專利名稱：單核細(xì)胞增多性李斯特菌的肽核酸原位熒光鑒定方法及pna探針的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于鑒定單核細(xì)胞增多性李斯特菌(Zisteria的PNA 探針的設(shè)計，及應(yīng)用PNA-FISH法鑒定單核細(xì)胞增多性李斯特菌的方法。
背景技術(shù)：
李斯特菌屬包括單核細(xì)胞增多性李斯特菌ilisteria monocytogenes )、伊氏李斯 #lif(.Listeria、無害李其jf特菌(厶 i/wc^wa),格氏李其Jf特菌(厶 graja·)、塞氏李斯特菌、L. seeligeri )、威氏李斯特菌(Z. welsshimeri )、以及2009年新近發(fā)現(xiàn)的L. marthii和Z. rocourtiae.其中單增李斯特菌和伊氏李斯特菌對動物具有致病性，且單增李斯特菌為人畜共患食源性致病菌。孕婦、小孩、老年人及免疫力低下人群易感，常表現(xiàn)為腦膜腦炎、腦炎、骨髓炎、心肌炎、膿血癥、流產(chǎn)等，發(fā)病率雖然不高，但死亡率較高，成年人的致死率為20% 60%，對嬰兒及免疫力低下的人群致死率高達(dá)54% 90%。該菌在自然界中廣泛分布，環(huán)境適應(yīng)性很強(qiáng)，PH4. 4 9. 2、3 45°C以及高達(dá)10%NaCl的環(huán)境中均可以生長，通過多種途徑進(jìn)入食品加工和生產(chǎn)過程污染食品，對消費(fèi)者健康構(gòu)成潛在威脅。肽核酸是1991年由丹麥科學(xué)家Nielsen等人設(shè)計的一種以中性酰胺鍵為骨架的全新的DNA模擬物，其骨架結(jié)構(gòu)單元為(2-氨乙基)甘氨酸，堿基部分通過亞甲基羰基連接與主骨架的氨基N上，可以序列特異地與DNA、RNA結(jié)合。其骨架為電中性，與DNA-DNA或 RNA-DNA互補(bǔ)鏈相比，PNA-DNA和PNA-RNA互補(bǔ)不存在靜電排斥作用，因此具有很高的DNA 或RNA親和性，在無錯配的情況下其結(jié)合具有高穩(wěn)定性，且雜交速度快，具有良好的細(xì)胞穿透性，是核酸探針的良好選擇。同時PNA探針結(jié)合原位熒光雜交技術(shù)(FISH)，與傳統(tǒng)生化鑒定比較，PNA-FISH法可節(jié)約大量時間，若不計增菌時間，一般耗時不超過4個小時。與PCR 等方法比較，PNA-FISH法的結(jié)果判斷基于熒光檢測和形態(tài)檢測兩部分，較PCR法等假陽性較低，且PNA-FISH法可省去核酸提取的步驟。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的第一個目的是設(shè)計了單核細(xì)胞增多性李斯特菌的肽核酸原位熒光鑒定用PNA探針，該P(yáng)NA探針具單核細(xì)胞增多性李斯特菌特異性；本發(fā)明的第二個目的是提供了一種單核細(xì)胞增多性李斯特菌的肽核酸原位熒光鑒定方法，該方法結(jié)合FISH檢測技術(shù)，實(shí)現(xiàn)對單核細(xì)胞增多性李斯特菌的快速檢測。為了實(shí)現(xiàn)上述第一個目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案
單核細(xì)胞增多性李斯特菌的肽核酸原位熒光鑒定用PNA探針，其特征在于該P(yáng)NA探針的DNA序列如SEQ ID NO 1所示。為了實(shí)現(xiàn)上述第二個目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案
