專利名稱：：一種生產(chǎn)乙醇的光合微生物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及可再生能源和生物
技術(shù)領(lǐng)域：
。具體涉及一種經(jīng)過(guò)基因工程修飾后可通過(guò)光合作用高效生產(chǎn)乙醇的微生物，以及所述基因工程修飾微生物的方法和運(yùn)用此基因工程微生物制備乙醇的方法。
背景技術(shù)：
：進(jìn)入21世紀(jì)以來(lái)，原油價(jià)格居高不下，太陽(yáng)能、風(fēng)能、潮汐能等開(kāi)發(fā)利用成本居高不下，而各國(guó)對(duì)環(huán)境保護(hù)的要求在不斷的提高，因此，如何開(kāi)發(fā)替代能源的問(wèn)題受到各國(guó)普遍關(guān)注。許多國(guó)家將加快發(fā)展可再生能源作為發(fā)展替代能源的重要戰(zhàn)略，生物能源是其中發(fā)展最快的領(lǐng)域。目前的液體生物燃料主要有生物燃料乙醇和生物柴油。然而，生物燃料的快速發(fā)展面臨著糧食安全和土地淡水資源緊缺問(wèn)題?，F(xiàn)有技術(shù)通過(guò)燃料乙醇產(chǎn)業(yè)作為替代能源，但是，隨著燃料乙醇產(chǎn)量增加，糧食供給短缺和價(jià)格上漲導(dǎo)致以糧食為原料的生物能源產(chǎn)業(yè)不能持續(xù)性發(fā)展。近幾年大力發(fā)展的非糧燃料乙醇和生物質(zhì)發(fā)電產(chǎn)業(yè)同樣受到客觀條件的制約，難以滿足大規(guī)模替代化石燃料的規(guī)模和成本要求。以木薯、甜高粱、纖維素為原料的燃料乙醇產(chǎn)業(yè)從本質(zhì)上說(shuō)是以種植業(yè)為基礎(chǔ)的，需要大規(guī)模投入可耕地、淡水、化肥以獲得較高產(chǎn)量，而這些資源均為稀缺資源，用于替代化石能源將對(duì)整體資源環(huán)境造成巨大壓力。因此，迫切需要開(kāi)發(fā)不占用可耕地、淡水、化肥資源的新型生物能源技術(shù)，為可再生能源產(chǎn)業(yè)發(fā)展提供具備現(xiàn)實(shí)可行性的手段，切實(shí)有效減少二氧化碳排放，替代化石能源使用，促進(jìn)基于化石能源的傳統(tǒng)工業(yè)體系向基于可再生能源的綠色工業(yè)體系轉(zhuǎn)化。對(duì)微生物進(jìn)行基因工程改造來(lái)生產(chǎn)能源是能源產(chǎn)業(yè)中的一個(gè)發(fā)展方向。但現(xiàn)有技術(shù)中，工業(yè)上主要是利用具有乙醇代謝途徑的異養(yǎng)微生物，例如酵母和大腸桿菌等。發(fā)明名稱為“基因修飾酵母物種和使用基因修飾酵母的發(fā)酵方法”的中國(guó)專利200480019052.8公開(kāi)了用外源木糖異構(gòu)酶基因轉(zhuǎn)化酵母細(xì)胞。額外的基因修飾增強(qiáng)了所轉(zhuǎn)化的細(xì)胞將木糖發(fā)酵成乙醇或者其產(chǎn)物的能力。那些修飾包括缺失非特異或特異的醛糖還原酶基因、缺失木糖醇脫氫酶基因和/或超表達(dá)木酮糖激酶。該方法可用于燃料乙醇的生產(chǎn)或用于酒精飲料的生產(chǎn)。發(fā)明名稱為“大腸桿菌乙醇發(fā)酵工程菌及其應(yīng)用”的中國(guó)專利200710177003.2公開(kāi)了一種耐乙醇的大腸桿菌乙醇發(fā)酵工程菌。經(jīng)多代的定向篩選得到了高耐乙醇的大腸桿菌突變株，并在所述突變株中轉(zhuǎn)入了運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌的乙醇脫氫酶基因II和丙酮酸脫羧酶基因，得到了一種新型耐乙醇的大腸桿菌乙醇發(fā)酵工程菌。該工程菌在用五碳糖和六碳糖做底物發(fā)酵生產(chǎn)乙醇時(shí)，在高濃度乙醇下依然能夠保持較高的發(fā)酵速率，而且有較高的乙醇轉(zhuǎn)化率。藍(lán)藻是一種自養(yǎng)微生物，是目前地球上最廣泛的生物體。藍(lán)藻的細(xì)胞質(zhì)中都有內(nèi)膜系統(tǒng)。藍(lán)藻的細(xì)胞質(zhì)中具原始的片層結(jié)構(gòu)，片層上分布有光合色素葉綠素和藻膽素(包括藻藍(lán)素和藻紅素兩種)及類胡蘿卜素。藍(lán)藻的葉綠素可以進(jìn)行光合作用，并且其細(xì)胞可以提供光合作用所需的能量，所以藍(lán)藻可以進(jìn)行光合作用，產(chǎn)生自己所需要的物質(zhì)，即可以自養(yǎng)。