專利名稱：錳氧化微生物的分離、篩選方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種錳的氧化微生物的篩選方法。
背景技術(shù)：
金屬作為一種重要的材料在現(xiàn)代工業(yè)和日常生活中占據(jù)了極為重要的地位，但是也正是因?yàn)榻饘俚膹V泛使用造成了現(xiàn)在日趨嚴(yán)重的水體和土壤的重金屬污染。重金屬污染的治理已經(jīng)刻不容緩。以錳為例，它不僅在現(xiàn)代工業(yè)領(lǐng)域扮演著極其重要的角色，而且也是一種維持機(jī)體正常代謝的重要微量元素。在工業(yè)上，錳礦石廣泛應(yīng)用于冶金、化工、玻璃、陶瓷等產(chǎn)業(yè)中。但錳元素作為一種重金屬元素，過(guò)多得攝入會(huì)嚴(yán)重危害機(jī)體的健康，我國(guó)生活飲用水衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定錳含量不超過(guò)0. lmg/L,國(guó)家最低排放標(biāo)準(zhǔn)為ang/L。我國(guó)很多地區(qū) (尤其是錳礦石開(kāi)采和錳礦石加工周邊地區(qū))至今仍無(wú)法嚴(yán)格達(dá)到這一國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)，亟待采取合理的方法來(lái)治理水土中的錳污染。本發(fā)明以錳金屬污染為出發(fā)點(diǎn)，就轉(zhuǎn)化可溶性有毒的Mn(II)為不溶性無(wú)毒的 Mn(III)和Mn(IV)過(guò)程中氧化微生物發(fā)揮的重要作用為契機(jī)，研究了氧化微生物的分離和鑒別的方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的，是提供一種錳的氧化微生物的篩選和分離方法，該方法可以將土壤中的重金屬錳離子如Mn(II)，通過(guò)生物氧化降低土壤中的重金屬錳離子的含量，利于降低重金屬錳如Mn(II)在土壤中的環(huán)境污染。本發(fā)明的目的是這樣實(shí)現(xiàn)的錳氧化微生物的分離、篩選的方法有以下步驟1)取錳礦石表面物質(zhì)，加去離子水?dāng)嚢?，制成原菌懸液，將原菌懸液均勻涂布在固體PYCM培養(yǎng)基平板上；幻在25 恒溫下培養(yǎng)1 2天，挑取單菌落劃線純化，在固體PYCM培養(yǎng)基中25 培養(yǎng)，得到錳氧化微生物待選菌株，在溫度為4°C條件下保藏；3)步驟幻所得錳氧化微生物待選菌株，在液體PYCM培養(yǎng)基，光通量為630Lm，搖床轉(zhuǎn)速為150-230r/min，溫度為25_30°C，培養(yǎng)2_4天，測(cè)定培養(yǎng)液中錳離子的含量變化，篩選出錳氧化微生物。培養(yǎng)基中將錳離子濃度降低的為錳氧化微生物，其中將錳離子濃度降得最低的為錳氧化微生物優(yōu)勢(shì)菌株。步驟3)所述搖床轉(zhuǎn)速較好的為200r/min.步驟3)所述溫度較好的為30°C。所述固體PYCM培養(yǎng)基的成分和組成為蛋白胨0. 8g ；酵母膏0. 2g ；MnSO4 · H2O 0. 2g ；K2HPO4 0. Ig ；MgSO4 · 7H20 0. 2g ；NaNO3 0. 2g ；CaCl2 0. Ig ；NH4HCO3 0. Ig ；力口水 lOOOmL，調(diào)pH值為6. 8 7. 2，固體培養(yǎng)基則加瓊脂1. 8%。
所述液體PYCM培養(yǎng)基的成分和組成為蛋白胨0. 8g ；酵母膏0. 2g ；MnSO4 · H2O 0. 2g ；K2HPO4 0. Ig ；MgSO4 · 7H20 0. 2g ；NaNO3 0. 2g ；CaCl2 0. Ig ；NH4HCO3 0. Ig ；力口水 IOOOmL, il pH 值為 6. 8 7. 2。本發(fā)明方法有以下優(yōu)點(diǎn)(1)分離自錳礦區(qū)軟錳礦石表面的細(xì)菌群體中的細(xì)菌，可以將Mn(II)氧化為更高價(jià)態(tài)的 Mn(III)禾Π Mn (IV)。(2)錳礦區(qū)軟錳礦石表面的細(xì)菌群體中的細(xì)菌在正常狀態(tài)下其錳氧化能力較強(qiáng)。本發(fā)明所述方法可以將土壤中的重金屬錳離子如Mn(II)，通過(guò)生物氧化降低土壤中的重金屬錳離子的含量，使土壤中錳離子濃度降低65%，采用本發(fā)明方法可以降低能重金屬錳如Mn(II)在土壤中的環(huán)境污染。下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步的說(shuō)明，但本發(fā)明不僅限于這些例子。


