用于適配子篩選的dna雙鏈分離方法以及適配子篩選方法和新的適配子的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種以細(xì)胞為靶的核酸適配子篩選過(guò)程中 DNA雙鏈的分離方法以及適配子的篩選方法及新的適配子。
【背景技術(shù)】
[0002] 核酸適配子（aptamer)是通過(guò)指數(shù)富集配基的系統(tǒng)進(jìn)化技術(shù)（Systematic evolution of ligands by exponential enrichment，SELEX)篩選得到的、能特異結(jié)合革巴 物質(zhì)的單鏈寡聚核苷酸（ssDNA或RNA)。核酸適配子與抗體功能類(lèi)似，但是與抗體相比，核 酸適配子具有更多優(yōu)勢(shì)，如更高的親和力與特異性、無(wú)免疫原性、能化學(xué)合成、成本低、可化 學(xué)標(biāo)記、穩(wěn)定性好、易于保存等。而且，核酸適配子的靶物質(zhì)更為廣泛，包括金屬離子、氨基 酸、核酸、多肽、蛋白質(zhì)，并從單一靶標(biāo)擴(kuò)展至完整的病毒顆粒和細(xì)胞等復(fù)合物靶標(biāo)[1]。因 此，近年來(lái)核酸適配子不斷被應(yīng)用于基礎(chǔ)研究、藥物開(kāi)發(fā)、臨床應(yīng)用等方面。同時(shí)，核酸適配 子的篩選技術(shù)也得到不斷發(fā)展，適用性、簡(jiǎn)便性不斷改善[2]。以細(xì)胞為靶的適配子篩選技 術(shù)，即cell-SELEX，是在原SELEX基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的細(xì)胞篩選技術(shù)，該技術(shù)是以活細(xì)胞為篩 選對(duì)象，不需要事先了解靶細(xì)胞表面的分子特征，通過(guò)引入非靶細(xì)胞進(jìn)行反篩獲得特異性 識(shí)別靶細(xì)胞的核酸適配子。其篩選過(guò)程主要包括以下幾個(gè)步驟[3]:①構(gòu)建文庫(kù)：體外合成 中間為30-60nt的隨機(jī)序列、兩端為18-40nt的固定序列的單鏈寡核苷酸文庫(kù)；②孵育篩 選：將該文庫(kù)與靶細(xì)胞孵育，收集與靶標(biāo)特異結(jié)合的核酸，然后再與非靶細(xì)胞孵育，收集未 結(jié)合核酸；③擴(kuò)增（PCR) :PCR擴(kuò)增與靶細(xì)胞結(jié)合、同時(shí)與非靶細(xì)胞不結(jié)合的核酸，得到雙鏈 DNA (dsDNA);④分離：分離dsDNA,獲得單鏈DNA (ssDNA)亞文庫(kù),或轉(zhuǎn)錄得到RNA亞文庫(kù)；⑤ 富集：重復(fù)上述過(guò)程5-20個(gè)循環(huán)，一些與靶標(biāo)有高親和力和高特異性的DNA或RNA分子不 斷得到富集；⑥克隆鑒定：流式細(xì)胞儀檢測(cè)ssDNA的富集情況，待富集達(dá)到一定程度時(shí)，進(jìn) 行克隆、測(cè)序和鑒定。
[0003] 在Cell-SELEX篩選適配子的過(guò)程中，分離雙鏈PCR產(chǎn)物，獲得可用于后續(xù)篩選的 單鏈DNA亞文庫(kù)是整個(gè)過(guò)程的限速步驟[4]。目前，分離雙鏈PCR產(chǎn)物最經(jīng)典方法的是生物 素-鏈親合素-磁珠法。該方法利用生物素與鏈親合素的結(jié)合特性，該方法包括：首先合成 正向引物和反向引物，反向引物進(jìn)行生物素（Biotin)標(biāo)記；然后，PCR擴(kuò)增得到生物素標(biāo)記 的dsDNA產(chǎn)物，將dsDNA濃縮純化后，與固定有鏈親合素（Streptavidin)的磁珠孵育，堿變 性法打破dsDNA之間的氫鍵，使得Biotin-ssDNA與鏈親合素結(jié)合后固定在磁珠上，游離的 另一條ssDNA則被分離出來(lái)，作為后續(xù)篩選的亞文庫(kù)[5]。然而，最近的研究報(bào)道表明，該方 法在堿變性后會(huì)打破鏈親合素與生物素之間的相互作用，使得Biotin-ssDNA脫落下來(lái)，污 染ssDNA亞文庫(kù)，二者重新發(fā)生退火反應(yīng)形成雙鏈DNAm。另外，堿變性也會(huì)破壞鏈親合素 與磁珠之間的共價(jià)鍵偶聯(lián)，脫落的鏈親合素混入ssDNA文庫(kù)，在后續(xù)與細(xì)胞孵育的過(guò)程中 造成細(xì)胞的聚集，影響細(xì)胞的生存狀態(tài)[4'6]。
[0004] 因此，有必要對(duì)傳統(tǒng)的生物素-鏈親合素-磁珠法進(jìn)行改良，提高雙鏈分離效率， 降低鏈親合素及Biotin-ssDNA對(duì)ssDNA亞文庫(kù)的污染，改善篩選孵育過(guò)程中的細(xì)胞生存狀 態(tài)，提高cell-SELEX的成功率。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 針對(duì)以上現(xiàn)有技術(shù)現(xiàn)狀，本發(fā)明提供了一種新的核酸適配子篩選過(guò)程中DNA雙鏈 的分離方法，并進(jìn)一步提供一種改進(jìn)的核酸適配子的篩選方法，本發(fā)明通過(guò)在生物素-鏈 親合素-磁珠法獲得ssDNA亞文庫(kù)后引入高分辨率瓊脂糖電泳，對(duì)ssDNA亞文庫(kù)進(jìn)行進(jìn)一 步分離純化，純化后的亞文庫(kù)繼續(xù)用于后續(xù)cell-SELEX篩選，可以成功地篩選細(xì)胞特異性 適配子。