但是，自然存在的光合細(xì)菌藍(lán)藻通常不能利用陽(yáng)光和二氧化碳合成乙醇，僅在避光和無(wú)氧條件下通過(guò)發(fā)酵產(chǎn)生少量乙醇。本領(lǐng)域已知生產(chǎn)乙醇的微生物(例如大腸桿菌，酵母菌，運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單細(xì)胞菌等)中存在乙醇生產(chǎn)的代謝途徑。已知的乙醇生產(chǎn)代謝途徑是從糖酵解途徑的丙酮酸經(jīng)過(guò)乙醛再到末端代謝產(chǎn)物乙醇，其中丙酮酸到乙醛的反應(yīng)過(guò)程由丙酮酸脫羧酶(pyruvatedecarboxylase,PDC)催化，乙醒到乙醇的反應(yīng)過(guò)程由乙醇脫氫酶(alcoholdehydrogenase2,ADHB)催化控制。藍(lán)藻的基因組中不存在丙酮酸脫羧酶基因pdc，因而不具有利用陽(yáng)光和二氧化碳產(chǎn)生乙醇的能力。本發(fā)明提供了一種利用基因工程藍(lán)藻生產(chǎn)乙醇的方法，經(jīng)過(guò)對(duì)野生藍(lán)藻的改造，從而使得藍(lán)藻能夠直接利用太陽(yáng)光和二氧化碳生產(chǎn)乙醇。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明以藍(lán)藻為宿主，將外源乙醇代謝途徑的丙酮酸脫羧酶基因和乙醇脫氫酶基因?qū)胨{(lán)藻，形成具有穩(wěn)定遺傳性狀和較高乙醇產(chǎn)率的基因工程菌株，使得改造的藍(lán)藻菌株能夠利用陽(yáng)光、水和二氧化碳生產(chǎn)乙醇。本發(fā)明還提供了基因工程藍(lán)藻通過(guò)光合作用利用陽(yáng)光、水和二氧化碳制備乙醇的方法。本發(fā)明提供了一種利用光合作用生產(chǎn)乙醇的基因工程藍(lán)藻，其含有整合到染色體上的外源丙酮酸脫羧酶基因和乙醇脫氫酶基因。外源丙酮酸脫羧酶基因和乙醇脫氫酶基因在藍(lán)藻細(xì)胞內(nèi)分別編碼具有丙酮酸脫羧酶活性和乙醇脫氫酶活性的蛋白。本發(fā)明使用的宿主是藍(lán)藻，其可以是集胞藻(Synechocystis)、隱球藻屬(Aphanocaps)、魚(yú)腥藻屬(Anobaena)、念珠藻屬(Nostoc)、顫藻屬(Oscillatoria)、聚球藻屬(Synechococcus)、球藻屬(Gloeocapsa)、阿格藻屬(Agmmenellumm)、雙歧藻屬(Scytonema)或鞭枝藻屬(Mastigocladus)。本發(fā)明的藍(lán)藻優(yōu)選為集胞藻(Synechocystissp.)。在本發(fā)明的一個(gè)方面，采用的宿主是集胞藻PCC6803。本發(fā)明的基因工程藍(lán)藻含有整合到染色體上的編碼丙酮酸脫羧酶和乙醇脫氫酶的核酸。丙酮酸脫羧酶(pyruvatedecarboxylase,PDC)廣泛存在于豆類植物、麻黃等植物、釀酒酵母屬(Saccharomycesspecies)、曲霉屬等真菌中，另外運(yùn)動(dòng)單胞菌(Zymomonasmobilis)、醋桿菌屬(Acetobacterspecies)中也都含有丙酮酸脫羧酶。不同來(lái)源的丙酮酸脫羧酶，其編碼序列和活性有所不同。已經(jīng)對(duì)各種來(lái)源的丙酮酸脫羧酶進(jìn)行了測(cè)序和活性研究，發(fā)現(xiàn)不同來(lái)源的丙酮酸脫羧酶的序列有所區(qū)別，但也具有很多保守的區(qū)域和活性位點(diǎn)。其中，如Genebank報(bào)道的，運(yùn)動(dòng)單胞菌的丙酮酸脫羧酶具有如SEQIDNO.1的氨基酸序列，其基因pdc具有如SEQIDNO.2的核酸序列。不同來(lái)源的丙酮酸脫羧酶的序列有所區(qū)別，但都具有對(duì)應(yīng)于SEQIDNO.1的氨基酸序列，其中存在保守序列和活性位點(diǎn)。乙醇脫氫酶(alcoholdehydrogenase,ADH)大量存在于人和動(dòng)物肝臟、植物及微生物細(xì)胞之中，是一種含鋅金屬酶，具有廣泛的底物特異性，其分子由兩個(gè)亞基組成，其中一個(gè)位于酶的活性中心，另一個(gè)起穩(wěn)定四級(jí)結(jié)構(gòu)的作用。乙醇脫氫酶夠以煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)為輔酶，催化伯醇和醛之間的可逆反應(yīng)CH3CH2OH+NAD+—CH3CHO+NADH+H+。