專利名稱：一種體外誘導(dǎo)人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞分化為胰島素分泌細(xì)胞的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種體外誘導(dǎo)人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞分化為胰島素分泌細(xì)胞的方法。
背景技術(shù)：
人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞(human amniotic mesenchymal stem cells, hAMSCs)具有多系分化特性、低免疫原性、來源豐富、易于富集、擴增能力強、不牽涉醫(yī)學(xué)倫理問題等優(yōu)勢，在再生醫(yī)學(xué)中具有廣泛的應(yīng)用前景。業(yè)已證明，在適宜誘導(dǎo)條件下hAMSCs可分化成內(nèi)皮和肝上皮樣細(xì)胞、心肌細(xì)胞樣細(xì)胞、神經(jīng)元樣細(xì)胞、成骨細(xì)胞等，但其能否分化為分泌胰島素的胰腺B細(xì)胞迄今未見有關(guān)介紹。I型糖尿病的發(fā)生與遺傳因素、環(huán)境因素及免疫機制有關(guān)，其根本的病因病機是胰腺B細(xì)胞破壞致胰島素分泌不足。I型糖尿病病人必須終生依賴胰島素治療才能維持生命。盡管胰腺或胰島移植移植可望成為治療I型糖尿病的理想方法，但因其組織供源、免疫排異、技術(shù)難度等問題而受頗多限制。hAMSCs具有多系分化能力和免疫豁免特性，誘導(dǎo)其分化為胰島素分泌細(xì)胞(insulin secreting cells, ISCs)為治療I型糖尿病提供新的供體細(xì)胞無疑具有重要的應(yīng)用價值。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明解決的技術(shù)問題是克服現(xiàn)有技術(shù)存在的問題，本發(fā)明提供一種使hAMSCs 分化為ISCs的誘導(dǎo)方法。本發(fā)明采用的技術(shù)方案一種體外誘導(dǎo)人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞分化為胰島素分泌細(xì)胞的方法，包括以下步驟
(1)分離hAMSCs將人羊膜剪成碎片，加入含0. 02%EDTA的0. 05%胰蛋白酶消化溶液， 于37° C，200轉(zhuǎn)/分旋轉(zhuǎn)消化10分鐘，棄上清；重新加入消化液，于37° C，200轉(zhuǎn)/分旋轉(zhuǎn)消化30分鐘，棄上清，留取未消化的羊膜碎片，用D-Hank’S液沖洗二次，加入含有0. 075 mg/ml DNase I的0. 75 mg/ml的膠原酶，于37° C，200轉(zhuǎn)/分旋轉(zhuǎn)消化約2 h至組織完全消化，300目鋼網(wǎng)過濾，收集細(xì)胞濾液，1500轉(zhuǎn)/分離心10分鐘，收集細(xì)胞沉淀即原始 hAMSCs ；
(2)純化hAMSCs將分離的原始hAMSCs重新懸浮于LG-DMEM培養(yǎng)基中(含10% FBS, 2 mmol/L L-谷氨酰胺，1%非必需氨基酸，55 μ mol/L 2-巰基乙醇，1 mmol/L丙酮酸鈉， 100 U/ml青霉素和100 mg/ml鏈霉素)，以1. 25X 105/ml的細(xì)胞密度接種于6孔培養(yǎng)板，置于37° C、飽和濕度、體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2,的(X)2培養(yǎng)箱培養(yǎng)36 48小時，在倒置顯微鏡下除去完全未貼壁生長的羊膜上皮細(xì)胞。第3天更換新的培養(yǎng)基；待細(xì)胞匯合度達(dá)80、0% 后，用0. 25%胰蛋白酶一0. 02% EDTA溶液于37° C消化2 3分鐘，加入培養(yǎng)基終止胰蛋白酶作用，1000轉(zhuǎn)/分，離心5分鐘，棄上清，細(xì)胞沉淀用培養(yǎng)基重新懸浮，以1 X 107/L的細(xì)胞密度傳代；(3)鑒定hAMSCs取第2代hAMSCs行波形蛋白和CK19免疫組織化學(xué)染色，hAMSCs表達(dá)波形蛋白而不表達(dá)CK19 ；用流式細(xì)胞儀檢測⑶四、⑶44、⑶166、⑶；34和⑶45，hAMSCs的表型特征為為⑶四+⑶44+⑶166+⑶34一⑶45一 ；
(4)誘導(dǎo)hAMSCs向ISCs分化誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基為含lOmmol/L尼克酰胺和隊補充物的無血清HG-DMEM培養(yǎng)基；取第2代hAMSCs用誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基懸浮，以2. 5 X IO6個/ml細(xì)胞密度接種于6孔培養(yǎng)板，置于37°C、飽和濕度、體積分?jǐn)?shù)為5%ω2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7天，第三天用誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基換液1次；
