專利名稱：一種用于血清/血漿miRNA檢測(cè)的內(nèi)參及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于基因工程和腫瘤學(xué)領(lǐng)域，涉及一種用于血清/血漿miRNA檢測(cè)的內(nèi)參及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
MicroRNAs (即miRNAs)是近年來腫瘤分子生物學(xué)研究領(lǐng)域的一個(gè)熱點(diǎn)。成熟 miRNA是一類長(zhǎng)約21- 個(gè)核苷酸的小分子非編碼RNA，在胞核中，miRNA首先表達(dá)為數(shù)百核苷酸長(zhǎng)的原始(primary miRNA，pri_miRNA)，而后由Drosha核酸酶處理成約100核苷酸長(zhǎng)的前體(precursor miRNA, pre-miRNA)，并通過Exportin-5依賴的機(jī)制轉(zhuǎn)運(yùn)至胞漿；在胞漿中，進(jìn)一步由Dicer核酸酶處理成成熟miRNA。成熟miRNA主要通過與靶mRNA 3’-非翻譯區(qū)(UTR)的堿基互補(bǔ)配對(duì)來調(diào)控基因的表達(dá)，可以導(dǎo)致靶mRNA的降解或者翻譯的抑制。生物信息學(xué)研究表明，單個(gè)miRNA分子能夠與數(shù)百個(gè)功能各異的靶mRNA相結(jié)合而發(fā)揮調(diào)節(jié)作用，參與包括發(fā)育、代謝、細(xì)胞增長(zhǎng)、凋亡、干細(xì)胞分化等幾乎全部的病理生理學(xué)過程，與許多疾病的發(fā)生、發(fā)展存在著緊密的聯(lián)系。研究還表明miRNA的表達(dá)譜可以區(qū)分瘤組織和非瘤組織，并且具有腫瘤特異性；而miRNA整體的成熟受限可以導(dǎo)致細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化。 目前被發(fā)現(xiàn)的人類miRNA的數(shù)目仍在逐漸增加，而其在轉(zhuǎn)錄后調(diào)控方面的重要作用也正被揭示，miRNA已經(jīng)成為包括腫瘤在內(nèi)的多種疾病發(fā)病、治療和預(yù)后的重要候選標(biāo)志物。既往對(duì)miRNAs的研究主要集中在它們?cè)诩?xì)胞內(nèi)的活動(dòng)。2008年，中美科學(xué)家同步發(fā)現(xiàn)血清/血漿中穩(wěn)定存在miRNA。這些miRNA對(duì)RNase、酸堿環(huán)境、長(zhǎng)時(shí)間(>M 小時(shí))室溫放置及反復(fù)凍融均不敏感，血漿和血清中無明顯差異。目前有關(guān)血清/血漿 miRNA的來源還沒有定論，多數(shù)研究者認(rèn)為腫瘤患者血清/血漿中的miRNA來源于靶組織， 但其表達(dá)變化與靶組織的一致性還有待探討；也有研究者認(rèn)為miRNA可以被選擇性富集到 "microparticles(MPs) ”或‘‘exosomes” 中，由細(xì)胞以‘‘microvesicles 微泡”脫落的方式主動(dòng)向外分泌。無論如何，血清/血漿miRNA具備成為優(yōu)質(zhì)生物標(biāo)志物的潛質(zhì)，即含量豐富且性質(zhì)穩(wěn)定，擁有以蛋白質(zhì)為代表的傳統(tǒng)生物標(biāo)志物所不具備的特質(zhì)，即無需抗體制備且易于精確定量，而且具有疾病特異性，為生物標(biāo)志物開拓了新境界。現(xiàn)有的血清/血漿miRNA檢測(cè)技術(shù)已經(jīng)較為成熟，如基因芯片技術(shù)、高通量測(cè)序技術(shù)以及最常用而有效的實(shí)時(shí)熒光定量PCR法，使得血清/血漿miRNA表達(dá)譜的獲得成為可能。然而，目前尚缺乏可用于血清/血漿miRNA檢測(cè)的穩(wěn)定內(nèi)參。與組織/細(xì)胞miRNA 不同，TO在血清/血漿中表達(dá)很低，無法作為血清/血漿miRNA表達(dá)的內(nèi)參。目前研究者常用兩種方法控制實(shí)驗(yàn)差異一是在實(shí)驗(yàn)的每一步都處理等體積的“適量”血清/血漿，二是在miRNA提取時(shí)，在加入Trizol使蛋白變性后即刻加入人工合成的非人類miRNA (如線蟲-39，cel-miR-39)。盡管用上述兩種方法，可以有效控制實(shí)驗(yàn)差異，但無法控制個(gè)體本身的生物學(xué)差異，特異而穩(wěn)定的血清/血漿miRNA內(nèi)參的缺乏仍制約著血清/血漿miRNA研究成果臨床轉(zhuǎn)化及不同實(shí)驗(yàn)室間研究成果的比較。