單核細(xì)胞增多性李斯特菌的肽核酸原位熒光鑒定方法，該方法包括以下的步驟 1)離心收集對數(shù)生長期的細(xì)菌，用PBS洗滌一次，再用PBS調(diào)整菌液濃度至OD600=O. 5-2. 0 ；
2)取10μ1菌液于98%酒精清洗過的玻片上涂勻，火焰固定，將玻片于80%的酒精中浸泡15分鐘，風(fēng)干；
3)25μ1含500pmole/mlPNA探針的雜交緩沖液，PNA探針的DNA序列如SEQ ID NO 1 所示，滴加于玻片上，55°C作用1-1. 5小時，雜交后玻片于55°C預(yù)熱的洗滌緩沖液中洗滌2 次，每次10分鐘；
4)取2 5μ1菌液涂片，風(fēng)干后顯微鏡觀察其熒光亮度及細(xì)菌的形態(tài)。作為優(yōu)選，上述的雜交緩沖液，ρΗ7. 5，該雜交緩沖液包括10% (w/v)硫酸葡聚糖， 10 mM NaCl, 30% (ν/ν)甲酰胺，0.1% (w/v)焦磷酸鈉，0. 2% (w/v)聚乙烯吡咯烷酮，0. 2% (w/v)聚蔗糖，5 mM Na2EDTA, 0. 2% (v/v) TritonX-IOO 和 50 mM Tris/HCL·作為優(yōu)選，上述的洗滌緩沖液，pHIO,該洗滌緩沖液包括5 mM Tris，15mM NaCl和 0. 1% (v/v) TritonX-100。本發(fā)明由于采用了上述技術(shù)方案，PNA具有與DNA和RNA特異性結(jié)合的高穩(wěn)定性、 雜交快速性、及其良好的細(xì)胞穿透性，使本發(fā)明的檢測方法具有快速，準(zhǔn)確、靈敏的特性。同時結(jié)合原位熒光雜交技術(shù)使檢測具有分子生物學(xué)和形態(tài)學(xué)的雙重保證，更加提高了鑒定的準(zhǔn)確率。本發(fā)明建立了固相熒光原位雜交檢測方法，并優(yōu)化了雜交條件。PNA-FISH法具有快速特點(diǎn)，一般整個鑒定過程耗時不超過4個小時；PNA-FISH法的結(jié)果判斷基于熒光檢測和形態(tài)檢測兩部分，較PCR法等假陽性低，且PNA-FISH法可省去繁瑣DNA提取的步驟。
具體實(shí)施例方式下面對本發(fā)明的具體實(shí)施方式
做一個詳細(xì)的說明。一、PNA探針的設(shè)計
在 NCBI 的網(wǎng)站上(http://www. ncbi. him. nih. gov/BLAST/)選取了 27 個分別來自 8 個種的李斯特菌的 16S rRNA的基因，用MegAlign 軟件(version 5.0; DNASTAR, Madison, WI)的ClustalV算法進(jìn)行排序。在排序后的在變異區(qū)域設(shè)計了單增李斯特菌特異性探針 Lm-16S-2。探針序列見表1。二、探針敏感度和靈敏度的理論驗(yàn)證
為了驗(yàn)證探針的敏感度和特異性，用BLAST (http://blast.ncbi.nlm.nih. gov/)和 ProbeCheck (http://131. 130. 66. 200/cgi-bin/probecheck/)對探針進(jìn)行了驗(yàn)證。BLAST 搜索發(fā)現(xiàn)，所設(shè)計的探針具有較高的特異性。但也發(fā)現(xiàn)李斯特菌Z. marthii與Lm-16S_2 序列上存在重合，但Ζ. marthii目前只在美國紐約的一處湖泊中發(fā)現(xiàn)，其他地區(qū)都未有發(fā)現(xiàn)的報道，因此一般并不會與我們的目標(biāo)細(xì)菌混淆。ProbeCheck的驗(yàn)證結(jié)果顯示探針Lm-16S_2能檢測到數(shù)據(jù)庫中所有的101個目標(biāo)單增李斯特菌，但和BLAST的結(jié)果一致，不能區(qū)分單增和Z. marthii.