓ2.S-1JOO溫育1824hr;轉(zhuǎn)膜將NC膜轉(zhuǎn)移到含有抗生素的BG-1l平板上，于30μEm_2.培養(yǎng)約一周左右即有轉(zhuǎn)化子長出。挑取轉(zhuǎn)化子在帶壯觀霉素的BG-1l平板上劃線，待藻落富集后再接入液體培養(yǎng)基中進一步分離篩選。得到帶有pXT123-T290的集胞藻(Synechocystissp.),命名為PCC6803-pXT123-T290。其中一個菌株(送保藏名pXT123_T290)保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號，保藏時間為2011年12月02日，保藏號為CGMCCNO.5533。得到帶有ρΧΤ122-Τ290的集胞藻(Synechocystissp.)，命名為PCC6803-pXT122-T290。其中一個菌株(送保藏名pXT122_T290)保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏時間為2011年12月02日，保藏號為CGMCCNO.5532。利用類似的方式得到帶有其它點突變的質(zhì)粒的集胞藻菌株，所述質(zhì)粒包括PXT123-G290、pXT123_S290、pXT123_Q290、pXT122_G290、pXT122_S290、pXT122_Q290等。實施例7轉(zhuǎn)基因藍藻生產(chǎn)乙醇的活性檢測如實施例7中描述的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件下培養(yǎng)實施例7中獲得的上述PCC6803-pXT122-T290和PCC6803-pXT123_T290菌株，以PCC6803為空白對照。每兩天取樣一次，每次500ul,使用可見光分光光度計測量培養(yǎng)液的0D730,以獲得藍藻的生物量數(shù)據(jù)。使用山東省科學院生物研究所生物傳感分析儀SBA-40D測定藍藻培養(yǎng)液中的乙醇濃度。SBA-40D型生物傳感分析儀利用酶促反應來進行定量分析，測定的關鍵傳感器是固定化酶和H202電極復合傳感器，分析過程基于以下生化反應底物+O2+H2O-固趙七_莫——^產(chǎn)物+Η2θ2谷氨酸谷氨酸氧化酶α-酮戊二酸十NH4+葡萄糖葡萄糖氧化酶葡萄糖酸乳酸乳酸氧化酶丙酮酸乙醇乙醇氧化酶乙酸把轉(zhuǎn)基因藍藻培養(yǎng)液12000rpm離心2min，取上清液測量乙醇濃度。按生物傳感分析儀操作指南清洗儀器、定標后，使用生物傳感分析儀配套的取樣針取上清液25ul，注入進樣孔，儀器給出乙醇濃度讀數(shù)。上述PCC6803-PXT122-T290和PCC6803-pXT123_T290菌株的生長和生產(chǎn)乙醇與時間的關系如圖3所不。本發(fā)明以藍藻為宿主，將外源乙醇代謝途徑基因?qū)肴旧w，形成具有穩(wěn)定遺傳性狀和較高乙醇產(chǎn)率的基因工程菌株。本發(fā)明的基因工程菌株能夠利用陽光、二氧化碳生產(chǎn)乙醇這種替代能源產(chǎn)品。本發(fā)明為解決傳統(tǒng)生物能源技術的規(guī)模、產(chǎn)量和成本瓶頸提供了新的方法，有助于達到節(jié)能減排目標。本申請中提到的論文或?qū)＠暾埖娜幕虿糠滞ㄟ^引用到本申請中而公開，但不形成對本發(fā)明的現(xiàn)有技術。對于本領域技術人員而言，顯然本發(fā)明不限于上述示范性實施例的細節(jié)，而且在不背離本發(fā)明的精神或基本特征的情況下，能夠以其他的具體形式實現(xiàn)本發(fā)明。因此，無論從哪一點來看，均應將實施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本發(fā)明的范圍由所附權利要求而不是上述說明限定，因此旨在將落在權利要求的等同要件的含義和范圍內(nèi)的所有變化涵括在本發(fā)明內(nèi)。不應將權利要求中的任何附圖標記視為限制所涉及的權利要求。