因此，若能篩選出可用于血清/血漿miRNAs檢測(cè)的內(nèi)參，并研制相應(yīng)的檢測(cè)試劑盒，對(duì)血清/血漿miRNA相關(guān)研究成果的臨床轉(zhuǎn)化及提高腫瘤等疾病的臨床診療水平必將是一次有力的推動(dòng)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的首要目的是針對(duì)上述技術(shù)問題，提出一種用于血清/血漿miRNA檢測(cè)的內(nèi)參。本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供上述血清/血漿miRNA檢測(cè)內(nèi)參的引物。本發(fā)明的第三個(gè)目的是提供上述血清/血漿miRNA檢測(cè)內(nèi)參及其引物在制備血清 /血漿miRNA內(nèi)參檢測(cè)試劑盒中的應(yīng)用。本發(fā)明第四個(gè)目的是提供血清/血漿miRNA內(nèi)參檢測(cè)的試劑盒。發(fā)明人通過分離和研究不同腫瘤病人及健康對(duì)照血清/血漿中的miRNAs，尋找一組在不同疾病性狀及健康者間穩(wěn)定表達(dá)的內(nèi)參，并研制出可便于臨床應(yīng)用的內(nèi)參檢測(cè)試劑盒，為血清/血漿miRNA研究成果的臨床轉(zhuǎn)化及不同實(shí)驗(yàn)室間研究成果的比較提供數(shù)據(jù)支持。本發(fā)明的目的是通過下列技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的一種用于血清/血漿miRNA檢測(cè)的內(nèi)參，該內(nèi)參為單獨(dú)的miR-484或者miR-191 與miR-484構(gòu)成的組合。所述的血清/血漿miRNA內(nèi)參的引物，這些引物為miR-191 的引物為 SEQ ID No. 1 和 SEQ ID No. 2 ；miR-484 的引物為 SEQ ID No. 5 和 SEQ ID No. 6。所述的血清/血漿miRNA內(nèi)參在制備血清/血漿miRNA內(nèi)參檢測(cè)試劑盒中的應(yīng)用。所述血清/血漿miRNA內(nèi)參的引物在制備血清/血漿miRNA內(nèi)參檢測(cè)試劑盒中的應(yīng)用。一種血清/血漿miRNA內(nèi)參檢測(cè)試劑盒，該試劑盒用于檢測(cè)血清/血漿中miR-484 或者miR-191和miR-484構(gòu)成的組合。所述的檢測(cè)試劑盒，該試劑盒含有血清/血漿miRNA中miR-191和miR-484的引物或者單獨(dú)含有miR-484的引物；其中miR-191 的引物為 SEQ ID No. 1 和 SEQ ID No. 2 ；miR-484 的引物為 SEQ ID No. 5 和 SEQ ID No. 6。所述檢測(cè)試劑盒還可以包括PCR反應(yīng)常用的酶和試劑，如逆轉(zhuǎn)錄酶，緩沖液， dNTPs, MgCl2, DEPC水和Taq酶等；還可以含有標(biāo)準(zhǔn)品和/或?qū)φ掌?。具體地說，本發(fā)明解決問題的技術(shù)方案包括(1)以標(biāo)準(zhǔn)操作程序(SOP)采集符合標(biāo)準(zhǔn)的血液樣本。( 血清/血漿miRNA表達(dá)譜分析選擇肺癌、乳腺癌、胃癌、肝癌、宮頸癌病人、男性健康對(duì)照和女性健康對(duì)照，檢測(cè)其血清/血漿miRNA表達(dá)譜及含量，分析不同腫瘤病例和對(duì)照間血清/血漿miRNA表達(dá)的穩(wěn)定性，篩選穩(wěn)定表達(dá)miRNAs，即候選內(nèi)參 miRNA,進(jìn)行進(jìn)一步驗(yàn)證。( 對(duì)篩選出的穩(wěn)定表達(dá)的血清/血漿候選內(nèi)參miRNAs在食管癌、結(jié)腸癌、直腸癌、胰腺癌、口腔癌、胃癌、肺癌、乳腺癌、肝癌和健康對(duì)照中進(jìn)行定量分析， 確定可用于血清/血漿miRNAs檢測(cè)的內(nèi)參。(4)血清/血漿miRNA內(nèi)參檢測(cè)試劑盒的研制根據(jù)不同腫瘤病例和健康對(duì)照的穩(wěn)定表達(dá)的血清/血漿miRNA，開發(fā)血清/血漿miRNAs 內(nèi)參檢測(cè)試劑盒，用于比較不同實(shí)驗(yàn)室間的相關(guān)研究結(jié)果并實(shí)現(xiàn)其臨床轉(zhuǎn)化。