而其他檢測到的非目標(biāo)細(xì)菌，與李斯特菌關(guān)系都較疏遠(yuǎn)，也并非食品中常見的致病菌(表2)。隨后將PNA探針與大亞基(233/ 數(shù)據(jù)庫匹配檢測，發(fā)現(xiàn)探針Lm-16S-2不與23S rRNA存在錯配。經(jīng)過BLAST和ftObeCheck驗(yàn)證，所設(shè)計的探針理論上具有很高的靈敏度和特異性。表1 PNA 探針探針序列(5’ -3’)熒光標(biāo)記探針位置堿基序列；GenBank號BacUinaCTGCCTCCCGTAGGA-FAM—Lm—16S—2TAGTACAAAGGGTCG-FAM1247-1261;FJ434468
a BacUin 為陽性對照探針；引用自 Perry-0，Keefe, H. , Stender, H. , Broomer, A.， Oliveira, K. , Coull, J. , Hyldig-Nielsen, J. J. , 2001. Filter-based PNA in situ hybridization for rapid detection, identification and enumeration of specific micro-organisms. J Appl Microbiol 90(2): 180-189. 探針合成和標(biāo)記由韓國Panagene完成.
表2 ProbeCheck檢測PNA探針的敏感度和特異性
探針名可檢測到的目標(biāo)菌數(shù)/數(shù)據(jù)庫中所有的目標(biāo)菌數(shù)檢測到的非目標(biāo)菌菌數(shù)13特異性°(%)敏感度d(%)Lm-16S-2aZ. monocytogenes 101/1011099. 99100
3檢測到了 ProbeCheck 16S/18S數(shù)據(jù)庫中的所有101個單增李斯特菌； bProbeCheck的16S/18S數(shù)據(jù)庫中共有菌株數(shù)460，783 ；非單增李斯特菌的菌株數(shù) 460，682 ；
c特異性=沒有檢測到的非目標(biāo)菌菌株數(shù)/數(shù)據(jù)庫中所有的非目標(biāo)菌菌株數(shù)； d敏感度=檢測到的目標(biāo)菌菌株數(shù)/數(shù)據(jù)庫中所有的目標(biāo)菌菌株數(shù)。三、固相PNA熒光原位雜交
離心(2000g，5min)收集對數(shù)生長期的細(xì)菌，用PBS洗滌一次，再用PBS調(diào)整菌液濃度至0D_=0. 5-2. 0，取ΙΟμΙ菌液于98%酒精清洗過的玻片上涂勻，火焰固定，將玻片于80% 的酒精中浸泡15分鐘，風(fēng)干；25μ1含500pmole/mlPNA的雜交緩沖液(pH7. 5，10% (w/v)硫酸葡聚糖，10 mM NaCl, 30% (ν/ν)甲酰胺，0.1% (w/v)焦磷酸鈉，0. 2% (w/v)聚乙烯吡咯燒酮，0.2% (w/v)聚蔗糖，5 mM Na2EDTA, 0. 2% (v/v) TritonX-100, 50 mM Tris/HCl)滴加于玻片上，55°C作用1_1.5小時，雜交后玻片于551預(yù)熱的洗滌緩沖液(？!110，5 mM Tris, 15mM NaCl,0. 1% (v/v) TritonX-100)中洗滌2次，每次10分鐘，取2 5μ1菌液涂片，風(fēng)干后顯微鏡觀察其熒光亮度及細(xì)菌的形態(tài)。試驗(yàn)例1 PNA-FISH敏感度驗(yàn)證
