專利名稱：一株抗人血小板膜糖蛋白Ibα人鼠嵌合型單克隆抗體及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種具有與血小板膜糖蛋白的高特異性、高親合力結(jié)合并具有抗血栓生物活性的嵌合型單克隆抗體及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
流行病學(xué)研究顯示，隨著生活條件的改善及人口的老齡化，近幾十年來血栓栓塞性疾病所引起或并發(fā)的病變，是當(dāng)前嚴(yán)重危害人類健康的疾病。血小板在血栓的形成中起著關(guān)鍵性作用，血小板聚集是血栓形成的必要過程。正常生理情況下，血栓可以防止血細(xì)胞滲漏到血管外，然而在特定的疾病條件下，血栓可以抑制或者完全阻止血液流動從而導(dǎo)致細(xì)胞性壞死。發(fā)生在動脈粥樣硬化斑塊處的血小板聚集以及隨后的血栓形成，在心絞痛、急性心肌梗塞、溶栓以及血管成形術(shù)后的血栓再形成等疾病中起著重要的作用，對心?；颊哌M(jìn)行經(jīng)皮導(dǎo)管血管成形術(shù)(PTCA)及溶栓治療是挽救患者生命的重要手段。而這些治療方法的一個(gè)重要并發(fā)癥就是血小板在血管成形術(shù)造成的血管內(nèi)皮損傷部位發(fā)生粘附和聚集，再次形成血栓，從而進(jìn)一步加重對心臟的損傷。我們已經(jīng)知道血小板通過GPrt α受體粘附于受損血管壁，是血小板血栓形成的開始步驟，因此封閉GP Iba受體的藥物可以從初始階段就阻止血栓形成，能減少甚至防止溶栓藥物治療后的血栓再形成，并且加快血栓溶解。這類藥物同樣在對其他血管阻塞以及血栓栓塞性疾病的治療中有應(yīng)用前景。近年來，對血小板在血栓形成過程中分子機(jī)制研究促進(jìn)了分子靶向藥物的發(fā)展， 其中以針對血小板糖蛋白(GP) nb a/IIIa的單克隆抗體阿昔單抗(abciximab，Reopro)為代表，臨床應(yīng)用已取得了良好的抗血栓治療效果。然而，由于阿昔單抗也存在引起嚴(yán)重出血的潛在危險(xiǎn)，所以在一定程度上阻礙了這類藥物的臨床應(yīng)用。為了克服抗血栓藥物的缺陷，以抗血小板粘附為代表的尋找新的抗栓治療手段在國際上正方興未艾，人們試圖通過抑制膠原-血管性血友病因子(VWF)-血小板GPrta軸阻斷血小板與膠原的起始粘附，即在早期階段阻止血小板的黏附和活化，以達(dá)到阻止血栓形成的目的，并能減少出血的危險(xiǎn)性。因此，研制和開發(fā)阻斷血小板GPrt α與受損血管壁之間相互作用的單抗，不僅能從血栓形成的早期階段阻斷血栓的形成，而且希望能夠利用該單抗探究血小板如何通過 GPIba與血管性血友病因子Al區(qū)結(jié)合后，發(fā)生構(gòu)型改變，從而調(diào)節(jié)止血功能，從而進(jìn)一步闡明動脈血栓形成和發(fā)展的機(jī)理，為預(yù)防和早期治療血栓性疾病開辟新的領(lǐng)域，從而開發(fā)成新型的抗動脈血栓新藥。制備針對血小板膜糖蛋白GPrta的特異性單克隆抗體，通過阻斷血管性血友病因子Al區(qū)與血小板GPrta之間相互作用，是一種抑制血栓形成的有效方法。由于鼠源抗體在人體內(nèi)可能會誘導(dǎo)產(chǎn)生人抗鼠免疫反應(yīng)，這種反應(yīng)可能減弱或者破壞它的治療效果， 甚至可以在病人中引起變態(tài)反應(yīng)或超敏反應(yīng)，因此限制了在病人中的應(yīng)用。另外，在治療血栓栓塞性疾病時(shí)，常常需要反復(fù)給藥，這樣更增加了這些免疫反應(yīng)的發(fā)生概率。