在人和哺乳動(dòng)物體內(nèi)，乙醇脫氫酶與乙醛脫氫酶(ALDH)構(gòu)成了乙醇脫氫酶系，參與體內(nèi)乙醇代謝。酵母和細(xì)菌(乳酸菌，以及某些條件下的大腸桿菌除外)不將葡萄糖發(fā)酵為乳酸，而是將葡萄糖發(fā)酵為乙醇和二氧化碳?？偡磻?yīng)式為Glucose+2ADP+2Pi—2ethanol+2C02+2ATP+2H20。在酵母和許多細(xì)菌中，乙醇脫氫酶在發(fā)酵起著重要作用從糖酵解產(chǎn)生的丙酮酸轉(zhuǎn)化為乙醛和二氧化碳，隨后乙醛在ADHI的作用下轉(zhuǎn)化為乙醇。后一步的目的是重新產(chǎn)生NAD+，于是糖酵解的能量生成得以繼續(xù)。不同來(lái)源的乙醇脫氫酶，其編碼序列和活性有所不同。已經(jīng)對(duì)各種來(lái)源的乙醇脫氫酶進(jìn)行了測(cè)序和活性研究，發(fā)現(xiàn)不同來(lái)源的乙醇脫氫酶的序列和活性有所區(qū)別。其中，如Genebank報(bào)道的，聚球藻的其中一種乙醇脫氫酶ADHB具有如SEQIDNO.3的氨基酸序列，其基因adhB具有如SEQIDNO.4的核酸序列。不同來(lái)源的乙醇脫氫酶的序列有所區(qū)別，但可具有對(duì)應(yīng)于SEQIDNO.3的氨基酸序列，其中存在保守序列和活性位點(diǎn)。本發(fā)明提供了一種利用光合作用生產(chǎn)乙醇的基因工程藍(lán)藻，其含有整合到染色體上的外源基因，所述外源基因?yàn)楸崦擊让富蚝鸵掖济摎涿富?，其中所述丙酮酸脫羧酶基因編碼的丙酮酸脫羧酶具有對(duì)應(yīng)于SEQIDNO.1的氨基酸序列，以及所述乙醇脫氫酶基因編碼的乙醇脫氫酶具有對(duì)應(yīng)于SEQIDN0.3的氨基酸序列。在本發(fā)明的一個(gè)方面，本發(fā)明的基因工程藍(lán)藻染色體整合的丙酮酸脫羧酶基因編碼的丙酮酸脫羧酶具有(I)對(duì)應(yīng)于SEQIDNO.1的氨基酸序列，或(2)在上述氨基酸序列中還引入了一個(gè)或幾個(gè)氨基酸的取代、缺失、插入、增加或倒位后所得的氨基酸序列，并具有丙酮酸脫羧酶的活性。在本發(fā)明的一個(gè)方面，本發(fā)明的基因工程藍(lán)藻染色體整合的乙醇脫氫酶基因編碼的乙醇脫氫酶具有(I)對(duì)應(yīng)于SEQIDNO.3的氨基酸序列，或(2)在上述氨基酸序列中還引入了一個(gè)或幾個(gè)氨基酸的取代、缺失、插入、增加或倒位后所得的氨基酸序列，并具有丙酮酸脫羧酶的活性。在本發(fā)明的一個(gè)方面，本發(fā)明的基因工程藍(lán)藻中所述丙酮酸脫羧酶基因選自來(lái)源于運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌、酵母、藍(lán)藻和大腸桿菌的丙酮酸脫羧酶基因，優(yōu)選來(lái)源于運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌。在本發(fā)明的一個(gè)方面，本發(fā)明的基因工程藍(lán)藻中所述乙醇脫氫酶基因選自來(lái)源于運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌、酵母、藍(lán)藻、嗜熱醋酸菌、綠屈撓菌、聚球藻的乙醇脫氫酶基因，優(yōu)選來(lái)源于聚球藻。在本發(fā)明的一個(gè)方面，本發(fā)明的基因工程藍(lán)藻中含有整合到染色體上的外源丙酮酸脫羧酶基因和外源乙醇脫氫酶基因，所述外源丙酮酸脫羧酶基因選自來(lái)源于運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌，并且所述外源乙醇脫氫酶來(lái)源于聚球藻。在本發(fā)明的一個(gè)方面，基因工程藍(lán)藻帶有的所述丙酮酸脫羧酶基因具有SEQIDNO.2的堿基序列的多核苷酸，或是與SEQIDNO.2的堿基序列或其互補(bǔ)堿基序列組成的多核苷酸在嚴(yán)格條件下雜交的多核苷酸。在本發(fā)明的一個(gè)方面，基因工程藍(lán)藻帶有的所述外源乙醇脫氫酶基因具有SEQIDNO.4的堿基序列的多核苷酸，或是與SEQIDNO.4的堿基序列或其互補(bǔ)堿基序列組成的多核苷酸在嚴(yán)格條件下雜交的多核苷酸。本發(fā)明對(duì)藍(lán)藻進(jìn)行的基因修飾是通過(guò)引入外源基因?qū)崿F(xiàn)的。