本發(fā)明人以標(biāo)準(zhǔn)操作程序(SOP)采集符合標(biāo)準(zhǔn)的血液樣本，并采用了 RT-PCR、 Real-timePCR 方法、SoIexa 測(cè)序技術(shù)、TaqMan Low Density Array (TLDA)芯片檢測(cè)等。具體來說研究的實(shí)驗(yàn)方法主要包括以下幾個(gè)部分1.研究樣本的選擇(1)經(jīng)病理學(xué)明確診斷的腫瘤病人，包括內(nèi)參篩選階段的肺癌、乳腺癌、胃癌、肝癌和宮頸癌病例，和內(nèi)參驗(yàn)證階段的食管癌、結(jié)腸癌、直腸癌、胰腺癌、口腔癌、胃癌、肺癌、乳腺癌和肝癌病例(2)采血前未經(jīng)過手術(shù)和放化療，無手術(shù)前放化療(3)健康男性、女性對(duì)照本研究共采用3M例符合標(biāo)準(zhǔn)的樣本進(jìn)行研究。2. Trizol 試劑(Invitrogen, Carlsbad, CA)和 miRNeasy Mini Kit (QIAGEN 公司) 提取血清/血漿總RNA，按常規(guī)方法操作。通常能得到 5yg RNA/50ml血清或血漿。3. Solexa 測(cè)序(1)總RNA進(jìn)行PAGE電泳回收17_27nt RNA分子(2)將鏈接引物(adaptor prime，Solexa測(cè)序通用引物)酶聯(lián)在小RNA分子的3' 與5'端(3)進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)后進(jìn)行測(cè)序(4)數(shù)據(jù)分析與處理4. TLDA(Applied Biosystems 公司)芯片檢測(cè)(1)總RNA通過逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)得到cDNA樣品(2)cDNA樣品進(jìn)行預(yù)擴(kuò)增反應(yīng)(3)預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行TLDA芯片檢測(cè)，得到miRNA的表達(dá)譜(4)數(shù)據(jù)分析與處理5. Real-time RT-PCR(qRT-PCR)方法(1)取受試者的血清/血漿總RNA，通過RNA逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)得到cDNA樣品；(2)設(shè)計(jì)引物；(3)加入熒光探針或染料進(jìn)行PCR反應(yīng)；(4)檢測(cè)并比較不同腫瘤病人和健康對(duì)照血清/血漿樣本中miRNA的量的穩(wěn)定性。6.內(nèi)參檢測(cè)試劑盒制備方法不同腫瘤病人和健康對(duì)照中拷貝數(shù)和表達(dá)水平均穩(wěn)定的miRNA，通過qRT_PCR技術(shù)篩選在不同腫瘤病人和健康對(duì)照中表達(dá)穩(wěn)定的一組血清/血漿miRNA，作為血清/血漿 miRNA檢測(cè)的內(nèi)參。最后篩選出的血清/血漿miRNA內(nèi)參組成檢測(cè)試劑盒(單獨(dú)的miR-484 或者miR-191與miR-484構(gòu)成的組合)。檢測(cè)試劑盒可以包括這些血清/血漿微小核糖核酸組合的引物，探針，以及Taq酶、dNTP等試劑。7.統(tǒng)計(jì)分析方法運(yùn)用變異系數(shù)CV分析每個(gè)miRNA在不同樣本之間的變異程度。運(yùn)用Normfinder 禾口定量表達(dá)數(shù)據(jù)內(nèi)參基因在線分析工具(http//www. leonxie. com/referencegene. php)分析各個(gè)miRNA在不同樣本中的穩(wěn)定性。miRNA穩(wěn)定值越低，其穩(wěn)定性越高。我們?cè)诤Y選階段樣本人群，包括60例肺癌(30例長(zhǎng)生存期和30例短生存期)、48 例乳腺癌(24例一組)、40例胃癌(20例一組)、30例肝癌、30例宮頸癌病例和48例健康男性對(duì)照，48例健康女性對(duì)照，綜合運(yùn)用Solexa測(cè)序和TLDA芯片的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)有3種 miRNAs在各樣本間可穩(wěn)定表達(dá)。對(duì)穩(wěn)定表達(dá)的miRNAs在另外5例食管癌、5例結(jié)腸癌、5例直腸癌、5例胰腺癌、5例口腔癌、5例胃癌、5例肺癌、5例乳腺癌、5例肝癌病例和5例健康對(duì)照中進(jìn)行進(jìn)一步驗(yàn)證，進(jìn)而觀察本研究結(jié)果的穩(wěn)定程度。