楊劍峰博士發(fā)表的學(xué)位論文《抗血小板膜糖蛋白Λ α單克隆抗體的人源化及基于膜糖蛋白結(jié)構(gòu)的活性小分子化合物研究》公開了一種抗血小板膜糖蛋白單克隆抗體，但是該抗體只識別人血小板膜糖蛋白Λα，與比格犬，獼猴等常用模式動物血小板無交叉反應(yīng)，限制了針對該抗體的各種成藥性評價(jià)研究。此外，鼠源抗體在人體內(nèi)可能會誘導(dǎo)產(chǎn)生人抗鼠免疫反應(yīng)，這種反應(yīng)可能減弱或者破壞它的治療效果，甚至可以在病人中引起變態(tài)反應(yīng)或超敏反應(yīng)，因此限制了在病人中的應(yīng)用。另外，在治療血栓栓塞性疾病時(shí)，常常需要持續(xù)用藥，這樣更增加了這些免疫反應(yīng)的發(fā)生概率。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的發(fā)明目的是提供一種抗人血小板膜糖蛋白Λα人鼠嵌合型單克隆抗體及其應(yīng)用。為達(dá)到上述發(fā)明目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是一種抗人血小板膜糖蛋白Λα 人鼠嵌合型單克隆抗體，包括鼠源重鏈可變區(qū)、鼠源輕鏈可變區(qū)；所述鼠源重鏈可變區(qū)的氨基酸序列如SEQ ID No. 1所示，所述鼠源輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列如SEQ ID No. 2所示。上述技術(shù)方案中，所述抗人血小板膜糖蛋白Λα人鼠嵌合型單克隆抗體還包括人源重鏈恒定區(qū)、人源輕鏈恒定區(qū)；其中，所述人源重鏈恒定區(qū)選自IgG( Yheavy chains) ,IgM(U)^IgA(Q), IgE ( O、IgD(S)五種同種型中的一種；所述人源輕鏈恒定區(qū)選自kappa或lambda中的一種；上述技術(shù)方案中，所述嵌合型單克隆抗體分子中的抗原結(jié)合區(qū)來自小鼠抗體，嵌合型單克隆抗體的恒定區(qū)部分來源于人免疫球蛋白。上述技術(shù)方案中，由于重鏈的不同亞型(如IgG的重鏈亞型)跟不同的效應(yīng)功能有關(guān)，因此要嵌合抗體產(chǎn)生所需的效應(yīng)功能，就要選擇相應(yīng)的重鏈恒定區(qū)，因此，所述人源重鏈恒定區(qū)優(yōu)選為IgGl(Y 1 heavy chains)、IgG3 ( γ 3)、IgG4 ( γ 4)三種亞類中的一種； 更優(yōu)選為IgGl的重鏈恒定區(qū)。上述技術(shù)方案中，所述人源輕鏈恒定區(qū)優(yōu)選為kappa的輕鏈恒定區(qū)。上述技術(shù)方案中，SEQ ID No. 1所示的氨基酸序列具體為EVQLQQSGPELVKLGASVKI SCKASGYSFTAYLMNWVKQSHGKSLEWIGRITPYNGDTFYNQKFKDKATLTVDKSSNTAHMELLSLTSEDSAVYFCG RSRYGNLYYYAMDYffGQGTSVTVSS ；SEQ ID No. 2 所示的氨基酸序列具體為DIVMSQSPSSQAVSIGEKVTMSCKSSQSLLYSSNQ KNYLAWFQQKPGQSPKLLIYWASTRESGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVKAEDLAVYYCQQYYSYPYTFGGGTKLEI KR。上述抗人血小板膜糖蛋白Λα人鼠嵌合型單克隆抗體的制備方法包括以下步驟首先獲得嵌合抗體的重鏈和輕鏈可變區(qū)基因，具體做法為利用特異性引物，分別擴(kuò)增出鼠源的抗血小板膜糖蛋白Λα的特異性的可變區(qū)序列(或者部分恒定區(qū)序列)。