引入外源基因是通過(guò)制備構(gòu)建體和轉(zhuǎn)化到藍(lán)藻細(xì)胞中，并進(jìn)一步整合到藍(lán)藻的染色體。制備的構(gòu)建體包含至少一種調(diào)控序列，優(yōu)選的調(diào)控序列是啟動(dòng)子。啟動(dòng)子是基因調(diào)控中普遍存在的順式作用元件，是RNA聚合酶能夠識(shí)別并與之結(jié)合而起始基因轉(zhuǎn)錄的一段DNA序列，通常位于基因5’端上游。它能決定轉(zhuǎn)錄的方向和效率，以及RNA聚合酶類型，并引導(dǎo)RNA聚合酶與模板的正確結(jié)合。啟動(dòng)子是基因表達(dá)調(diào)控的重要元件，它與RNA聚合酶及其他反式作用因子的相互作用是通過(guò)基因轉(zhuǎn)錄實(shí)施基因調(diào)控轉(zhuǎn)錄的關(guān)鍵。在本發(fā)明中，對(duì)藍(lán)藻進(jìn)行的基因修飾還包括導(dǎo)入表達(dá)丙酮酸脫羧酶和/或乙醇脫氫酶所需啟動(dòng)子，并整合到藍(lán)藻染色體上。所述啟動(dòng)子與丙酮酸脫羧酶和/或乙醇脫氫酶可操作地連接。在本發(fā)明的一個(gè)方面，丙酮酸脫羧酶基因轉(zhuǎn)錄起始密碼子前具有所述啟動(dòng)子。在本發(fā)明的一個(gè)方面，乙醇脫氫酶基因轉(zhuǎn)錄起始密碼子前具有或不具有所述啟動(dòng)子。多種啟動(dòng)子可用于本發(fā)明的構(gòu)建體，可根據(jù)所需結(jié)果來(lái)選擇啟動(dòng)子，并且可包括用于在藍(lán)藻中表達(dá)的組成型啟動(dòng)子、細(xì)胞特異性啟動(dòng)子、誘導(dǎo)型啟動(dòng)子或其他啟動(dòng)子。在本發(fā)明的一個(gè)方面，本發(fā)明使用的所述啟動(dòng)子為來(lái)源于藻類的PrbC(ribul0Se-l，5-bisphosphatecarboxylase/oxygenasegene)啟動(dòng)子、光誘導(dǎo)啟動(dòng)子、硝酸鹽誘導(dǎo)啟動(dòng)子或溫度誘導(dǎo)啟動(dòng)子。啟動(dòng)子Prbc是藍(lán)細(xì)菌體內(nèi)的強(qiáng)啟動(dòng)子，具備在藍(lán)細(xì)菌體內(nèi)高效表達(dá)基因的能力，被成功應(yīng)用在多種藍(lán)細(xì)菌菌株中。另一種光誘導(dǎo)啟動(dòng)子PsbA位于藍(lán)藻光系統(tǒng)蛋白psbA上游。光誘導(dǎo)啟動(dòng)子在藍(lán)藻光合作用和細(xì)胞代謝的研究中作為表達(dá)外源基因的強(qiáng)啟動(dòng)子使用。硝酸鹽啟動(dòng)子位于硝酸鹽還原酶(nitratereductase,NR)上游。硝酸鹽還原酶NR是一種誘導(dǎo)酶，硝酸鹽對(duì)NR的活性有明顯誘導(dǎo)作用，而銨則能抑制NR的表達(dá)，因此NR的啟動(dòng)子已經(jīng)成為轉(zhuǎn)基因研究中比較理想的可控性啟動(dòng)子。熱誘導(dǎo)啟動(dòng)子PgroESL位于藍(lán)藻熱休克基因groESL上游。由于groESL啟動(dòng)子具高效性，人們一直試圖利用其提高宿主細(xì)胞中外源基因的表達(dá)水平。在本發(fā)明的一個(gè)方面，本發(fā)明的基因工程藍(lán)藻產(chǎn)生的乙醇由細(xì)胞中擴(kuò)散到培養(yǎng)液中。本發(fā)明的基因工程藍(lán)藻的培養(yǎng)液中溶液乙醇濃度達(dá)到O.5g/L以上，優(yōu)選的，達(dá)到1.5到5g/L。在本發(fā)明的一個(gè)方面，本發(fā)明的基因工程藍(lán)藻保藏于，其保藏號(hào)為。在本發(fā)明的一個(gè)方面，本發(fā)明提供了制備上述基因工程藍(lán)藻的方法，其包括將外源丙酮酸脫羧酶基因，外源乙醇脫氫酶基因，以及表達(dá)丙酮酸脫羧酶和/或外源乙醇脫氫酶基因所需啟動(dòng)子導(dǎo)入藍(lán)藻，并整合到藍(lán)藻染色體上。本發(fā)明的制備基因工程藻類包括以下主要步驟。通過(guò)PCT或合成的方法獲得目的基因或目的核苷酸片段，包外源丙酮酸脫羧酶基因、外源乙醇脫氫酶基因，啟動(dòng)子和/或抗性標(biāo)記基因等核苷酸片段。將帶有目的基因的DNA片段連接到能夠獨(dú)立復(fù)制并具有選擇標(biāo)記的載體上，如質(zhì)粒、噬菌體和病毒等，以形成重組DNA分子。