專利名稱：一種肌內(nèi)脂肪沉積fitm2基因的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及動物分子育種的基因工程技術(shù)，特別是一種與豬肌內(nèi)脂肪沉積相關(guān)的誘導(dǎo)脂肪儲存跨膜蛋白 2 (Fat storage-inducing Transmembrane protein 2，F(xiàn)ITM2)基因技術(shù)。
背景技術(shù)：
近年來，由于豬的選育工作中過度追求高瘦肉率，導(dǎo)致豬肉品質(zhì)的嚴(yán)重下降。隨著生活水平的不斷提高，人們對豬肉顏色、嫩度、風(fēng)味等肉品質(zhì)特性的要求也越來越高。肌內(nèi)脂肪(intramuscular fat, IMF)是影響肉品質(zhì)的重要因素之一，目前已得到越來越多的認(rèn)識和重視。肌內(nèi)脂肪的沉積是一個復(fù)雜的生理生化過程，主要依賴于肌內(nèi)脂肪細(xì)胞的增殖、 分化和聚酯成熟。在脂肪細(xì)胞分化與增殖的過程中，細(xì)胞內(nèi)脂肪的合成、分解與轉(zhuǎn)運等過程決定甘油三酯的含量。細(xì)胞內(nèi)的甘油三酯主要存在于脂滴當(dāng)中，脂滴是維持細(xì)胞能量穩(wěn)衡的重要的細(xì)胞器。脂滴的核心是由甘油三酯和膽固醇酯形成的脂核，脂滴表面包被單層磷脂膜，且覆有多種蛋白。細(xì)胞內(nèi)脂滴儲存脂肪的過程是最基本的生物學(xué)過程，但是細(xì)胞內(nèi)脂肪如何被“打包”形成脂滴，即細(xì)胞是如何調(diào)控磷脂蛋白層包裝脂肪成為脂滴一直未得到滿意的解釋。誘導(dǎo)脂肪儲存跨膜蛋白(Fatstorage-inducing transmembrance protein, FITM) I 和 2 基因，又稱 FITl 和 FIT2 (Fat-inducing transcript I and 2)，是兩個將脂肪包被成脂滴的關(guān)鍵基因。FITM基因與脂肪的合成無關(guān)，但是在脂滴儲存方面卻發(fā)揮了重要的作用。研究發(fā)現(xiàn)，在人類細(xì)胞中，過度表達(dá)FITM基因會導(dǎo)致脂肪儲存明顯增加，在小鼠體內(nèi)敲除FITM基因會明顯減少脂滴內(nèi)的脂肪儲存。在人體細(xì)胞中過表達(dá)FITMl和FITM2， 發(fā)現(xiàn)過表達(dá)細(xì)胞與正常細(xì)胞在脂肪合成速率方面沒有任何差別，但在脂滴儲存方面，過表達(dá)細(xì)胞中的脂滴數(shù)量是正常細(xì)胞的4一 6倍，這些研究進(jìn)一步證明了該基因在脂肪儲存過程中的重要性。FITM2基因在人、豬、鼠等動物中已被定位和標(biāo)記。由于FITM基因編碼的蛋白較小，所以關(guān)于其功能的研究并不多。研究揭示FITM2編碼的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)包含多個跨膜區(qū)域， 這樣的特殊結(jié)構(gòu)與脂滴的包被形成密切相關(guān)。隨著FITM基因在脂肪滴打包形成過程中的重要作用被發(fā)現(xiàn)，針對FITM基因的研究引起了學(xué)界的重視。最新的研究顯示FITM2基因在骨骼肌能量代謝的調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用，且參與了骨骼肌內(nèi)的脂滴形成。因此，F(xiàn)ITM2基因的研究對調(diào)控畜禽肌肉能量代謝及肌內(nèi)脂肪蓄積，改善肌肉品質(zhì)具有重要的意義。目前 FITM2基因的表達(dá)對豬肌內(nèi)脂肪沉積和脂類代謝的影響及調(diào)節(jié)機(jī)理，國內(nèi)外尚未見報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種肌內(nèi)脂肪沉積FITM2基因，采用基因芯片技術(shù)和生物信息學(xué)分析方法，在對豬肌肉組織和肌內(nèi)脂肪細(xì)胞基因表達(dá)譜的研究中發(fā)現(xiàn)FITM2基因參與肌內(nèi)脂肪含量相關(guān)，并首次從版納微型豬肌肉組織中克隆了 FITM2基因。