[0006] 本發(fā)明所述適配子篩選過(guò)程中DNA雙鏈的分離方法，包括如下步驟：
[0007] 1)取由生物素-鏈親合素-磁珠法及堿變性法獲得的螢光素（FITC)-ssDNA亞文 庫(kù)溶液用酸進(jìn)行中和；
[0008] 2)將步驟1)所得中和后溶液進(jìn)行高分辨率瓊脂糖電泳；
[0009] 3)分離ssDNA亞文庫(kù)及其中的污染序列，切取ssDNA亞文庫(kù)的目標(biāo)條帶，通過(guò)小分 子量DNA純化回收試劑盒進(jìn)行回收，即得。
[0010] 本發(fā)明方法步驟1)中所述生物素-鏈親合素-磁珠法及堿變性法獲得的 FITC-ssDNA亞文庫(kù)溶液可來(lái)源不受任何限制，可以為本領(lǐng)域常規(guī)實(shí)驗(yàn)條件下生物素-鏈親 合素-磁珠法及堿變性法獲得的FITC-ssDNA亞文庫(kù)溶液。
[0011] 作為本發(fā)明實(shí)施方式之一，所述分離方法中步驟1)中的酸選自鹽酸或醋酸溶液； 所述酸的濃度范圍為50mM-300mM ;進(jìn)一步優(yōu)選鹽酸溶液的濃度為200mM。
[0012] 作為本發(fā)明實(shí)施方式之一，所述分離方法中步驟2)中的高分辨瓊脂糖電泳的條 件為：分辨率為20-1000bp，溫度為室溫，電泳時(shí)間為30min-lhr，電壓為150-180V。
[0013] 本發(fā)明方法步驟3)中分離ssDNA亞文庫(kù)及其中的污染序列，所述分離方法可以 采用本領(lǐng)域常規(guī)的分離方法；所述步驟3)中切取ssDNA亞文庫(kù)的目標(biāo)條帶，通過(guò)小分子量 DNA純化回收試劑盒進(jìn)行回收，可以采用本領(lǐng)常規(guī)的技術(shù)方式進(jìn)行；本發(fā)明包括但不限于 用溴化乙錠染色10分鐘，紫外燈下切取FITC-ssDNA的目標(biāo)條帶，通過(guò)小分子量DNA純化回 收試劑盒進(jìn)行回收。
[0014] 作為本發(fā)明實(shí)施方式之一，所述分離方法中步驟3)中的小分子純化試劑盒選自 20bp-100bp分子量范圍的小分子DNA純化試劑盒。
[0015] 本發(fā)明還提供一種采用本發(fā)明分離方法的核酸適配子的篩選方法，所述篩選方法 還包括由生物素-鏈親合素-磁珠法及堿變性法獲得的FITC-ssDNA亞文庫(kù)溶液按以下步 驟制得：
[0016] 1-1)準(zhǔn)備隨機(jī)ssDNA文庫(kù)，F(xiàn)ITC標(biāo)記的正向引物和Biotin標(biāo)記的反向引物；
[0017] 1-2)取靶向細(xì)胞與隨機(jī)ssDNA文庫(kù)進(jìn)行孵育，然后收集含有與靶向細(xì)胞結(jié)合的 ssDNA的上清液；
[0018] 1-3)取上述靶向細(xì)胞結(jié)合的ssDNA與非靶細(xì)胞進(jìn)行孵育，收集與非靶細(xì)胞不結(jié)合 的ssDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到dsDNA ;
[0019] 1-4)取dsDNA與固定有鏈親合素的磁珠進(jìn)行孵育，然后加入堿性溶液即得。
[0020] 本發(fā)明所述核酸適配子的篩選方法中，作為實(shí)施方式之一，所述方法中步驟1-1) 中ssDNA隨機(jī)文庫(kù)選自
[0021] 5，-ATCCAGAGTGACGCAGCA-40nt-TGGACACGGTGGCTTAGT-3，、或
[0022] 5' -GCAATGGTACGGTACTTCC-40nt-CAAAAGTGCACGCTACTTTGCTA-3' ；
[0023] 本發(fā)明方法中，作為實(shí)施方式之一，所述FITC標(biāo)記的正向引物選自：
[0024] 5,引物：5, -FITC-ATCCAGAGTGACGCAGCA-3,或
[0025] 5' -FITC-GCAATGGTACGGTACTTCC-3' ；
[0026] 本發(fā)明方法中，作為實(shí)施方式之一，所述Biotin標(biāo)記的反向引物選自：
[0027] 3' 引物：5, -biotin-ACTAAGCCACCGTGTCCA-3' 或
[0028] 5' -biotin-TTAGCAAAGTAGCGTGCACTTTTG-3' ；
[0029] 本發(fā)明核酸適配子的篩選方法中，作為實(shí)施方式之一，所述方法中步驟1-2)中靶 向細(xì)胞，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)常識(shí)及不同的篩選目的選擇不同的靶向細(xì) 胞，其來(lái)源不受任何限制，可以來(lái)自市售，也可以自行制備；包括但不限于自大鼠間充質(zhì)干 細(xì)胞；所述大鼠間充質(zhì)干細(xì)胞的來(lái)源不受任何限制，可以是市售、也可以制備；作為本發(fā)明 實(shí)施方式之一，所述大鼠間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)一步優(yōu)選通過(guò)如下處理獲取：將健康成年大鼠脫 頸處死，無(wú)菌條件下取股骨