DNA片斷與載體的連接方式主要有同聚末端連接、粘性末端連接、平齊末端連接及人工接頭分子連接。重組DNA必須進(jìn)入宿主細(xì)胞DNA中，才能得到擴(kuò)增和表達(dá)。根據(jù)載體的性質(zhì)不同，可采用轉(zhuǎn)染、轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)導(dǎo)等方式，將重組DNA分子導(dǎo)入宿主細(xì)胞內(nèi)，并使其大量繁殖。應(yīng)用于藍(lán)藻遺傳轉(zhuǎn)化的供體DNA大體可分為三類第一類是直接利用未修飾的外源質(zhì)粒，可將外源DNA導(dǎo)入藍(lán)藻。第二類是利用自身染色體或基因組，通過(guò)同源重組作為插入突變的有效方法。第三類是使用穿梭載體。穿梭質(zhì)?？梢院兴{(lán)藻質(zhì)粒復(fù)制起點(diǎn)，能夠以復(fù)制子形式獨(dú)立存在。穿梭質(zhì)粒還可以帶有與藍(lán)藻基因組相同的序列，從而在進(jìn)入藍(lán)藻后與發(fā)生染色體同源重組，從而穩(wěn)定存在和表達(dá)。在本發(fā)明的一個(gè)方面，本發(fā)明提供了利用本發(fā)明的基因工程藍(lán)藻制備乙醇的方法。經(jīng)過(guò)上述基因工程的改造，本發(fā)明的藍(lán)藻的細(xì)胞內(nèi)能夠有效地表達(dá)具備了催化丙酮酸到乙醛的反應(yīng)活性的丙酮酸脫羧酶，以及外源乙醇脫氫酶，從而能夠利用陽(yáng)光、水和二氧化碳生產(chǎn)乙醇。本發(fā)明的基因工程藍(lán)藻在含有碳源(例如二氧化碳)的培養(yǎng)液中，在光照條件下進(jìn)行繁殖和光反應(yīng)，產(chǎn)生乙醇，然后進(jìn)行分離、收集和提純，例如采取傳統(tǒng)蒸餾和氣提本發(fā)明中的外源基因是通過(guò)載體導(dǎo)入藍(lán)藻的，載體中包括整合到染色體上的外源丙酮酸脫羧酶基因和外源乙醇脫氫酶的核酸部分和啟動(dòng)子。其中所述外源丙酮酸脫羧酶基因編碼的蛋白具有對(duì)應(yīng)于SEQIDNO.1的氨基酸序列，以及其中所述外源乙醇脫氫酶基因編碼的乙醇脫氫酶具有對(duì)應(yīng)于SEQIDNO.3的氨基酸序列。在本發(fā)明的一個(gè)方面，基因工程藍(lán)藻帶有的所述丙酮酸脫羧酶基因具有SEQIDNO.2的堿基序列的多核苷酸，或是與SEQIDNO.2的堿基序列或其互補(bǔ)堿基序列組成的多核苷酸在嚴(yán)格條件下雜交的多核苷酸。在本發(fā)明的一個(gè)方面，基因工程藍(lán)藻帶有的所述外源乙醇脫氫酶基因具有SEQIDNO.4的堿基序列的多核苷酸，或是與SEQIDNO.4的堿基序列或其互補(bǔ)堿基序列組成的多核苷酸在嚴(yán)格條件下雜交的多核苷酸。在本發(fā)明的一個(gè)方面，所述載體帶有的其中啟動(dòng)子為來(lái)源于藍(lán)藻的Prbc啟動(dòng)子、光誘導(dǎo)啟動(dòng)子、硝酸鹽誘導(dǎo)啟動(dòng)子或溫度誘導(dǎo)啟動(dòng)子，優(yōu)選為Prbc啟動(dòng)子。在本發(fā)明的一個(gè)方面，提供了一種具有上述特征的載體，所述載體包括抗生素標(biāo)記(優(yōu)選抗性基因Ω片段)，啟動(dòng)子(例如Prbc啟動(dòng)子)，丙酮酸脫羧酶基因pdc和乙醇脫氫酶基因adhB片段。本發(fā)明提供的另一種具有上述特征的載體是用于轉(zhuǎn)化藍(lán)藻的穿梭質(zhì)粒，所述載體帶有抗生素標(biāo)記(優(yōu)選抗性基因Ω片段)、啟動(dòng)子(例如Prbc啟動(dòng)子)、丙酮酸脫羧酶基因pdc和乙醇脫氫酶基因adhB。所述載體還可包括藍(lán)藻基因組片段，從而使得所述丙酮酸脫羧酶和所述啟動(dòng)子在轉(zhuǎn)換藍(lán)藻后可重組到藍(lán)藻的染色體上。圖1為構(gòu)建本發(fā)明基因工程藍(lán)藻的示意圖。圖2為本發(fā)明基因工程藍(lán)藻在培養(yǎng)液中的生物量、乙醇含量和時(shí)間的關(guān)系圖。具體實(shí)施例方式本發(fā)明將在下面的實(shí)施例中進(jìn)一步說(shuō)明。應(yīng)當(dāng)理解，盡管這些實(shí)施例說(shuō)明了本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案，但僅是以例證的方式給出的。