以下是本發(fā)明進(jìn)一步的說明在上述篩選階段樣本中，我們將這10組合并樣本經(jīng)Solexa測(cè)序試驗(yàn)及TLDA芯片檢測(cè)獲得相關(guān)結(jié)果。根據(jù)Solexa測(cè)序方法，本發(fā)明人檢測(cè)到在不同腫瘤和健康對(duì)照組中的血清/血漿中穩(wěn)定表達(dá)(平均拷貝數(shù)> 50，變異系數(shù)< 100% )的微小核糖核酸包括hsa-miR-191、 hsa—miR-320、hsa—miR-484、hsa—miR-222、hsa-let_7a、hsa-let_7b、hsa-let_7c、 hsa-let_7d、hsa-let_7e、hsa-let_7f、hsa—miR-103、hsa—miR-107、hsa—miR-122、 hsa-miR-125a_5p、hsa-miR-139_3p、hsa-miR-140_3p、hsa-miR-192、hsa-miR-197、 hsa-miR-221、hsa-miR-23a、hsa-miR-25、hsa-miR-30d、hsa-miR-339-5p、hsa-miR-423-3p、 hsa-miR-423_5p、hsa-miR-451、hsa-miR-486_3p、hsa-miR-486_5p、hsa-miR-532_3p、 hsa—miR-584、hsa-miR-744、hsa-miR-99a。根據(jù)TLDA芯片檢測(cè)，本發(fā)明人檢測(cè)到在不同腫瘤和健康對(duì)照組中的血清/血漿中穩(wěn)定表達(dá)(平均Ct值< 25，變異系數(shù)< 5% )的微小核糖核酸包括hsa-miR-191、 hsa—miR-320、hsa—miR-484、hsa—miR-126、hsa—miR-150、hsa—miR-24、hsa_miR-20a、 hsa—miR-17、hsa_miR-106a、hsa_miR-92a、hsa_miR-19b、hsa_miR-146a0根據(jù)上述兩種方法檢測(cè)的結(jié)果，選擇在Solexa測(cè)序和TLDA芯片中均穩(wěn)定表達(dá)的 miRNAs用qRT-PCR方法進(jìn)一步的驗(yàn)證滿足上述條件的miRNAs 包括miR_191、miR-320 和 miR-484。根據(jù)上述結(jié)果，將這3個(gè)候選內(nèi)參miRNAs在另外5例食管癌、5例結(jié)腸癌、5例直腸癌、5例胰腺癌、5例口腔癌、5例胃癌、5例肺癌、5例乳腺癌、5例肝癌病例和5例健康對(duì)照分別用探針法和染料法qRT-PCR進(jìn)一步的驗(yàn)證。Normfinder和內(nèi)參在線分析軟件均表明， 就血清/血漿中單個(gè)miRNA而言，miR-484的表達(dá)最為穩(wěn)定，而miR-191和miR-484的組合其穩(wěn)定性超過了單個(gè)miR-484。探針法和染料法結(jié)果一致。根據(jù)上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果，本發(fā)明人制備了一種能用于血清/血漿miRNA內(nèi)參檢測(cè)的試劑盒，包含測(cè)定受試者血清/血漿中穩(wěn)定存在且可檢測(cè)的成熟miR-191和miR-484的引物和其他檢測(cè)試劑。具體而言，miR-484單獨(dú)及miR-191和miR-484構(gòu)成的組合，或者miR-484單獨(dú)的引物及miR-191和miR-484組合的引物構(gòu)成的內(nèi)參檢測(cè)試劑盒，促進(jìn)了血清/血漿miRNA 相關(guān)研究結(jié)果的臨床轉(zhuǎn)化和不同實(shí)驗(yàn)室研究結(jié)果的比較，為臨床醫(yī)生快速準(zhǔn)確掌握患者的疾病狀態(tài)和病情嚴(yán)重程度，及時(shí)采取更具個(gè)性化的防治方案提供支持。本申請(qǐng)中“血清/血漿”中的“/”表示“和”及“或”的關(guān)系。本發(fā)明的有益效果