圖1為I型和II型錳氧化微生物菌種，其中，a為I型錳氧化微生物菌種，b為II 型錳氧化微生物菌種；圖2為錳標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。
具體實(shí)施例方式一 .試劑和儀器1.菌種來(lái)源本實(shí)驗(yàn)使用的錳氧化菌種來(lái)自于重慶市秀山縣(孝溪鄉(xiāng)細(xì)沙村，是否需要具體地址)錳礦地區(qū)軟錳礦石的表面。2.實(shí)驗(yàn)用培養(yǎng)基PYCM 培養(yǎng)基[12]蛋白胨 0. 8g ；酵母膏 0. 2g ；MnSO4 · H2O 0. 2g ；K2HPO4 0. Ig ； MgSO4 · 7H20 0. 2g ；NaNO3 0. 2g ；CaCl2 0. Ig ；NH4HCO3 0. Ig ；加水 IOOOmL, il pH 值為 6. 8 7. 2，固體培養(yǎng)基則加瓊脂1. 8%，濕熱滅菌后使用。該培養(yǎng)基既可用于培養(yǎng)細(xì)菌菌株也用于菌種保藏。本發(fā)明所用試劑均采用市售的化學(xué)純產(chǎn)品。3.分析測(cè)試方法(1)菌體形態(tài)觀察簡(jiǎn)單染色法和革蘭氏染色法、光學(xué)顯微鏡(2)Mn2+離子濃度的測(cè)定方法甲醛肟分光光度法(3)細(xì)菌生長(zhǎng)測(cè)定方法分光光度法4實(shí)驗(yàn)儀器及設(shè)備(1) DHZ-032R 型搖床(2) TCYQ DDHZ-300 型搖床(3)TG16_W微量高速離心機(jī)(4) WFZ UV-2000型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(5)普通電冰箱(6)LDZX-40BI型立式自動(dòng)電熱壓力蒸汽滅菌器
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(7) DHG-9140型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱 (8)數(shù)字生物顯微鏡(最大放大倍數(shù)1000倍)(9) DNP-9162型電熱恒溫培養(yǎng)箱(10) AL204型電子天平(Il)SHZ-D(III)循環(huán)水式真空泵(12) Sff-CJ-IF型潔凈工作臺(tái)二 .錳氧化微生物待選菌株的分離純化和保藏1.刮取軟錳礦石表面物質(zhì)(取自重慶市秀山縣孝溪鄉(xiāng)細(xì)沙村錳礦地區(qū)的軟錳礦石)，加入去離子水后攪拌即成原菌液。再在潔凈工作臺(tái)上用涂布法將菌液均勻涂布在平板培養(yǎng)基表面，取用3個(gè)平板，每個(gè)平板涂布不同的菌液量，以此代替梯度稀釋。之后便可將其放置于恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)保持培養(yǎng)1 2天。2.純化。經(jīng)過(guò)2-3天的培養(yǎng)，分離用培養(yǎng)皿中會(huì)長(zhǎng)出多種形態(tài)的菌落，用接種針挑出其中的一種特定的菌株并將其劃線培養(yǎng)在另一空白PYCM培養(yǎng)皿上，嚴(yán)格操作，選取明顯無(wú)污染菌落，為防止失敗每種菌要有重復(fù)，以要保證每一個(gè)培養(yǎng)皿中都只含有一種菌株。操作完成后將這些培養(yǎng)皿放置于恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)保持培養(yǎng)。3.菌種保藏。 將純化培養(yǎng)基中已經(jīng)長(zhǎng)出的菌株用接種針挑出，劃線培養(yǎng)于PYCM斜面試管中(恒溫培養(yǎng)箱，28°C )。待斜面試管中長(zhǎng)出菌落后便將這批試管轉(zhuǎn)入4°C冰箱中保藏。4 染色。(1)涂片取潔凈的載片一張，將其在火焰上微微加熱，除去上面的油脂，冷卻，在中央部位滴加一小滴無(wú)菌水，用接種環(huán)在火焰旁從斜面上挑取少量菌體(無(wú)菌操作)與水混合。燒去環(huán)上多余的菌體后，再用接種環(huán)將菌體涂成直徑約Icm的均勻薄層。(2)干燥涂布后，待其自然干燥。(3)固定將已干燥的涂片標(biāo)本向上，在微火上通過(guò)3至4次進(jìn)行固定。固定的作用為殺死細(xì)菌；使菌體蛋白質(zhì)凝固，菌體牢固粘附于載片上，染色時(shí)不被染液或水沖掉；增加菌體對(duì)染料的結(jié)合力，使涂片易著色。