根據(jù)上面的論述和這些實(shí)施例，本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以確定本發(fā)明的基本特征，并在不脫離本發(fā)明的精神和范圍的情況下，可對(duì)本發(fā)明做出多種改變和修飾，以使其適用于多種用法和條件。因此，除了那些本文所示和描述的那些之外，根據(jù)前文所述，本發(fā)明的各種修改形式對(duì)本領(lǐng)域的技術(shù)人員來(lái)說(shuō)將是顯而易見(jiàn)的。這些修改形式也旨在屬于所附權(quán)利要求書的范圍內(nèi)。實(shí)施例1帶有抗生素標(biāo)記、啟動(dòng)子和運(yùn)動(dòng)單胞菌丙酮酸脫羧酶pdc基因的載體PXT117的獲得采用商購(gòu)的pET28b(Novagen,美國(guó))做為構(gòu)建的載體。rbc啟動(dòng)子(即Prbc)核酸序列是根據(jù)已報(bào)道的集胞藻屬的序列信息(如Genebank的BA000022.2，X65960.1)合成，其序列如SEQIDNo.5所示。丙酮酸脫羧酶pdc基因的核酸序列是根據(jù)已報(bào)道的運(yùn)動(dòng)單胞菌的pdc基因的核酸序列(如Genebank的X59558.1)合成，其序列如SEQIDNo.2所示。為了克隆到pET28b以及后期的構(gòu)建需要，合成時(shí)在Pdc基因序列的3’端增加SpeI位點(diǎn)，NotI位點(diǎn)。另外采用帶有抗壯觀霉素和抗鏈霉素的抗性基因的omegainterposon,即Ω片段(參見(jiàn)Prentki,P.,andH.Μ·Krisch;1984;InvitroinsertionalmutagenesiswithaselectableDNAfragment；Gene29:303-313；以及XiaomingTan,LunYaoetc.,2011,Photosynthesisdrivenconversionofcarbondioxidetofattyalcoholsandhydrocarbonsincyanobacteria,MetabolicEngineering13,169-176)作為抗性標(biāo)記。合成的Ω片段的序列如SEQIDNo.6所示。將Ω片段，啟動(dòng)子Prbc和pdc基因順次連接克隆到pET28b載體上，通過(guò)抗性篩選得到質(zhì)粒PXT117。pXT117結(jié)構(gòu)參見(jiàn)圖1。通過(guò)PCR核查，確認(rèn)得到帶有Ω-Prbc-pdc的插入片段的質(zhì)粒。質(zhì)粒pXT117轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α(大腸埃希氏菌，Escherichiacoli),該含有質(zhì)粒PXT117的大腸桿菌保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路I號(hào)院3號(hào)，保藏日期為2011年10月14日，保藏號(hào)為CGMCCNo.5348。實(shí)施例2聚球藻的乙醇脫氫酶adhB序列的獲得根據(jù)已報(bào)道的聚球藻的adhB序列的DNA序列(如Genebank的AP008231.1，X04616.2)，合成SEQIDNo.4的核酸序列。為了克隆到pXT117，在合成時(shí)在該序列的5’和3’端分別添加SpeI位點(diǎn)和NotI位點(diǎn)。實(shí)施例3載體的獲得對(duì)實(shí)施例1獲得的pXTl17和實(shí)施例2得到的adhB片段分別用SpeI和NotI進(jìn)行雙酶切，連接后得到PXT119。pXT119結(jié)構(gòu)參見(jiàn)圖1。通過(guò)凝膠電泳和測(cè)序，確認(rèn)得到帶有Ω-Prbc-pdc-adhB插入片段的質(zhì)粒。實(shí)施例4帶有抗生素標(biāo)記、啟動(dòng)子、運(yùn)動(dòng)單胞菌pdc基因和聚球藻adhB基因的用于轉(zhuǎn)化藍(lán)藻的穿梭質(zhì)粒的獲得用SphI和NotI雙酶切pXTl19，補(bǔ)平粘性接口，回收約5.8kb的片段(即Ω-Prbc-pdc-adhB的片段)。