本發(fā)明提供的血清/血漿微小核糖核酸(microRNAs/miRNAs)檢測(cè)內(nèi)參的優(yōu)點(diǎn)在于(1)血清/血漿miRNAs是一種新型生物標(biāo)志物，區(qū)別于傳統(tǒng)生物標(biāo)志物，不僅穩(wěn)定、微創(chuàng)、易于檢測(cè)，且定量精確，將大大提高疾病診斷的敏感性和特異性，該類小分子RNA 內(nèi)參的成功研究有助于血清/血漿miRNAs在疾病早期診斷及預(yù)后判斷等方面價(jià)值的臨床轉(zhuǎn)化，以及不同實(shí)驗(yàn)室之間研究結(jié)果的比較。(2)血清/血漿miRNAs內(nèi)參檢測(cè)試劑盒可用于檢測(cè)不同受試者血清/血漿中的內(nèi)參miRNAs，有助于反映不同受試者內(nèi)參miRNA的基線表達(dá)水平，用于控制個(gè)體生物學(xué)差異導(dǎo)致的miRNA表達(dá)水平差異，以凸顯真正與疾病相關(guān)的差異表達(dá)miRNA。(3)采用嚴(yán)密的設(shè)計(jì)和評(píng)價(jià)體系，本發(fā)明人初期采用Solexa全基因組測(cè)序技術(shù)對(duì)血清/血漿miRNAs進(jìn)行直接測(cè)序，同時(shí)采用TLDA芯片檢測(cè)以獲取穩(wěn)定表達(dá)的血清/血漿 miRNAs，并應(yīng)用qRT-PCR的方法進(jìn)行了單個(gè)樣本驗(yàn)證；以上方法和策略的應(yīng)用加速和保證了血清/血漿miRNAs內(nèi)參檢測(cè)試劑盒的應(yīng)用。本發(fā)明通過研究血清/血漿中穩(wěn)定表達(dá)的miRNA，尋求可用于血清/血漿miRNA檢測(cè)的內(nèi)參。因此，本發(fā)明獲得了血清/血漿miRNAs表達(dá)數(shù)據(jù)庫(kù)和穩(wěn)定表達(dá)的內(nèi)參miRNA; 通過血清/血漿miRNAs內(nèi)參試劑盒的研制和應(yīng)用，促進(jìn)血清/血漿miRNAs相關(guān)研究結(jié)果的臨床轉(zhuǎn)化和不同實(shí)驗(yàn)室間研究結(jié)果的比較，為臨床醫(yī)生快速準(zhǔn)確掌握患者病情，為臨床治療效果評(píng)價(jià)奠定基礎(chǔ)，并為發(fā)現(xiàn)具有潛在治療價(jià)值的新型小分子藥物靶標(biāo)提供幫助。


圖1.顯示不同腫瘤病人和對(duì)照的3種候選內(nèi)參miRNA及cel-miR-39的的表達(dá)折線圖。
具體實(shí)施例方式以下通過實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的闡述。實(shí)施例1樣品的收集和樣品資料的整理發(fā)明人自2003年7月起從江蘇省內(nèi)多個(gè)三級(jí)甲等醫(yī)院收集了大量的各腫瘤病人及健康對(duì)照血清/血漿樣品，用于研究的病例和對(duì)照樣本均為同期收取，采樣、分裝、保存條件均一，通過對(duì)樣品資料的整理，發(fā)明人從中選擇了 3M例符合下列標(biāo)準(zhǔn)的樣本作為 Solexa測(cè)序、TLDA芯片檢測(cè)和后續(xù)一系列qRT_PCR驗(yàn)證的實(shí)驗(yàn)樣品1、經(jīng)病理學(xué)明確診斷的腫瘤病人，包括內(nèi)參篩選階段的肺癌、乳腺癌、胃癌、肝癌和宮頸癌病例，和內(nèi)參驗(yàn)證階段的食管癌、結(jié)腸癌、直腸癌、胰腺癌、口腔癌、胃癌、肺癌、乳腺癌和肝癌病例。2、采血前未經(jīng)過手術(shù)和放化療，無手術(shù)前放化療。3、健康男性、女性對(duì)照。并系統(tǒng)采集了這些樣本的人口學(xué)資料、臨床資料等情況。實(shí)施例2血清/血漿中miRNA的Solexa測(cè)序?qū)嶒?yàn)上述符合條件的樣本包括60例肺癌(30例長(zhǎng)生存期組和30例短生存期組)、48 例乳腺癌(24例/組)、40例胃癌(20例/組)、30例肝癌、30例宮頸癌病例和48例健康男性對(duì)照，48例健康女性對(duì)照。將這10組人群經(jīng)Solexa測(cè)序試驗(yàn)(試劑盒購(gòu)自ABI公司) 獲得相關(guān)結(jié)果。具體步驟為1、每組樣本取血清/血漿50ml，加入等體積的Trizol試劑；2、相分離室溫放置15min，然后按0. 2ml氯仿/lml Trizol試劑的體積比加入氯仿，震蕩 15s,室溫 15min, 12，OOOg, 4°C，離心 15min ；3、將水相轉(zhuǎn)移到新的50ml的離心管，3步苯酚/氯仿除去蛋白相；4,RNA沉淀將水相轉(zhuǎn)移到新的離心管中，按0. 5ml異丙醇/lml Trizol試劑體積加入異丙醇，_20°C保存 60min, 12，OOOg, 4°C，離心 60min ；5、用lml Trizol試劑重懸沉淀，將懸液轉(zhuǎn)移到新的1. 