其次通過基因克隆的方法分別將擴(kuò)增獲得的重鏈及輕鏈可變區(qū)基因片段與相應(yīng)的人抗體的恒定區(qū)序列，正確連接，經(jīng)測序確認(rèn)后，成功構(gòu)建嵌合抗體的重鏈及輕鏈表達(dá)載體。最后，將含有重鏈和輕鏈基因的表達(dá)載體共轉(zhuǎn)染到能夠高表達(dá)目的基因產(chǎn)物的表達(dá)細(xì)胞，經(jīng)多輪特異性篩選后，獲得特異性表達(dá)目標(biāo)嵌合抗體的高表達(dá)細(xì)胞株，收集細(xì)胞培養(yǎng)上清，經(jīng)特異性純化后獲得目標(biāo)嵌合抗體。上述技術(shù)方案中，抗膜糖蛋白Λα的輕鏈和重鏈可變區(qū)的基因來源于表達(dá)特異性表達(dá)膜糖蛋白Λα的鼠源性單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株。例如，抗GPrta的嵌合抗體的可變區(qū)基因可以從表達(dá)針對GPrt α抗體的雜交瘤細(xì)胞中得到。本發(fā)明所用的雜交瘤細(xì)胞株是用活化的人血小板免疫小鼠，將抗體產(chǎn)生細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合產(chǎn)生雜交瘤細(xì)胞，亞克隆雜交瘤細(xì)胞，篩選表達(dá)抗血小板或GPrt α抗體的單克隆，獲得雜交瘤細(xì)胞株。上述技術(shù)方案中，恒定區(qū)基因可以用成熟的克隆技術(shù)從人抗體產(chǎn)生細(xì)胞中獲得。 另外，由于兩種輕鏈基因以及五種重鏈基因已經(jīng)被成功克隆，因此從這些克隆中就可以很容易得到人源的恒定區(qū)。通過設(shè)計(jì)嵌合重鏈基因的截短形式可以制備嵌合抗體的抗原結(jié)合片段如F(ab，)2和Fab。如編碼F(ab，)2重鏈部分的嵌合基因包含有CHl及重鏈鉸鏈區(qū)的DNA序列。另外，這種片段可以用酶切嵌合抗體的方法得到。例如，用木瓜蛋白酶或胃蛋白酶酶切可以分別得到Fab或F(ab，)2片段。上述技術(shù)方案中，通常將編碼輕鏈和重鏈的嵌合基因分別裝入兩個(gè)不同的表達(dá)載體，然后共轉(zhuǎn)染受體細(xì)胞。通常使用的受體細(xì)胞為骨髓瘤細(xì)胞和CHO細(xì)胞，這些細(xì)胞可以合成，裝配和分泌轉(zhuǎn)染的Ig基因編碼的免疫球蛋白，同時(shí)還擁有免疫球蛋白糖基化的功能。 目前CHO dhfr缺陷型細(xì)胞為常用的細(xì)胞株之一，因?yàn)橥ㄟ^適當(dāng)?shù)暮Y選方法，可以使插入的基因片斷在基因組中擴(kuò)增，從而提高抗體的表達(dá)量。每個(gè)載體含有兩個(gè)篩選基因(一個(gè)用于在細(xì)菌表達(dá)系統(tǒng)篩選，另一個(gè)用于在真核表達(dá)系統(tǒng)中篩選)，且兩個(gè)載體含有不同的一對基因。這些載體能在細(xì)菌中生產(chǎn)和擴(kuò)增融合基因，隨后共轉(zhuǎn)染真核細(xì)胞，篩選陽性細(xì)胞克隆。在載體中通常還帶入一個(gè)二氫葉酸還原酶(dhfr)基因，該基因表達(dá)產(chǎn)物即可以作為篩選指標(biāo)，又可以作為插入基因片斷擴(kuò)增的指標(biāo)。氨甲喋呤(MTX)是二氫葉酸還原酶(dhfr) 特異性抑制劑，細(xì)胞通過DHFR基因的擴(kuò)增實(shí)現(xiàn)對MTX藥物的適應(yīng)。更重要的是，擴(kuò)增的區(qū)域要遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于DHFR基因本身，即與DHFR基因鄰近的DNA也同時(shí)被擴(kuò)增。