用EcoRI酶切質(zhì)粒pKWl188SL該質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α(大腸埃希氏菌，Escherichiacoli),保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心,北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路I號(hào)院3號(hào)，保藏日期為2011年10月14日保藏號(hào)為CGMCCNo.5349。其構(gòu)建和結(jié)構(gòu)參見(jiàn)XiaomingTan,LunYaoetc.,2011,Photosynthesisdrivenconversionofcarbondioxidetofattyalcoholsandhydrocarbonsincyanobacteria,MetabolicEngineering13,169-176)，T4DNAPolymerase補(bǔ)平，回收約5.4kb的片段。將上述獲得的Ω-Prbc-pdc-adhB的片段與pKW1188SL經(jīng)EcoRI酶切后得到的片段連接，經(jīng)篩選得到如圖1所示的質(zhì)粒PXT121。以上步驟中PCR、酶切、補(bǔ)平、連接等分子克隆技術(shù)操作按照常規(guī)方法進(jìn)行，其中典型操作包括以下方法。PCR:反應(yīng)條件為94°C先變性5min;然后94°C變性lmin，62°C退火30s，72°C延伸2min，共25個(gè)循環(huán)；最后72°C反應(yīng)lOmin。DNA片段連接反應(yīng)，其中IOul連接體系，以TA連接為例外源DNA8ulT載體O.5ulIOx緩沖液IulT4DNA連接酶O.5ul混勻體系后，16°C連接過(guò)夜。對(duì)一般性連接反應(yīng)，片段載體摩爾比為31-10I。大腸桿菌細(xì)胞的化學(xué)轉(zhuǎn)化準(zhǔn)備LB固體培養(yǎng)基(含抗生素)，使用前室溫下放置2-3小時(shí)；-80°C冰柜中取出感受態(tài)細(xì)胞，冰浴中融化5min;向融化的感受態(tài)細(xì)胞中加入1-1Oul連接產(chǎn)物(或質(zhì)粒)，輕輕混勻，冰水浴中放置30分鐘；同時(shí)向另一管中加入等體積滅菌水作為對(duì)照；42°C熱激90秒，然后立即冰水浴2分鐘；加入ImlSOC液體培養(yǎng)基，37°C、250rpm振蕩復(fù)壯45min_lh；IOOOOrpm離心Imin,沉淀重懸于100_200ulSOC液體培養(yǎng)基；取適量(約IOOul)重懸液涂布于LB固體培養(yǎng)基(含抗生素)上，37°C倒置培養(yǎng)，12-20小時(shí)后長(zhǎng)出菌落。實(shí)施例5藍(lán)藻細(xì)胞的轉(zhuǎn)化以轉(zhuǎn)化野生型集胞藻PCC6803為宿主，將實(shí)施例4中獲得的帶Ω-Prbc-pdc-adhB的質(zhì)粒PXT121轉(zhuǎn)化到集胞藻中。按照以下條件培養(yǎng)野生型集胞藻PCC6803:培養(yǎng)溫度30°C;光照強(qiáng)度50μE.m_2·s—1;培養(yǎng)方式500ml三角瓶培養(yǎng)，通5%C02，接種濃度OD730=O.5;培養(yǎng)基配制BG-1l培養(yǎng)基300ml，高壓蒸汽滅菌后，溫度降低到室溫，加入壯觀霉素，濃度20μg.mL'然后把質(zhì)粒pXT121通過(guò)以下步驟轉(zhuǎn)化到PCC6803。5000g離心5分鐘收集藻細(xì)胞；用新鮮BG-1l液體培養(yǎng)基洗滌細(xì)胞兩次后，按IXIO9Cells.mr1(0D730=2.5)的濃度將細(xì)胞重懸于BG-1I培養(yǎng)基中；溫育，取0.4mL濃縮后的藻液到新的無(wú)菌EP管，加入質(zhì)粒pXT121(終濃度10μg.mL-1)混勻，30μE.m_2·s-1光照30°C溫育45hr;涂膜將藻-DNA混合物涂在含有硝酸纖維素膜的BG-1l平板上，光照條件下，30μΕ.πΓ2.S-1JOO溫育1824hr;轉(zhuǎn)膜將NC膜轉(zhuǎn)移到含有抗生素的BG-1l平板上，于30μEm_2.培養(yǎng)約一周左右即有轉(zhuǎn)化子長(zhǎng)出。挑取轉(zhuǎn)化子在帶壯觀霉素的BG-1l平板上劃線，待藻落富集后再接入液體培養(yǎng)基中進(jìn)一步分離篩選。得到帶有pXT121的集胞藻(Synechocystissp.)，命名為PCC6803_pXT121。