(5)ISCs的鑒定hAMSCs誘導(dǎo)培養(yǎng)7天后，①取培養(yǎng)物上清液，采用放射免疫法檢測胰島素含量；②收集部分細(xì)胞，采用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(PT-PCR)檢測胰島素基因 mRNA和調(diào)節(jié)胰腺發(fā)育及胰島B細(xì)胞分化的關(guān)鍵性轉(zhuǎn)錄因子胰十二指腸同源異型盒因子-1 (pancreatic and duodenal homeobox factor-1, PDX-1)基因 mRNA 的表達(dá)；hAMSCs 經(jīng)上述誘導(dǎo)培養(yǎng)其誘導(dǎo)培養(yǎng)7天即分化為ISCs。本發(fā)明達(dá)到的有益效果hAMSCs經(jīng)上述誘導(dǎo)培養(yǎng)7天即分化為ISCs，細(xì)胞有胰島素基因和PDX-I基因表達(dá)，培養(yǎng)物上清中的胰島素含量達(dá)330 μ IU/ml以上；未經(jīng)誘導(dǎo)的 hAMSCs既無胰島素基因mRNA的表達(dá)，也檢測不到胰島素，說明本發(fā)明方法可在體外誘導(dǎo) hAMSCs分化為ISCs。經(jīng)本發(fā)明方法產(chǎn)生的ISCs及含有ISCs組合物可用于I型糖尿病I 型糖尿病。本發(fā)明的關(guān)鍵技術(shù)是培養(yǎng)基中除添加尼克酰胺和隊補充物外，維持細(xì)胞生長的高糖環(huán)境對誘導(dǎo)hAMSCs分化為ISCs十分重要。
具體實施例方式
實施例本發(fā)明的一種體外誘導(dǎo)人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞分化為胰島素分泌細(xì)胞的方法，包括以下步驟
(1)分離hAMSCs將人羊膜剪成碎片，加入含0. 02%EDTA的0. 05%胰蛋白酶消化溶液， 于37° C，200轉(zhuǎn)/分旋轉(zhuǎn)消化10分鐘，棄上清；重新加入消化液，于37° C，200轉(zhuǎn)/分旋轉(zhuǎn)消化30分鐘，棄上清，留取未消化的羊膜碎片，用D-Hank’s液沖洗二次，加入含有0. 075 mg/ml DNase I的0. 75 mg/ml的膠原酶，于37° C，200轉(zhuǎn)/分旋轉(zhuǎn)消化約2 h至組織完全消化，300目鋼網(wǎng)過濾，收集細(xì)胞濾液，1500轉(zhuǎn)/分離心10分鐘，收集細(xì)胞沉淀即原始 hAMSCs ；
(2)純化hAMSCs將分離的原始hAMSCs重新懸浮于低糖-DMEM培養(yǎng)基(購自Gibco公司，貨號=31600-026 ；含1000mg/L葡萄糖、10%的胎牛血清、100 U/ml青霉素禾口 100 mg/ml 鏈霉素)，以1.25XlO5Ail的細(xì)胞密度接種于6孔培養(yǎng)板，置于37° C、飽和濕度、體積分?jǐn)?shù)為5%的C02，的(X)2培養(yǎng)箱培養(yǎng)36 48小時，在倒置顯微鏡下除去完全未貼壁生長的羊膜上皮細(xì)胞。第3天更換新的培養(yǎng)基；待細(xì)胞匯合度達(dá)8(Γ90%后，用0. 25%胰蛋白酶一0. 02% EDTA溶液于37° C消化纊3分鐘，加入培養(yǎng)基終止胰蛋白酶作用，1000轉(zhuǎn)/分，離心5分鐘，棄上清，細(xì)胞沉淀用培養(yǎng)基重新懸浮，以1X107L的細(xì)胞密度傳代；
(3)鑒定hAMSCs取第2代hAMSCs行波形蛋白和CK19免疫組織化學(xué)染色，hAMSCs表達(dá)波形蛋白而不表達(dá)CK19 ；用流式細(xì)胞儀檢測⑶四、⑶44、⑶166、⑶；34和⑶45，hAMSCs的表型特征為為⑶四+⑶44+⑶166+⑶34一⑶45一 ；
(4)誘導(dǎo)hAMSCs向ISCs分化誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基為含lOmmol/L尼克酰胺和隊補充物(購自Gibco公司，貨號17502048)的無血清HG-DMEM培養(yǎng)基(購自Gibco公司，貨號 12800-017 ；葡萄糖含量為4500mg/L)。取第2代hAMSCs用誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基懸浮，以2. 5 X IO6 個/ml細(xì)胞密度接種于6孔培養(yǎng)板，置于37°C、飽和濕度、體積分?jǐn)?shù)為5%ω2培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 7天，第三天用誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基換液1次；；hAMSCs經(jīng)上述誘導(dǎo)培養(yǎng)其誘導(dǎo)培養(yǎng)7天即分化為 ISCs0 (5) ISCs的鑒定hAMSCs誘導(dǎo)培養(yǎng)7天后，①取培養(yǎng)物上清液，采用放射免疫法檢測胰島素含量為331.6μIU/ml ；②收集部分細(xì)胞，采用逆轉(zhuǎn)錄_聚合酶鏈反應(yīng)(PT-PCR) 檢測出胰島素基因mRNA和調(diào)節(jié)胰腺發(fā)育及胰島B細(xì)胞分化的關(guān)鍵性轉(zhuǎn)錄因子胰十二指腸同源異型盒因子-1 (pancreatic and duodenal homeobox factor-1, PDX-1)基因 mRNA 的表達(dá)。