具體為
一種肌內(nèi)脂肪沉積FITM2基因，是從版納微型豬肌肉組織中分離、克隆的與肌內(nèi)脂肪沉積相關(guān)的誘導(dǎo)脂肪儲存跨膜蛋白2 (Fat storage-inducing Transmembrane protein 2，F(xiàn)ITM2)基因?；虻腃DS序列全長為789bp,其CDS核苷酸序列如SEQ. ID. NO. 1，并且， CDS核苷酸序列編碼262個氨基酸，氨基酸序列如SEQ. ID. NO. 2。對上述特征的肌內(nèi)脂肪沉積FITM2基因設(shè)計引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，檢測FITM2基因在豬心、肝、脾、肺、腎、肌肉和脂肪七個組織的組織表達(dá)譜，結(jié)果顯示FITM2基因在脂肪組織中表達(dá)量最高，初步表明FITM2基因在脂肪細(xì)胞中調(diào)控脂肪沉積的功能。豬是脂肪沉積型動物，其脂肪沉積能力在不同品種之間變化很大。我國一些肉質(zhì)優(yōu)良的地方豬種是最寶貴和稀缺的基因資源，這在優(yōu)質(zhì)豬肉的培育中有獨特的利用價值。 版納微型豬是云南省優(yōu)良的地方豬種，具有耐粗飼、適應(yīng)性強、肉質(zhì)優(yōu)良、肌內(nèi)脂肪豐富，肌纖維細(xì)密，肉質(zhì)鮮嫩等優(yōu)良特性。然而，目前對版納微型豬的生長發(fā)育及肌內(nèi)脂肪沉積的分子機(jī)制知之甚少。本發(fā)明采用基因芯片技術(shù)和生物信息學(xué)分析方法，在對豬肌肉組織和肌內(nèi)脂肪細(xì)胞基因表達(dá)譜的研究中發(fā)現(xiàn)FITM2基因在一定程度上決定著肌內(nèi)脂肪含量，并首次從版納微型豬肌肉組織中克隆了 FITM2基因。因此，研究版納微型豬FITM2基因的序列與表達(dá)模式，分析其核苷酸和氨基酸序列結(jié)構(gòu)，從分子水平了解版納微型豬肌內(nèi)脂肪沉積較多的規(guī)律，為進(jìn)一步研究該基因的功能及為改善豬胴體脂肪性狀的育種工作提供理論基礎(chǔ)。本發(fā)明克隆得到版納微型豬FITM2基因CDS全序列，全長為789bp，提交到 Genbank，登錄號為JN630475。與Genbank提供的豬FITM2基因相比較，發(fā)現(xiàn)有兩個核苷酸突變位點，其中一個為有義突變，導(dǎo)致第245位氨基酸由胱氨酸突變?yōu)榻z氨酸。FITM2蛋白在物種間的同源性較高，豬與牛的親緣性較近，其次是人、小鼠、大鼠。 豬FITM2蛋白氨基酸序列與牛、人、小鼠和大鼠的同源性分別為93%、91%、87%和87%。FITM2 蛋白在不同物種間的高度保守性提示它們功能的重要性，這些基因的保守性也是FITM2在各個物種中相應(yīng)的生理特點保持不變的分子基礎(chǔ)。另外，F(xiàn)ITM2在脂肪組織中的最高量表達(dá)，也證明了它在肌內(nèi)脂肪沉積等方面的重要作用。


圖I是本發(fā)明的PCR擴(kuò)增FITM2基因圖示。圖2是本發(fā)明的FITM2基因在不同組織中的表達(dá)水平柱圖。圖3是本發(fā)明的FITM2基因酶切鑒定圖示。圖4是本發(fā)明的進(jìn)化樹分析圖。圖5是本發(fā)明的FITM2蛋白二級結(jié)構(gòu)預(yù)測圖。圖6是本發(fā)明的FITM2蛋白磷酸化位點預(yù)測圖。圖7是本發(fā)明的FITM2蛋白糖基化位點預(yù)測圖。圖8是本發(fā)明的FITM2蛋白疏水性分析圖。圖9是本發(fā)明的FITM2蛋白的信號肽預(yù)測圖。圖10是本發(fā)明的FITM2蛋白質(zhì)的跨膜螺旋分析圖。圖11是本發(fā)明的FITM2蛋白質(zhì)的跨膜區(qū)分析圖。