5ml的離心管中；6、重復(fù)2，4步(第四步離心改為15min)；7、RNA洗滌去掉上清，加入75%乙醇，12，OOOg，4°C離心5min ；8、測(cè)量濃度通常能得到 5 μ g RNA/50ml血清/血漿；9、總RNA進(jìn)行PAGE電泳回收17_27nt RNA分子；10、將鏈接引物(adaptor prime，Solexa測(cè)序通用引物)酶聯(lián)在小RNA分子的3' 與5'端；11、進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)后并進(jìn)行測(cè)序；12、數(shù)據(jù)分析與處理在每組中運(yùn)用Solexa測(cè)序方法發(fā)現(xiàn)的血清/血漿穩(wěn)定表達(dá)的微小核糖核酸在上文中已經(jīng)羅列出。實(shí)施例3血清/血漿中miRNA的TLDA芯片檢測(cè)將上述進(jìn)行Solexa測(cè)序的10組樣本經(jīng)TLDA芯片檢測(cè)(試劑盒購(gòu)自ABI公司) 獲得相關(guān)結(jié)果。具體步驟為1、每組取血清/血漿600 μ 1，加入3倍體積的Trizol試劑；2、相分離室溫放置 15min，加入終濃度為 10_4pmol/ μ 1 的 cel-miR-39 (TAKARA) 作為內(nèi)參，然后加入與血清/血漿等體積的氯仿，震蕩50s，室溫15min，14，000rpm，4°C，離心 15min ；3,RNA沉淀將水相轉(zhuǎn)移到新的15ml的離心管，加入1. 5倍水相體積的無水乙醇， 充分混勻；4、用QIAGEN miRNeasy kit富集RNA 每次吸取700 μ 1樣本至離心柱中， 14，OOOrpm離心15s，棄去收集管中濾液，重復(fù)至樣本均過柱；加入700 μ 1洗液1， 14，OOOrpm離心15s，棄收集管中濾液；加入500 μ 1洗液2，14，OOOrpm離心15s，棄收集管中濾液；再加入500 μ 1洗液2，14，OOOrpm離心2min，棄收集管中濾液；將離心柱放回空的收集管中，14，OOOrpm離心^iiin以干燥離心管；將離心管放入新的1. 5ml管中，加入50 μ 1 無核酸酶水，10, OOOrpm離心Imin ；將管中的液體倒回離心柱中，14，OOOrpm離心lmin，棄離心柱；5、測(cè)量濃度通常能得到 1250ng RNA/600 μ 1血清/血漿；6、用TLDA芯片配套的逆轉(zhuǎn)錄試劑盒通過RNA逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)得到cDNA。逆轉(zhuǎn)錄的反應(yīng)體系包括0. 8μ 1逆轉(zhuǎn)錄引物(10Χ)、0. 2μ 1 IOOmM dNIPs混合物、1. 5 μ 1逆轉(zhuǎn)錄酶(50U/ μ L)、0. 8 μ 1 IOX逆轉(zhuǎn)錄緩沖液、0. 9 μ 1 25mM氯化鎂、0. 1 μ 1 RNA抑制劑以及0. 2 μ 1無核酸酶水。加入3 μ 1 (l-350ng)的總RNA。反應(yīng)步驟為16°C孵育2分鐘，42°C反應(yīng)1分鐘，50°C反應(yīng)1秒，上述3步經(jīng)40個(gè)循環(huán)反應(yīng)，再85°C孵育5分鐘；10、對(duì)芯片特異性的miRNA進(jìn)行預(yù)擴(kuò)增以增加表達(dá)所需的CNDA的量。預(yù)擴(kuò)增的反應(yīng)體系包括12. 5μ 1預(yù)擴(kuò)增Master Mix (2 X) ,2. 5 μ 1預(yù)擴(kuò)增引物(10 X)、7. 5 μ 1無核酸酶水、2. 5 μ 1 CDNA。反應(yīng)步驟為95°C 10分鐘一55°C 2分鐘一72°C 2分鐘一95°C 15秒、 600C 4分鐘，12個(gè)循環(huán)一99. 90C 10分鐘；反應(yīng)結(jié)束后加入75 μ 1 0. IX TE稀釋；11、取9μ 1稀釋后的預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物，加入450μ 1基因表達(dá)Master Mix，441yl無核酸酶水，充分混勻后，在TLDA芯片上加入100 μ 1/孔；IOOOrpm離心lmin，離心2次。 TLDA芯片實(shí)驗(yàn)使用的是ABI Prism 7900熒光定量PCR儀。選擇384-well TaqMan Low DensityArray特定的程序進(jìn)行反應(yīng)；12、數(shù)據(jù)分析與處理用RQ-Manger軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，Ct閾值設(shè)為0. 