CHO DHFR缺陷型變異株在轉(zhuǎn)染表達(dá)外源基因時(shí)，可通過DHFR/MTX擴(kuò)增系統(tǒng)提高表達(dá)量。在含MTX的培養(yǎng)液中選擇培養(yǎng)，MTX的加壓作用使DHFR及其兩側(cè)基因序列擴(kuò)增，抗體基因也得以擴(kuò)增。因此， 通過MTX的濃度不斷增加，可以提高真核細(xì)胞中的免疫球蛋白基因的表達(dá)量。本發(fā)明同時(shí)要求保護(hù)一種高效表達(dá)該抗人血小板膜糖蛋白Λα人鼠嵌合型單克隆抗體的CHO細(xì)胞株，該CHO細(xì)胞株不同于普通貼壁生長的CHO細(xì)胞，具有可以懸浮培養(yǎng)的特性，該特性對于提高嵌合抗體的表達(dá)量具有重要意義。該CHO細(xì)胞株的保藏信息為保藏地址中國武漢武漢大學(xué)；保藏單位中國典型培養(yǎng)物保藏中心；保藏日期2011年11月10 日；保藏編號CCTCC No :C2011103 ；分類命名真核表達(dá)CHO細(xì)胞株SZ-138。上述技術(shù)方案中，所述抗人血小板膜糖蛋白Λα人鼠嵌合型單克隆抗體可作為抗血栓治療藥物應(yīng)用。該嵌合抗體(以及相應(yīng)的片段)可以在體外抑制血小板粘附和血栓形成，還可在實(shí)驗(yàn)動物體內(nèi)抑制由于血小板異常粘附，形成血小板血栓從而引起的循環(huán)血流改變。該抗體可以應(yīng)用于防止各種原因?qū)е碌难“逖ㄐ纬梢约把艹尚涡g(shù)后再形成血栓的情況，例如該抗體可用于哺乳動物或人體，可防止肺栓塞，短暫的缺血性中風(fēng)，深部靜脈血栓，冠狀動脈搭橋術(shù)后，手術(shù)植入修復(fù)瓣膜或血管(自體來源的，異體來源的，或人工合成的)等情況下血栓的形成；該發(fā)明的抗體還可以用于預(yù)防球囊擴(kuò)張術(shù)、冠狀動脈粥樣斑塊旋切、激光或者采用其他適當(dāng)方法進(jìn)行的血管成形術(shù)中的血小板聚集和血栓形成。 給藥時(shí)間可以在血管成形術(shù)前、術(shù)中和術(shù)后。這樣處理后可以防止血栓形成，因此相應(yīng)減少了血管成形術(shù)后血栓形成導(dǎo)致的死亡、心肌梗死以及必須再次實(shí)施PTCA或冠狀動脈搭橋手術(shù)治療等并發(fā)癥的發(fā)生。血栓形成并發(fā)癥有。例如在改良的獼猴R)lts模型中，給予嵌合抗血小板抗體(嵌合SZ138Fab抗體片段)作為輔助治療可以有效地抑制血小板聚集，發(fā)揮抗血栓作用。體外血小板瑞斯托霉素誘導(dǎo)血小板聚集試驗(yàn)結(jié)果顯示，可以呈劑量依賴的方式抑制特異性激動劑瑞斯托霉素誘導(dǎo)的血小板聚集。血小板聚集激活了凝血級聯(lián)反應(yīng)，產(chǎn)生了更加穩(wěn)定的纖維蛋白網(wǎng)狀組織和血凝塊，能夠被溶栓藥物溶解。為了預(yù)防和減輕溶栓治療后的血栓再形成以及加快血栓溶解， 該發(fā)明的抗體能單獨(dú)用于個(gè)體(如人)或者與其他溶栓藥物聯(lián)合用藥，如纖溶酶原激活劑 (組織型纖溶酶原激活劑，尿激酶，鏈激酶，重組組織型纖溶酶原激活劑)，抗凝或抗血小板藥物，如阿斯匹林、肝素、或香豆素類抗凝藥(如華法林)。聯(lián)合用藥時(shí)，該抗體或片段可以在溶栓藥物或抗凝藥物之前應(yīng)用，或可以兩者同時(shí)給藥，也可以在使用溶栓藥物或抗凝藥物之后給藥。給藥劑量應(yīng)足夠用來預(yù)防血小板聚集以及產(chǎn)生的血管再阻塞。抗體或抗體片段的有效劑量(能足夠抑制血小板聚集和血栓形成的劑量)可以溶于藥物接受的介質(zhì)，如無菌鹽水，經(jīng)胃腸外給藥，常用的是靜脈給藥?？