此夕卜，顯然“包括”一詞不排除其他單元或步驟，單數(shù)不排除復數(shù)。權利要求1.一種利用光合作用生產(chǎn)乙醇的基因工程藍藻，其含有整合到染色體上的外源基因，所述外源基因為丙酮酸脫羧酶基因和乙醇脫氫酶基因，其中所述丙酮酸脫羧酶基因編碼的丙酮酸脫羧酶具有對應于SEQIDNO.1的氨基酸序列，并且其中自N端第290位的蘇氨酸Thr具有突變，以及所述乙醇脫氫酶基因編碼的乙醇脫氫酶具有對應于SEQIDNO.3的氨基酸序列，其中所述第290位的蘇氨酸Thr突變?yōu)槔野彼?Tyr)、半胱氨酸(Cys)、甘氨酸(Gly)、絲氨酸(Ser)、天冬酰胺(Asn)或谷氨酰胺(Gln)，優(yōu)選為酪氨酸(Tyr)。2.權利要求1所述的基因工程藍藻，其中所述丙酮酸脫羧酶基因具有SEQIDNO.2的堿基序列的多核苷酸，并且其中編碼對應于SEQIDNO.1氨基酸序列中自N端第290位的蘇氨酸的堿基序列由TAC改變?yōu)榫幋a酪氨酸(Tyr)、半胱氨酸(Cys)、甘氨酸(Gly)、絲氨酸(Ser)、天冬酰胺(Asn)或谷氨酰胺(Gln)的堿基序列，優(yōu)選的，所述編碼對應于SEQIDNO.1氨基酸序列中自N端第290位的蘇氨酸的堿基序列由TAC替換為ACC、ACA、ACT或ACG，優(yōu)選替換為ACC。3.權利要求1-2中任一項所述的基因工程藍藻，其中所述乙醇脫氫酶的基因具有SEQIDNO.4的堿基序列的多核苷酸。4.權利要求1-3中任一項所述的基因工程藍藻，其中所述丙酮酸脫羧酶基因來源于運動發(fā)酵單胞菌，以及所述乙醇脫氫酶基因來源于聚球藻。5.權利要求1-9中任一項的基因工程藍藻，其選自集胞藻屬、隱球藻屬、魚腥藻屬、念珠藻屬、顫藻屬、聚球菌屬、球藻屬、阿格藻屬、雙歧藻屬、鞭枝藻屬，優(yōu)選為集胞藻，最優(yōu)選的是集胞藻PCC6803。6.權利要求1-5中任一項的基因工程藍藻，其生產(chǎn)的乙醇由細胞中擴散到培養(yǎng)液中，溶液中乙醇濃度達到O.lg/L，優(yōu)選的，達到O.5g/L，更優(yōu)選的，達到1.5到5g/L。7.權利要求1-6任一項的基因工程藍藻，其保藏號為CGMCCNo.5533。8.制備權利要求1-7中任一項的基因工程藍藻的方法，其包括將外源丙酮酸脫羧酶基因和乙醇脫氫酶基因，以及表達丙酮酸脫羧酶所需啟動子導入藍藻，并整合到藍藻染色體上。9.用權利要求1-7中任一項的基因工程藍藻制備乙醇的方法。10.一種載體，其包括(a)核酸，其包含丙酮酸脫羧酶基因和乙醇脫氫酶基因，其中所述丙酮酸脫羧酶基因編碼的丙酮酸脫羧酶具有對應于SEQIDNOI的氨基酸序列，并且其中自N端第290位的蘇氨酸Thr具有突變，以及其中所述乙醇脫氫酶基因編碼的乙醇脫氫酶具有對應于SEQIDNO3的氨基酸序列。和(b)啟動子，所述啟動子與所述丙酮酸脫羧酶和乙醇脫氫酶基因可操作地連接，優(yōu)選的，其中所述第290位的蘇氨酸Thr突變?yōu)槔野彼?Tyr)、半胱氨酸(Cys)、甘氨酸(Gly)、絲氨酸(Ser)、天冬酰胺(Asn)或谷氨酰胺(Gln)，最優(yōu)選為酪氨酸(Tyr)，更優(yōu)選的，所述載體中所述丙酮酸脫羧酶基因(I)具有SEQIDNO.3的堿基序列的多核苷酸，并且其中編碼對應于SEQIDNO.1氨基酸序列中自N端第290位的蘇氨酸的堿基序列由TAC改變?yōu)榫幋a酪氨酸(Tyr)、半胱氨酸(Cys)、甘氨酸(Gly)、絲氨酸(Ser)、天冬酰胺(Asn)或谷氨酰胺(Gln)的堿基序列。全文摘要本發(fā)明提供了一種利用光合作用生產(chǎn)乙醇的基因工程藍藻，其含有整合到染色體上的外源丙酮酸脫羧酶基因和外源乙醇脫氫酶，所述丙酮酸脫羧酶基因編碼的丙酮酸脫羧酶具有點突變。本發(fā)明還提供了制備所述基因工程藍藻的載體和制備方法，以及使用所述基因工程藍藻制備乙醇的方法。文檔編號C12P7/06GK102994391SQ20111044362公開日2013年3月27日申請日期2011年12月27日優(yōu)先權日2011年9月19日發(fā)明者范文俊,鄭曉光申請人:浙江齊成碳能科技有限公司