權(quán)利要求
1. 一種體外誘導(dǎo)人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞分化為胰島素分泌細(xì)胞的方法，其特征在于包括以下步驟(1)分離hAMSCs將人羊膜剪成碎片，加入含0. 02%EDTA的0. 05%胰蛋白酶消化溶液， 旋轉(zhuǎn)消化棄上清；重新加入消化液，旋轉(zhuǎn)消化棄上清，留取未消化的羊膜碎片，用D-Hank’ s 液沖洗，加入含有0.075 mg/ml DNase I的0. 75 mg/ml的膠原酶，旋轉(zhuǎn)消化至組織完全消化，300目鋼網(wǎng)過濾，收集細(xì)胞濾液，離心后收集細(xì)胞沉淀，即得原始hAMSCs ；(2)純化hAMSCs將分離的原始hAMSCs重新懸浮于LG-DMEM培養(yǎng)基中，以1. 25X IO5/ ml的細(xì)胞密度接種于6孔培養(yǎng)板，置于37° C、飽和濕度、體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2,的CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，在倒置顯微鏡下除去完全未貼壁生長的羊膜上皮細(xì)胞，第3天更換新的培養(yǎng)基，待細(xì)胞匯合度達(dá)80 90%后，用0. 25%胰蛋白酶一0. 02% EDTA溶液消化2 3分鐘，加入培養(yǎng)基終止胰蛋白酶作用，10離心棄上清，細(xì)胞沉淀用培養(yǎng)基重新懸浮，以IX 107L的細(xì)胞密度傳代；(3)鑒定hAMSCs取第2代hAMSCs行波形蛋白和CK19免疫組織化學(xué)染色；用流式細(xì)胞儀檢測 CD29、CD44、CD166、CD34 和 CD45 ；(4)誘導(dǎo)hAMSCs向ISCs分化誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基為含lOmmol/L尼克酰胺和隊補充物的無血清HG-DMEM培養(yǎng)基；取第2代hAMSCs用誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基懸浮，以2. 5 X IO6個/ml細(xì)胞密度接種于6孔培養(yǎng)板，置于37°C、飽和濕度、體積分?jǐn)?shù)為5%ω2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7天，第三天用誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基換液1次；hAMSCs經(jīng)上述誘導(dǎo)分化培養(yǎng)其誘導(dǎo)培養(yǎng)7天即分化為ISCs ；(5)ISCs的鑒定hAMSCs誘導(dǎo)培養(yǎng)7天后，①取培養(yǎng)物上清液，采用放射免疫法檢測胰島素含量；②收集部分細(xì)胞，采用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(PT-PCR)檢測胰島素基因mRNA 和調(diào)節(jié)胰腺發(fā)育及胰島B細(xì)胞分化的關(guān)鍵性轉(zhuǎn)錄因子胰十二指腸同源異型盒因子-1基因 mRNA的表達(dá)。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種體外誘導(dǎo)人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞分化為胰島素分泌細(xì)胞的方法，將提取的hAMSCs經(jīng)含10mmol/L尼克酰胺和N2補充物的無血清高糖-DMEM誘導(dǎo)培養(yǎng)基培養(yǎng)7天。經(jīng)本發(fā)明方法誘導(dǎo)的hAMSCs表達(dá)胰島素基因mRNA和PDX-1基因mRNA，培養(yǎng)物上清中的胰島素含量達(dá)330μIU/ml以上，本發(fā)明方法可在體外誘導(dǎo)hAMSCs分化為ISCs。
文檔編號C12N5/071GK102391982SQ20111040458
公開日2012年3月28日 申請日期2011年12月8日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月8日
發(fā)明者方寧, 趙玉潔, 陳代雄 申請人:遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院