贵w配方可以含有添加劑，如穩(wěn)定劑聚山梨醇酯80。抗體藥物可以用單一劑量，連續(xù)用完，或者分批輸入，如一次注射后再連續(xù)輸入。另外，抗體藥物還可以通過控制釋放(如使用多聚物或貼劑給藥系統(tǒng))的方式或其他合適的方法給藥。給藥劑量受不同因素影響，視臨床癥狀、個(gè)體體重、是否使用其他藥物(如溶栓藥物)而定。Reopro為已在歐美臨床上廣泛使用的抗血小板膜糖蛋白GPUb α/IIIa親和抗體 Fab片段，該片段為完整抗體經(jīng)木瓜蛋白酶消化后獲得，與親本鼠源性抗體相比，顯著減少了免疫反應(yīng)(Mol Immunol 1995 ;32 :1271-1281)。然而，人體內(nèi)不存在木瓜蛋白酶，所以 Reopro的C末段對人體為異種蛋白，74% (77/104)的正常人體內(nèi)存在可與Fab片段的C末段的反應(yīng)的 IgG 抗體(參見=Blood 2002 ；99 =2054-2059)。反復(fù)使用抗血小板抗體可以發(fā)生藥物誘導(dǎo)的血小板減少，這可能是由于抗體結(jié)合的血小板被人體視為外源蛋白，產(chǎn)生相應(yīng)的抗體，通過網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)被快速清除。由于血小板表面含有大量特異的GPnb α/IHa受體(約80000個(gè)受體每個(gè)血小板)以及血液循環(huán)中含有大量血小板(約0. 25-0. 5x 106/ml)，因此血小板減少是Reopro治療的重要并發(fā)癥。與GPIIb α/IIIa受體相比，血小板膜糖蛋白Λα作為抗栓治療的靶位點(diǎn)，理論上具有如下優(yōu)勢1. VWF-GPIb/IX/V相互作用是血小板粘附，以及隨后形成血小板為主的血栓的第一步；此外，目前尚未觀察到替代途徑。因此，抑制該途徑可有很強(qiáng)的抗栓效果。 2.VWF-GPIb/IX/V相互作用僅在高剪切力條件下的血小板粘附中起重要作用，針對該作用軸能夠更特異地發(fā)揮抗動脈血栓作用，并保持靜脈系統(tǒng)的止血功能不受或少受影響，減少臨床出血危險(xiǎn)的發(fā)生。3.阻斷血小板粘附到球囊擴(kuò)張后血管暴露出的VWF，可阻斷血小板活化以及隨后的血小板內(nèi)容物諸如血小板衍生的生長因子PDGF等的釋放。由于PDGF可影響平滑肌遷移和增殖，抑制血小板粘附到VWF可進(jìn)一步減輕再狹窄的發(fā)生。
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因此，本發(fā)明要求保護(hù)所述抗人血小板膜糖蛋白Λα人鼠嵌合型單克隆抗體。本發(fā)明同時(shí)要求保護(hù)上述抗人血小板膜糖蛋白Λα人鼠嵌合型單克隆抗體的可變區(qū)序列，所述可變區(qū)序列的重鏈氨基酸序列如SEQ ID No. 1所示，所述可變區(qū)序列的輕鏈氨基酸序列如SEQ ID No. 2所示。本發(fā)明同時(shí)要求保護(hù)具上述可變區(qū)氨基酸序列的分子，所述分子包括但不限于 免疫球蛋白全分子、抗體的片段Fab或(Fab’)2或單鏈抗體、與其它成分的融合體。同時(shí)要求保護(hù)所述抗人血小板膜糖蛋白Λα人鼠嵌合型單克隆抗體在制備抗血栓治療藥物中的應(yīng)用。血小板是血栓形成的關(guān)鍵成分，也是抗栓治療的重要靶位點(diǎn)。因此，基于本專利所涉及的抗人血小板膜糖蛋白Λα人鼠嵌合型單克隆抗體，可以開發(fā)出相應(yīng)的抗栓藥物，通過靜脈推注或滴注的方式作用于人體，抑制血小板與受損血管內(nèi)膜的異常粘附，從而阻斷血小板血栓形成，進(jìn)而應(yīng)用于用于PTCA(經(jīng)皮冠狀動脈干預(yù)手術(shù))和/或不穩(wěn)定性心絞痛患者，防止急性血栓的形成，減少心臟缺血事件的發(fā)生。