具體實施例方式一種肌內(nèi)脂肪沉積FITM2基因，是從版納微型豬肌肉組織中分離、克隆的與肌內(nèi)脂肪沉積相關(guān)的誘導(dǎo)脂肪儲存跨膜蛋白2 (Fat storage-inducing Transmembrane protein 2，F(xiàn)ITM2)基因?；虻腃DS序列全長為789bp，其CDS核苷酸序列如SEQ. ID. NO. 1，并且，⑶S核苷酸序列編碼262個氨基酸，氨基酸序列如SEQ. ID. NO. 2。對上述特征的肌內(nèi)脂肪沉積FITM2基因設(shè)計引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，檢測FITM2基因在豬心、肝、脾、肺、 腎、肌肉和脂肪七個組織的組織表達(dá)譜，結(jié)果顯示FITM2基因在脂肪組織中表達(dá)量最高，初步表明FITM2基因在脂肪細(xì)胞中調(diào)控脂肪沉積的功能。具體為
I、肌肉組織中總RNA的提取
采取50kg成年版納微型豬肌肉組織立即放入液氮中保存?zhèn)溆?。利用RNA提取試劑提取版納微型豬肌肉組織總RNA，具體操作參照試劑盒說明進(jìn)行。將提取的RNA反轉(zhuǎn)錄成 cDNA，_20°C保存，待用。2、PCR引物設(shè)計及PCR反應(yīng)條件
根據(jù) GenBank 中豬 FITM2 序列信息(GenBank 登錄號 NM_001128460. I),利用 Primer Premier 5.0設(shè)計引物，并合成。用于克隆的FITM2基因的引物序列為
F :5，- GGCATGGAGCACCTGGAG -3，
R:5’ - CCCTTGTGCACCTCTTTTATC -3’
用于熒光定量的FITM2基因的引物序列為
F :5，- AGGTGAAGACGGACCGAAGC -3，
R :5，- AGCCCAGTAGCCCGAACA -3，
內(nèi)參18S rRNA的引物序列為
F :5’ -CTGCCTTCCTTGGATGTG -3’
R :5’ -GCGGCTTTGGTGACTCTA -3’
FITM2基因克隆的PCR反應(yīng)條件為94°C預(yù)變性4min ;94°C變性30s、54. 2°C退火 30s,72°C延伸30s 35個循環(huán)；72°C后延伸IOmin進(jìn)行擴(kuò)增，產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定其亮度和特異性。通過PCR擴(kuò)增，得到了長度為808bp的片段。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)I. 5%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，確認(rèn)擴(kuò)增的產(chǎn)物的長度大小同于目的片段大小。熒光定量PCR的反應(yīng)條件為95°C預(yù)變性30s ;95 °C變性5 s，65°C退火30s、 72°C延伸30 s，40個循環(huán)。數(shù)據(jù)處理的方法為，檢測心、肝、脾、肺、腎、肌肉、脂肪七個組織中FITM2基因的相對表達(dá)量，實驗數(shù)據(jù)以18S rRNA作為內(nèi)參，采用雙標(biāo)準(zhǔn)曲線法處理。結(jié)果顯示，F(xiàn)ITM2在被檢測的7個組織中都有表達(dá)，在脂肪組織中高量表達(dá)，在腎、肌肉、肺和脾中大量表達(dá)，在心和肝中少量表達(dá)。3、FITM2基因的克隆及序列分析
按照瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒書說明書回收特異性條帶，產(chǎn)物連接于pMD-18T載體，轉(zhuǎn)化至ToplO感受態(tài)細(xì)胞，氨芐篩選挑取陽性克隆，分別接種于IOmL LB液體培養(yǎng)基中， 37°C振蕩過夜，提取質(zhì)粒經(jīng)Ecor I和Hind III雙酶切鑒定為陽性，進(jìn)行測序。4、測序結(jié)果