(4)染色在涂片處滴加草酸銨結(jié)晶紫溶液1至2滴，使其布滿涂菌部分，染色lmin。(5)沖洗斜置載片，傾去染液。用水輕輕沖去染液，至流水變清。(6)吸干用吸水紙輕輕吸去載片上的水分，干燥后鏡檢。(7)鏡檢將染色的標(biāo)本，先用低倍鏡找到目的物，將低倍鏡轉(zhuǎn)開(kāi)，滴加一小滴液體石蠟于涂片處，用油鏡進(jìn)行觀察。
5革蘭氏染色(1)制片取活躍生長(zhǎng)期菌種按常規(guī)方法涂片(不宜過(guò)厚)、干燥和固定。(2)初染滴加草酸銨結(jié)晶紫染液覆蓋涂菌部位，染色1至aiiin后傾去染液，水洗至流出水無(wú)色。(3)媒染先用革氏碘液沖去殘留水跡，再用碘液覆蓋lmin，傾去碘液，水洗至流出水無(wú)色。(4)脫色將玻片上殘留水用吸水紙吸去，在白色背景下用滴管流加95%乙醇脫色(一般20 至30s)，當(dāng)流出液無(wú)色時(shí)立即用水洗去乙醇。脫色是革蘭氏染色的關(guān)鍵，必須嚴(yán)格掌握乙醇的脫色程度。若脫色過(guò)度則陽(yáng)性菌被誤染為陰性菌；而脫色不夠時(shí)陰性菌被誤染為陽(yáng)性菌。(5)復(fù)染將玻片上殘留水用吸水紙吸去，用蕃紅復(fù)染液染色aiiin，水洗，吸去殘水晾干。(6)鏡檢油鏡觀察。通過(guò)上述方法分離出I型和II型兩種不同的錳氧化微生物菌種(參見(jiàn)圖1)，這兩種菌種的特征如下表表1初篩菌落形態(tài)特征
權(quán)利要求
1.一種錳氧化微生物的分離、篩選的方法，其特征在于有以下步驟1)取錳礦石表面物質(zhì)，加去離子水?dāng)嚢瑁瞥稍鷳乙?，將原菌懸液均勻涂布在固體 PYCM培養(yǎng)基平板上；2)在25 恒溫下培養(yǎng)1 2天，挑取單菌落劃線純化，在固體PYCM培養(yǎng)基中25 培養(yǎng)，得到錳氧化微生物待選菌株，在溫度為4°C條件下保藏；3)步驟幻所得錳氧化微生物待選菌株，在液體PYCM培養(yǎng)基，光通量為630Lm，搖床轉(zhuǎn)速為150-230r/min，溫度為25-30°C條件下，培養(yǎng)2_4天，測(cè)定培養(yǎng)液中錳離子的含量變化， 篩選出錳氧化微生物。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的錳氧化微生物的分離、篩選的方法，其特征在于培養(yǎng)液中將錳離子濃度降低的為錳氧化微生物，其中錳離子濃度降得最低的為錳氧化微生物優(yōu)勢(shì)菌株。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的錳氧化微生物的分離、篩選的方法，其特征在于步驟3)所述搖床轉(zhuǎn)速為200r/min。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的錳氧化微生物的分離、篩選的方法，其特征在于步驟3)所述溫度為30°C。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種錳氧化微生物的分離、篩選的方法，有以下步驟取錳礦石表面物質(zhì)，加去離子水?dāng)嚢?，制成原菌懸液，將原菌懸液均勻涂布在固態(tài)PYCM培養(yǎng)基平板上；25～28℃恒溫下培養(yǎng)1～2天，挑取單菌落劃線純化，固體PYCM培養(yǎng)基25～28℃培養(yǎng)，得到錳氧化微生物待選菌株，在溫度為4℃條件下保藏；所得錳氧化微生物待選菌株，在液體PYCM培養(yǎng)基，光通量為630Lm，搖床轉(zhuǎn)速為150-230r/min，溫度為25-30℃，培養(yǎng)2-4天，測(cè)定培養(yǎng)液中錳離子的含量變化，篩選出錳氧化微生物。該方法可以將土壤中的錳離子如Mn(II)，通過(guò)生物氧化降低錳離子的含量，利于降低錳如Mn(II)在土壤中的環(huán)境污染。
文檔編號(hào)C12N1/02GK102517231SQ201110418370
公開(kāi)日2012年6月27日 申請(qǐng)日期2011年12月14日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月14日
發(fā)明者王萬(wàn)能 申請(qǐng)人:重慶理工大學(xué)