此外，基于本專利所涉及的抗人血小板膜糖蛋白Λα人鼠嵌合型單克隆抗體的高親和力，經(jīng)放射性核素標(biāo)記后，可以檢測體內(nèi)或離體待測樣品中血栓。由于上述技術(shù)方案運(yùn)用，本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有下列優(yōu)點(diǎn)1.由于抗體分子的免疫反應(yīng)性主要由恒定區(qū)產(chǎn)生，因此含有人源性恒定區(qū)的嵌合抗體就不易在人體內(nèi)產(chǎn)生抗鼠的免疫反應(yīng)；2.本發(fā)明所述抗血小板GP Ib α單克隆抗體可以與人以及獼猴血小板膜糖蛋白 Iba (GP Iba)高特異性、高親合力結(jié)合，并且在獼猴體內(nèi)利用經(jīng)典的FOLTS模型證實(shí)了該單抗具有抗血栓作用；3.本發(fā)明所述抗血小板GP Iba嵌合單克隆抗體可以與血小板膜糖蛋白rt a (GP Ib a )高特異性、高親合力結(jié)合并具有抗血栓生物活性，因此可以用于PTCA(經(jīng)皮冠狀動脈干預(yù)手術(shù))和/或不穩(wěn)定性心絞痛時(shí)，防止急性血栓的形成，減少心臟缺血事件的發(fā)生。


該CHO細(xì)胞株的保藏信息為保藏地址中國武漢武漢大學(xué)；保藏單位中國典型培養(yǎng)物保藏中心；保藏日期2011年11月10日；保藏編號CCTCC No :C2011103 ；分類命名真核表達(dá)CHO細(xì)胞株SZ-138 ；圖1為實(shí)施例一中5’ RACE產(chǎn)物電泳圖，其中1號為輕鏈結(jié)果，2號為重鏈結(jié)果，M 為 DL2000Marker (分子量從上到下依次為 2000bp、IOOObp、750bp、500bp、250bp、IOObp)；圖2為實(shí)施例一中嵌合型抗體表達(dá)質(zhì)粒圖譜；圖3為實(shí)施例一中嵌合型抗體表達(dá)質(zhì)粒圖譜；圖4為實(shí)施例三中抗血小板GPrt α人鼠嵌合型抗體SZ-138的SDS-PAGE電泳圖；圖5為實(shí)施例三中經(jīng)木瓜蛋白酶消化后獲得Fab片段的SDS PAGE電泳圖；圖6為實(shí)施例四中流式細(xì)胞儀檢測鼠源性抗體與表達(dá)GPrt α的CHO細(xì)胞的結(jié)合比例；圖7為實(shí)施例四中流式細(xì)胞儀檢測嵌合型抗體與表達(dá)GPrt α的CHO細(xì)胞的結(jié)合比例；
圖8為實(shí)施例四中流式細(xì)胞儀檢測嵌合型抗體Fab片段體與表達(dá)GPrt α的CHO 細(xì)胞的結(jié)合比例；圖9為實(shí)施例五中SZ138及SZ138_Fab片段抑制瑞斯托霉素誘導(dǎo)的人血小板聚集
結(jié)果；圖10為實(shí)施例六中不同劑量chSZ138_Fab及生理鹽水對CFRs發(fā)生的抑制率。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合附圖及實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步描述實(shí)施例一嵌合型抗體真核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建1、單克隆抗體重鏈和輕鏈可變區(qū)cDNA的構(gòu)建抗人血小板糖蛋白GPrt α人鼠嵌合抗體SZ-138細(xì)胞株中抗體的可變區(qū)序列的克隆，采用 5’RACE(Rapid Amplification of cDNA Ends，快速擴(kuò)增 cDNA 末端)技術(shù)，從分泌抗人血小板GPrt α鼠單抗的雜交瘤細(xì)胞株SZ-2A中克隆功能性抗體的可變區(qū)序列。