5所得到的版納微型豬FITM2編碼區(qū)(CDS)全長789bp，核苷酸序列如說明書核苷酸和氨基酸序列表SEQ. ID. NO. I所示，并提交到Genbank數(shù)據(jù)庫，登錄號為JN630475。⑶S序列編碼262個氨基酸，其氨基酸序列如說明書核苷酸和氨基酸序列表SEQ. ID. NO. 2所示。5、測序結(jié)果與Genbank中提供的序列比對
登錄http://www. ebi. ac. uk/Tools/clustalw2/,以版納微型豬的核苷酸序列同 GeneBank中豬FITM2基因(登錄號為NM_001128460. I)的⑶S序列進(jìn)行序列比對。結(jié)果發(fā)現(xiàn)有兩個突變位點，即第324位核苷酸由G變成A，第733位由G變?yōu)锳。第二個為有義突變，導(dǎo)致氨基酸序列發(fā)生相應(yīng)變化，即第245位的氨基酸由G (胱氨酸)突變?yōu)镾 (絲氨酸)。核苷酸序列和氨基酸序列比對詳見說明書核苷酸和氨基酸序列表。6、FITM2基因核苷酸與氨基酸序列同源性分析
登錄 http://www. ebi. ac. uk/Tools/clustalw2/,以版納微型豬 FITM2 基因測序結(jié)果與牛(登錄號為NM_001103095. I)、人(登錄號為NM_001080472. I)、小鼠(登錄號為 NM_173397. 4)和大鼠(登錄號為NM_001107799. 1)FITM2基因的核苷酸和氨基酸序列比對分析，結(jié)果顯示版納微型豬與牛、人、小鼠和大鼠的FITM2基因的CDS序列同源性分別為 92%,88%,85%和86% ;CDS序列所編碼氨基酸的同源性分別為93%、91%、87%和87%。CDS序列的同源性和CDS序列編碼氨基酸的同源性比較詳見說明書核苷酸和氨基酸序列表。7、FITM2基因的進(jìn)化樹分析
利用Meg4軟件的鄰近(Neighbor-joining)方法構(gòu)建版納微型豬(Genbank登錄號 JN630475)、牛(登錄號為NM_001103095. I)、人(登錄號為NM_001080472. I)、小鼠(登錄號為NM_173397. 4)和大鼠(登錄號為NM_001107799. 1)FITM2蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化樹，結(jié)果顯示版納微型豬與人的親緣性較近，其次是牛、小鼠、大鼠。8、FITM2蛋白分子量、等電點預(yù)測分析
使用ExPASy的在線軟件Compute pi/MW分析版納微型豬FITM2蛋白的等電點(pi)為 9. 05、理論分子量(pW)為 29662. 73 Da。9、FITM2蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)預(yù)測分析
登陸http://bioinf. cs. ucl. ac. uk/psipred/,對版納微型豬FITM2蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測，共有153個螺旋、2個伸展鏈和107個卷曲結(jié)構(gòu)。10、FITM2蛋白質(zhì)磷酸化位點預(yù)測
登陸 http://www. cbs. dtu. dk/services/NetPhos/,對豬 FITM2 蛋白質(zhì)憐酸化位點進(jìn)行預(yù)測，結(jié)果顯示，共有11個磷酸化位點，其中絲氨酸磷酸化位點有5個、蘇氨酸磷酸化位點有3個、酪氨酸磷酸化位點有3個。11、FITM2蛋白質(zhì)糖基化位點預(yù)測
登錄 http://www. cbs. dtu. dk/services/NetNGlyc/,對版納微型豬 FITM2 蛋白糖基化位點預(yù)測，結(jié)果顯示FITM2蛋白在第215位有I個糖基化位點。12、FITM2蛋白質(zhì)疏水性分析
登陸http://web. expasy. org/protscale/,對FITM2蛋白質(zhì)疏水性進(jìn)行分析,結(jié)果顯不為未水性蛋白。13、FITM2蛋白質(zhì)信號肽的預(yù)測分析