2。運(yùn)用TLDA 芯片檢測(cè)發(fā)現(xiàn)的各組中血清/血漿穩(wěn)定表達(dá)的微小核糖核酸在上文中已經(jīng)羅列出。實(shí)施例4血清/血漿中miRNA的qRT_PCR驗(yàn)證根據(jù)上述Solexa和TLDA結(jié)果，選擇滿足下列條件的miRNAs用qRT_PCR方法進(jìn)一步的驗(yàn)證1) So 1 exa測(cè)序中這些miRNAs在不同腫瘤和健康對(duì)照組中平均拷貝數(shù)> 50，變異系數(shù)< 100% ；2) TLDA芯片檢測(cè)中這些miRNA在不同腫瘤和健康對(duì)照組中平均Ct值< 25， 變異系數(shù)<5% ；3)在Solexa測(cè)序和TLDA芯片檢測(cè)中均顯示出穩(wěn)定表達(dá)。對(duì)所選擇的 miR-191、miR-320和miR-484等3個(gè)miRNAs設(shè)計(jì)逆轉(zhuǎn)錄和qRT-PCR的引物(見表2)。候選內(nèi)參miRNA的穩(wěn)定性見表1、圖1。在整個(gè)研究過程中均實(shí)施嚴(yán)格的質(zhì)控。每個(gè)樣本連續(xù)檢測(cè)三次。所有檢測(cè)均采用盲法，即在不清楚樣本背景的情況下完成以避免偏倚。(1)制備RNA樣品a)取100 μ 1血清/血漿；b)加3倍體積的Trizol室溫放置 15min，加入終濃度為1(Γ4ρπιο1/μ 1的cel_miR-39 (TAKARA)作為內(nèi)參，然后加入與血清/血漿等體積的氯仿，震蕩50s，室溫15min，14，OOOrpm，4°C，離心15min ；c)將水相轉(zhuǎn)移到新的 15ml的離心管，加入1. 5倍水相體積的無水乙醇，充分混勻；d)用QIAGEN公司的miRNeasy kit富集RNA 每次吸取700 μ 1樣本至離心柱中，14，OOOrpm離心15s，棄去收集管中濾液， 重復(fù)至樣本均過柱；加入700 μ 1洗液1，14，OOOrpm離心15s，棄收集管中濾液；加入500 μ 1 洗液2，14，OOOrpm離心15s，棄收集管中濾液；再加入500 μ 1洗液2，14，OOOrpm離心2min， 棄收集管中濾液；將離心柱放回空的收集管中，14，OOOrpm離心aiiin以干燥離心管；將離心管放入新的1. 5ml管中，加入50 μ 1無核酸酶水，10, OOOrpm離心Imin ；將管中的液體倒回離心柱中，14，OOOrpm離心lmin，棄離心柱，將管中的液體作為RNA樣品；(2)探針法使用ABI試劑盒。a)通過RNA逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)得到cDNA。探針法的逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系包括0. 15 μ 1 IOOmMdNTPs混合物、1 μ 1逆轉(zhuǎn)錄酶(50U/ μ L)、1. 5 μ 1 IOX逆轉(zhuǎn)錄緩沖液、0. 19 μ 1 RNA抑制劑以及3μ 1 5X逆轉(zhuǎn)錄引物(miR-191、miR-320、miR-484和cel-miR-39的逆轉(zhuǎn)錄引物混合物，每種miRNA加入3/4 μ 1逆轉(zhuǎn)錄引物)。加入9. 16 μ 1的總RNA。反應(yīng)步驟為16°C 孵育30分鐘，42 °C反應(yīng)30分鐘，85 °C孵育5分鐘；b) q-PCR 將cDNA加入5 μ 1水稀釋，取1 μ 1稀釋后的cDNA，分別加入 0. 25 μ 120 XMicroRNA 檢測(cè)探針(miR-191、miR-320、miR-484 和 cel-miR-39 中單個(gè) miRNA 的探針)、2. 5μ1 2 X基因表達(dá)Master Mix、1. 25 μ 1雙蒸水，5 μ 1體系進(jìn)行q-PCR。儀器使用的是ABI Prism 7900熒光定量PCR儀，PCR的反應(yīng)條件是95°C、5分鐘進(jìn)行1個(gè)循環(huán)—95°C、15秒，60°C、1分鐘進(jìn)行45個(gè)循環(huán)。(3)染料法a)通過RNA逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)得到cDNA。染料法的逆轉(zhuǎn)錄的反應(yīng)體系包括4 μ 1 5 X AMV 緩沖液、2 μ 1 IOmM dNTP 混合物(Takara 公司)、0· 5 μ 1 RNase 抑制劑(Takara 公司)、 2 μ IAMV (Takara公司)以及1. 