其步驟可簡述為由一個(gè)反義的基因特異性引物(GSPl)來合成cDNA第一鏈，cDNA第一鏈純化后，利用末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶(Terminal deoxynucleotidy transferase, TdT)在 cDNA 的3'末端加上一個(gè)合成的同聚核苷酸錨定序列。利用第二個(gè)巢式基因特異性引物(GSP2) 和一個(gè)與同聚核苷酸尾巴可以退火的錨定引物來擴(kuò)增cDNA。(1)材料和方法-雜交瘤細(xì)胞株SZ-2A分泌抗人血小板GPrtα單克隆抗體-大腸桿菌菌株 ToplO (Invitrogen 公司，Cat. No. C4040-03)-克隆載體 pGEM-T-easy vector (Promega 公司，Cat. No. A1360)-引物設(shè)計(jì)根據(jù)免疫球蛋白基因的特點(diǎn)，設(shè)計(jì)兩套分別對應(yīng)Ig和Kappa恒定區(qū)的基因特異性引物GSPl、GSP2，引物序列如下
SEQ ID No. 3 :pRace-H-GSPlGTCCACCKYGGTSYTGCTGGCYGGGTGSEQ ID No. 4 :pRace-H-GSP2GCACACYRCTGGACAGGGATCCAGAGTTCCSEQ ID No. 5 :pRace-K-GSPlACTTGACATTGATGTCTTTGSEQ ID No. 6 :pRace-K-GSP2CACGACTGAGGCACCTCCAGATG(2)結(jié)果1)5’ RACE產(chǎn)物電泳圖如圖1所示，其中1號為輕鏈結(jié)果，2號為重鏈結(jié)果。2)根據(jù)堿基序列與氨基酸編碼序列的相應(yīng)關(guān)系，分析PCR產(chǎn)物的閱讀框架，確定相應(yīng)可變區(qū)的氨基酸序列，其重鏈和輕鏈的序列分別如下所示SEQ ID No. 1，重鏈EVQLQQSGPELVKLGASVKISCKASGYSFTAYLMNWVKQSHGKSLEWIGRITPYNGDTFYNQKFKDKAT LTVDKSSNTAHMELLSLTSEDSAVYFCGRSRYGNLYYYAMDYWGQGTSVTVSS
SEQ ID No. 2，輕鏈IVMSQSPSSQAVSIGEKVTMSCKSSQSLLYSSNQKNYLAWFQQKPGQSPKLLIYWASTRESGVPDRFTG SGSGTDFTLTISSVKAEDLAVYYCQQYYSYPYTFGGGTKLEIKR ；根據(jù)免疫球蛋白基因的特點(diǎn)驗(yàn)證其為抗體序列。2、單克隆抗體重鏈和輕鏈可變區(qū)基因片段克隆于表達(dá)載體引物設(shè)計(jì)以NCBI數(shù)據(jù)庫中人源抗體的IgGl和kappa鏈的恒定區(qū)序列為模板，設(shè)
計(jì)兩對引物，分別克隆人源輕鏈及重鏈的恒定區(qū)序列，引物序列如下
權(quán)利要求