登陸 http://www. cbs. dtu. dk/services/SignalP/,對 FITM2 蛋白的信號肽進(jìn)行預(yù)測。采用signalP-ΝΝ方法預(yù)測，F(xiàn)ITM2蛋白序列存在一個可能的信號肽結(jié)構(gòu)，且分割位點在第 29至30個氨基酸之間，即第I至29位氨基酸為信號肽。用signalP-HMM方法預(yù)測則顯示信號肽可能存在的分割位點在第38至39個氨基酸之間。14、FITM2蛋白質(zhì)的跨膜螺旋分析
登陸 http://www. ch. embnet. org/software/TMPRED_form. html,對 FITM2 蛋白的跨膜螺旋進(jìn)行預(yù)測。結(jié)果顯示在FITM2蛋白質(zhì)氮末端有6個跨膜螺旋在31- 49 (19)位氨基酸、104-120(17)位氨基酸有跨膜螺旋，方向從外到內(nèi)；在67- 87 (21)位氨基酸、 160-181(22)位氨基酸、194-214 (21)位氨基酸、228-247 (20)位氨基酸有跨膜螺旋，方向從內(nèi)到外。15、FITM2蛋白質(zhì)的跨膜區(qū)分析
登陸 http://www. cbs. dtu. dk/services/TMHMM/,對 FITM2 蛋白質(zhì)跨膜區(qū)進(jìn)行分析，結(jié)果顯示FITM2蛋白質(zhì)有4個跨膜區(qū)，分別為第55至77位氨基酸區(qū)域、第92至114位氨基酸區(qū)域、第183至205位氨基酸區(qū)域和第220至239位氨基酸區(qū)域。
權(quán)利要求
1.一種肌內(nèi)脂肪沉積FITM2基因，是從版納微型豬肌肉組織中分離、克隆的與肌內(nèi)脂肪沉積相關(guān)的誘導(dǎo)脂肪儲存跨膜蛋白2 (Fat storage-inducing Transmembrane protein 2，F(xiàn)ITM2)基因，其特征在于基因的⑶S序列全長為789bp，其⑶S核苷酸序列如SEQ. ID. NO. 1，并且，⑶S核苷酸序列編碼262個氨基酸，氨基酸序列如SEQ. ID. NO. 2。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述一種肌內(nèi)脂肪沉積FITM2基因，其特征在于對上述特征的肌內(nèi)脂肪沉積FITM2基因設(shè)計引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，檢測FITM2基因在豬心、肝、脾、肺、腎、肌肉和脂肪七個組織的組織表達(dá)譜，結(jié)果顯示FITM2基因在脂肪組織中表達(dá)量最高，初步表明FITM2基因在脂肪細(xì)胞中調(diào)控脂肪沉積的功能。
全文摘要
本發(fā)明公開一種肌內(nèi)脂肪沉積FITM2基因，是從版納微型豬肌肉組織中分離、克隆的與肌內(nèi)脂肪沉積相關(guān)的誘導(dǎo)脂肪儲存跨膜蛋白2(Fatstorage-InducingTransmembraneprotein2,FITM2)基因，基因的CDS序列全長為789bp,其CDS核苷酸序列如SEQ.ID.NO.1。并且，CDS核苷酸序列編碼262個氨基酸，氨基酸序列如SEQ.ID.NO.2。檢測FITM2基因在豬心、肝、脾、肺、腎、肌肉和脂肪七個組織的組織表達(dá)譜，結(jié)果顯示FITM2基因在脂肪組織中表達(dá)量最高，初步表明FITM2基因在脂肪細(xì)胞中調(diào)控脂肪沉積的功能。
文檔編號C12Q1/68GK102586255SQ20111041849
公開日2012年7月18日 申請日期2011年12月15日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月15日
發(fā)明者楊明華, 潘洪彬, 王靜, 趙素梅, 高士爭, 黃英 申請人:云南農(nóng)業(yè)大學(xué)