對9株不同血清型的單增李斯特菌進(jìn)行敏感度驗(yàn)證。試驗(yàn)方法如上所述。每次試驗(yàn)(包括以下實(shí)例2和3)都同步進(jìn)行陽性對照和陰性對照試驗(yàn)，陽性對照試驗(yàn)，用探針BacUin替代其他探針，而陰性對照試驗(yàn)中，用空白替代其他探針。結(jié)果顯示，所有的菌株都能和陽性對照探針BacUin和探針Lm-16S_2結(jié)合(見表 3)。上述結(jié)果和預(yù)設(shè)結(jié)果一致，探針Lm-16S-2能檢測到自己的目標(biāo)菌株，有較高的敏感度。表3 PNA探針敏感度試驗(yàn)
權(quán)利要求
1.單核細(xì)胞增多性李斯特菌(listeria的肽核酸原位熒光鑒定用 PNA探針，其特征在于該P(yáng)NA探針的DNA序列如SEQ ID NO 1所示。
2.單核細(xì)胞增多性李斯特菌的肽核酸原位熒光鑒定方法，其特征在于該方法包括以下的步驟1)離心收集對數(shù)生長期的細(xì)菌，用PBS洗滌一次，再用PBS調(diào)整菌液濃度至 OD600=O. 5-2. 0 ；2)取10μ1菌液于98%酒精清洗過的玻片上涂勻，火焰固定，將玻片于80%的酒精中浸泡15分鐘，風(fēng)干；3)25μ1含500pmole/mlPNA探針的雜交緩沖液，PNA探針的DNA序列如SEQ ID NO 1 所示，滴加于玻片上，55°C作用1-1. 5小時，雜交后玻片于55°C預(yù)熱的洗滌緩沖液中洗滌2 次，每次10分鐘；4)取2 5μ1菌液涂片，風(fēng)干后顯微鏡觀察其熒光亮度及細(xì)菌的形態(tài)。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的單核細(xì)胞增多性李斯特菌的肽核酸原位熒光鑒定方法，其特征在于雜交緩沖液，ΡΗ7. 5，該雜交緩沖液包括10%(w/v)硫酸葡聚糖，10 mM NaCl, 30% (ν/ ν)甲酰胺，0.1% (w/v)焦磷酸鈉，0.2% (w/v)聚乙烯吡咯烷酮，0.2% (w/v)聚蔗糖，5 mM Na2EDTA,0. 2% (v/v) TritonX-100 和 50 mM Tris/HCl。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的單核細(xì)胞增多性李斯特菌的肽核酸原位熒光鑒定方法，其特征在于洗滌緩沖液，pHIO，該洗滌緩沖液包括5 mM Tris, 15mM NaCl和0. 1% (ν/ν) TritonX-100。
全文摘要
本發(fā)明涉及用于鑒定單核細(xì)胞增多性李斯特菌(Listeriamonocytogenes)的PNA探針的設(shè)計，及應(yīng)用PNA-FISH法鑒定單核細(xì)胞增多性李斯特菌的方法。 單核細(xì)胞增多性李斯特菌的肽核酸原位熒光鑒定用PNA探針，其特征在于該P(yáng)NA探針的DNA序列如SEQ ID NO1所示。本發(fā)明并將探針N端標(biāo)記熒光素，與熒光原位雜交技術(shù)結(jié)合用于檢測。同時建立了固相熒光原位雜交檢測方法，并優(yōu)化了雜交條件。PNA-FISH法具有快速特點(diǎn)，一般整個鑒定過程耗時不超過4個小時；PNA-FISH法的結(jié)果判斷基于熒光檢測和形態(tài)檢測兩部分，較PCR法等假陽性低，且PNA-FISH法可省去繁瑣DNA提取的步驟。
文檔編號C12N15/11GK102358908SQ20111033342
公開日2012年2月22日 申請日期2011年10月28日 優(yōu)先權(quán)日2011年10月28日
發(fā)明者吳姍, 帥江冰, 張曉峰, 李可, 董強(qiáng) 申請人:浙江省檢驗(yàn)檢疫科學(xué)技術(shù)研究院