1.一種抗人血小板膜糖蛋白Λα人鼠嵌合型單克隆抗體，其特征在于，包括鼠源重鏈可變區(qū)、鼠源輕鏈可變區(qū)；所述鼠源重鏈可變區(qū)的氨基酸序列如SEQ ID No. 1所示，所述鼠源輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列如SEQ ID No. 2所示。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述抗人血小板膜糖蛋白Λα人鼠嵌合型單克隆抗體，其特征在于，所述抗人血小板膜糖蛋白Λα人鼠嵌合型單克隆抗體還包括人源重鏈恒定區(qū)、人源輕鏈恒定區(qū)；其中，所述人源重鏈恒定區(qū)選自IgG(Y重鏈、IgM(y)、IgA(a)、IgE(0、 IgD( δ )五種同種型中的一種；所述人源輕鏈恒定區(qū)選自kappa或lambda中的一種。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述抗人血小板膜糖蛋白Λα人鼠嵌合型單克隆抗體，其特征在于，所述人源重鏈恒定區(qū)為:1861(^1重鏈)、1863(^；3)、1864(^4)三種亞類中的一種。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述抗人血小板膜糖蛋白Λα人鼠嵌合型單克隆抗體，其特征在于，所述人源重鏈恒定區(qū)為IgGl的重鏈恒定區(qū)。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述抗人血小板膜糖蛋白Λα人鼠嵌合型單克隆抗體，其特征在于，所述人源輕鏈恒定區(qū)為kappa的輕鏈恒定區(qū)。
6.一種高效表達(dá)權(quán)利要求1所述抗人血小板膜糖蛋白Λα人鼠嵌合型單克隆抗體的 CHO細(xì)胞株，該CHO細(xì)胞株的保藏號為CCTCC N0:C2011103。
7.抗人血小板膜糖蛋白Λα人鼠嵌合型單克隆抗體的可變區(qū)序列，所述可變區(qū)序列的重鏈氨基酸序列如SEQ ID No. 1所示，所述可變區(qū)序列的輕鏈氨基酸序列如SEQ ID No. 2 所示。
8.具有權(quán)利要求7所述可變區(qū)序列的分子，所述分子為免疫球蛋白全分子、抗體的片段Fab或(Fab，)2或單鏈抗體。
9.權(quán)利要求8所述具有權(quán)利要求7所述可變區(qū)序列的分子與放射性核素或熒光發(fā)射基團(tuán)或與溶栓藥物以及與抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞生長的藥物的耦聯(lián)產(chǎn)物。
10.權(quán)利要求1所述抗人血小板膜糖蛋白Λα人鼠嵌合型單克隆抗體在制備抗血栓治療藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種具有與血小板膜糖蛋白的高特異性、高親合力結(jié)合并具有抗血栓生物活性的嵌合型單克隆抗體及其應(yīng)用；一種抗人血小板膜糖蛋白Ibα人鼠嵌合型單克隆抗體，其特征在于，包括鼠源重鏈可變區(qū)、鼠源輕鏈可變區(qū)；所述鼠源重鏈可變區(qū)的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，所述鼠源輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。由于抗體分子的免疫反應(yīng)性主要由恒定區(qū)產(chǎn)生，因此含有人源性恒定區(qū)的嵌合抗體就不易在人體內(nèi)產(chǎn)生抗鼠的免疫反應(yīng)；本發(fā)明所述抗血小板GP Ibα單克隆抗體可以與人以及獼猴血小板膜糖蛋白Ibα(GP Ibα)高特異性、高親合力結(jié)合，具有抗血栓作用。
文檔編號C12N5/10GK102558354SQ20111044197
公開日2012年7月11日 申請日期2011年12月26日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月26日
發(fā)明者季順東, 楊劍鋒, 江淼, 沈飛, 趙益明, 阮長耿 申請人:蘇州大學(xué)