其中一個(gè)菌株保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路I號(hào)院3號(hào)，保藏時(shí)間為2011年12月02日，保藏號(hào)為CGMCCNO.5531。實(shí)施例6轉(zhuǎn)基因藍(lán)藻生產(chǎn)乙醇的活性檢測(cè)和比較在如實(shí)施例5中描述的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件下培養(yǎng)實(shí)施例5中獲得的上述PCC6803-pXT121菌株，以PCC6803為空白對(duì)照。每?jī)商烊右淮?，每?00ul，使用可見(jiàn)光分光光度計(jì)測(cè)量培養(yǎng)液的OD73tl,以獲得藍(lán)藻的生物量數(shù)據(jù)。使用山東省科學(xué)院生物研究所生物傳感分析儀SBA-40D測(cè)定藍(lán)藻培養(yǎng)液中的乙醇濃度。SBA-40D型生物傳感分析儀利用酶促反應(yīng)來(lái)進(jìn)行定量分析，測(cè)定的關(guān)鍵傳感器是固定化酶和H202電極復(fù)合傳感器，分析過(guò)程基于以下生化反應(yīng)權(quán)利要求1.一種利用光合作用生產(chǎn)乙醇的基因工程藍(lán)藻，其含有整合到染色體上的外源基因，所述外源基因?yàn)楸崦擊让富蚝鸵掖济摎涿富?，其中所述丙酮酸脫羧酶基因編碼的丙酮酸脫羧酶具有對(duì)應(yīng)于SEQIDNO.1的氨基酸序列，以及所述乙醇脫氫酶基因編碼的乙醇脫氫酶具有對(duì)應(yīng)于SEQIDNO.3的氨基酸序列。2.權(quán)利要求1的基因工程藍(lán)藻，其中所述丙酮酸脫羧酶基因選自來(lái)源于運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌，以及乙醇脫氫酶來(lái)源于聚球藻。3.權(quán)利要求1-2中任一項(xiàng)的基因工程藍(lán)藻，其中所述丙酮酸脫羧酶基因具有SEQIDNO.2的核酸序列，其中所述乙醇脫氫酶基因具有SEQIDNO.4的核酸序列。4.權(quán)利要求中1-3任一項(xiàng)的基因工程藍(lán)藻，其選自集胞藻屬、隱球藻屬、魚(yú)腥藻屬、念珠藻屬、顫藻屬、聚球藻屬、球藻屬、阿格藻屬、雙歧藻屬和鞭枝藻屬，優(yōu)選為集胞藻屬，最優(yōu)選為集胞藻PCC6803。5.權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)的所述的基因工程藍(lán)藻，其生產(chǎn)的乙醇由細(xì)胞中擴(kuò)散到培養(yǎng)液中，溶液中乙醇濃度達(dá)到O.5g/L，優(yōu)選的，達(dá)到1.5到5g/L。6.權(quán)利要求1-5任一項(xiàng)的基因工程藍(lán)藻，其保藏號(hào)為CGMCCNo.5531。7.制備權(quán)利要求1-6中任一項(xiàng)的基因工程藍(lán)藻的方法，其包括將外源丙酮酸脫羧酶基因和乙醇脫氫酶基因，以及表達(dá)丙酮酸脫羧酶和乙醇脫氫酶基因所需啟動(dòng)子導(dǎo)入，并整合到藍(lán)藻染色體上。8.用權(quán)利要求1-6中任一項(xiàng)的基因工程藍(lán)藻制備乙醇的方法。9.一種載體,其包括(a)核酸，其包含丙酮酸脫羧酶基因和乙醇脫氫酶基因，其中所述丙酮酸脫羧酶基因編碼的丙酮酸脫羧酶具有對(duì)應(yīng)于SEQIDNO.1的氨基酸序列，以及，其中所述乙醇脫氫酶基因編碼的乙醇脫氫酶具有對(duì)應(yīng)于SEQIDNO.3的氨基酸序列；和(b)啟動(dòng)子，所述啟動(dòng)子與所述丙酮酸脫羧酶和乙醇脫氫酶基因可操作地連接。10.權(quán)利要求9的載體，其中所述丙酮酸脫羧酶基因具有SEQIDNO.2的核酸序列，其中所述乙醇脫氫酶基因具有SEQIDNO.4的核酸序列。全文摘要本發(fā)明提供了一種利用光合作用生產(chǎn)乙醇的基因工程藍(lán)藻，其含有整合到染色體上的外源丙酮酸脫羧酶基因和外源乙醇脫氫酶基因。本發(fā)明還提供了制備所述基因工程藍(lán)藻的載體和制備方法，以及使用所述基因工程藍(lán)藻生產(chǎn)乙醇的方法。文檔編號(hào)C12N1/13GK102994392SQ201110443700公開(kāi)日2013年3月27日申請(qǐng)日期2011年12月27日優(yōu)先權(quán)日2011年9月19日發(fā)明者范文俊,鄭曉光申請(qǐng)人:浙江齊成碳能科技有限公司