5μ 1 miRNA特異性反向引物的混合物(miR-191、miR-320、 miR-484和cel-miR-39的特異性反向引物混合物(見表2)，每種加入1. 5/4 μ 1)。反應(yīng)步驟為16°C孵育15分鐘，42°C反應(yīng)1小時(shí)，85°C孵育5分鐘；b) q-PCR 將cDNA按1/5體積稀釋，取0. 5 μ 1稀釋后的cDNA，加入0. 15 μ 1 Taq酶 (Takara公司)，0. 5μ 1 20XEVAGREEN，0. 1 μ 1 10 μ M正向引物一種(即分別采用上述單一 miRNA 對(duì)應(yīng)的正向引物)，0. 1μ 1 ΙΟμΜ 通用反向引物(URP :TGGTGTCGTGGAGTCG)，0. 6 μ 1 25mM MgCl2,0. 8 μ 1 2. 5mM dNTP 混合物(Takara公司)，1 μ 1 10 XPCR緩沖液，6· 75 μ IH2O, 10 μ 1體系進(jìn)行q-PCR。儀器使用的是ABI Prism 7900熒光定量PCR儀，PCR的反應(yīng)條件是95°C、5分鐘進(jìn)行1個(gè)循環(huán)一95°C、15秒，60°C、1分鐘進(jìn)行45個(gè)循環(huán)。(4)數(shù)據(jù)處理與分析每個(gè)樣品血漿miRNAs的表達(dá)量比值可用方程2_Δα表示，其中ACt = CT# 本_CT。el-miK-39，我們?cè)诿恳粋€(gè)樣本提取時(shí)加入cel-miR-39的RNA控制RNA提取時(shí)的差異，計(jì)算相對(duì)表達(dá)量(cel-miR-39的引物序列=SEQ ID No. 7和SEQ ID No. 8)。探針法qRT-PCR結(jié)果發(fā)現(xiàn)在50例樣本中，miR-484的穩(wěn)定性最好，而miR-191和 miR-484的組合其穩(wěn)定性超過了單個(gè)miR-484。染料法結(jié)果與探針法類似未列出。因此，本發(fā)明人證明了 miR-484單獨(dú)及miR-191和miR-484構(gòu)成的組合能夠穩(wěn)定地在各腫瘤病人和健康對(duì)照中表達(dá)。表1.候選內(nèi)參的穩(wěn)定性評(píng)分
權(quán)利要求
1.一種用于血清/血漿miRNA檢測(cè)的內(nèi)參，其特征在于該內(nèi)參為單獨(dú)的miR-484或者 miR-191和miR-484構(gòu)成的組合。
2.權(quán)利要求1所述的血清/血漿miRNA內(nèi)參的引物，其特征在于該引物為 miR-191 的引物為 SEQ ID No. 1 和 SEQ ID No. 2 ；miR-484 的引物為 SEQ ID No. 5 和SEQID No. 6。
3.權(quán)利要求1所述的血清/血漿miRNA內(nèi)參在制備血清/血漿miRNA內(nèi)參檢測(cè)試劑盒中的應(yīng)用。
4.權(quán)利要求2所述的引物在制備血清/血漿miRNA內(nèi)參檢測(cè)試劑盒中的應(yīng)用。
5.一種血清/血漿miRNA內(nèi)參檢測(cè)試劑盒，其特征在于該試劑盒含有血清/血漿miRNA 中miR-191和miR-484的引物或者單獨(dú)含有miR-484的引物。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的內(nèi)參檢測(cè)試劑盒，其特征在于該試劑盒含有權(quán)利要求2所述的全部引物或者單獨(dú)含有權(quán)利要求2所述的miR-484的引物。
7.根據(jù)權(quán)利要求5或6所述內(nèi)參檢測(cè)試劑盒，其特征在于該試劑盒還可以包括PCR技術(shù)常用的試劑。
全文摘要
本發(fā)明屬于基因工程和腫瘤學(xué)領(lǐng)域，公開了一種用于血清/血漿miRNA檢測(cè)的內(nèi)參及其應(yīng)用。該內(nèi)參為單獨(dú)的miR-484或者miR-191和miR-484構(gòu)成的組合。該內(nèi)參及其引物可用于制備內(nèi)參檢測(cè)試劑盒，用于血清/血漿miRNA內(nèi)參的檢測(cè)。
文檔編號(hào)C12N15/11GK102443638SQ20111039802
公開日2012年5月9日 申請(qǐng)日期2011年12月5日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月5日
發(fā)明者張辰宇, 沈洪兵, 胡志斌, 董靜 申請(qǐng)人:南京醫(yī)科大學(xué)