專利名稱：一種表達BDNF-HA₂TAT的重組腺相關病毒及其構建方法
技術領域：
本發(fā)明涉及ー種重組載體，具體地說，是ー種表達BDNf-HA2TAT的重組腺相關病毒及其構建方法。
背景技術：
抑郁障礙存在海馬神經(jīng)元萎縮、細胞凋亡加速、神經(jīng)元再生障礙等神經(jīng)病理學改變。如何有效的保護海馬神經(jīng)元一直是抑郁障礙研究的熱點和難點。腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(brain derived neurotrophi·c factor,BDNF)是神經(jīng)營養(yǎng)因子家族中的重要成員，BDNF表達下調(diào)可能參與慢性應激所致抑郁癥海馬結構和功能的改變。將外源性BDNF注入強迫游泳和學習無助的抑郁大鼠模型的海馬齒狀回可以產(chǎn)生抗抑郁樣活性，這說明BDNF中樞給藥對于抑郁癥來說是有效的。然而BDNF抗抑郁作用的發(fā)揮一方面有賴于其有效的中樞血藥濃度，另ー方面中樞多次給藥以及輸注設備持久存在會引起神經(jīng)組織的額外損傷。盡管外周靜脈內(nèi)給藥簡便、無損傷，但由于BDNF在血液循環(huán)中存在降解和血腦屏障的通透性問題，以致很難到達中樞神經(jīng)的保護效應。腺相關病毒(adeno-associated virus, AAV)是目前發(fā)現(xiàn)的卩隹一無致病性的單鏈DNA病毒，也是已知的唯一能與人基因組特異染色體定點整合的天然復制缺陷病毒。它無明顯的致病性，無免疫源性及炎癥反應；不能獨立復制，在無輔助病毒(如腺病毒、皰疹病毒)感染吋，AAV只能整合在宿主細胞的DNA中，呈潛伏感染狀態(tài)，插入的外源基因表達時間長，轉移外源基因時不伴隨任何病毒基因的表達。AAV以點特異方式固定地整合在人19號染色體上，不存在致癌及插入突變；宿主范圍廣，不僅可感染分裂期細胞，對非分裂期細胞(如神經(jīng)元、肌細胞等)也較敏感?；谝陨咸攸c而開發(fā)的腺相關病毒載體是繼腺病毒和逆轉錄病毒后出現(xiàn)的新型基因治療工具。如果將BDNF基因序列導入AAV載體，可以持續(xù)分泌表達BDNF。近年來，經(jīng)鼻入腦的給藥方式為國內(nèi)外中樞神經(jīng)系統(tǒng)給藥方式研究的熱點，這種給藥方式既可以避免腹腔或靜脈注射途徑中需經(jīng)血液循環(huán)入腦而引起的全身副作用，又可以避免在血液循環(huán)中降解過快，并且有著腦內(nèi)藥物濃度高的優(yōu)點。以往的研究發(fā)現(xiàn)脂溶性好的小分子物質(zhì)(小于IOkD)可以沿“鼻-腦”通路入腦，但大分子蛋白難以沿此通路入腦。由于在基因治療中對神經(jīng)系統(tǒng)有治療作用的基因產(chǎn)物多為大分子蛋白，因此，尋求將大分子蛋白經(jīng)“鼻-腦”通路導入腦內(nèi)的方法，將為解決基因治療的難題提供一種新的思路和方法。穿膜肽為近年來新發(fā)現(xiàn)的ー種具有蛋白轉導功能的短肽，研究發(fā)現(xiàn)它的蛋白轉導機制為新的非能量、非受體、非溫度依賴的轉導方法，常用的穿膜肽有果蠅的Ant蛋白、TAT蛋白人工合成的多聚精氨酸等。Murriel等通過腹腔注射穿膜肽2B2半乳糖苷酶，發(fā)現(xiàn)穿膜肽能攜帶該蛋白通過血腦屏障到達腦組織，同時能保持酶的活性，且在該過程中對神經(jīng)細胞及血腦屏障的免疫反應很弱。上述實驗均顯示穿膜肽能夠攜帯蛋白質(zhì)透過血腦屏障并保持蛋白的活性，同時對神經(jīng)細胞、血腦屏障的免疫性很弱。中國專利文獻CN1124343C公開了ー種由腦組織獲得的神經(jīng)營養(yǎng)因子，涉及編碼了腦源神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)的核酸序列以及用這些核酸順序大量制得的BDNF蛋白及其片段和衍生物，還涉及BDNF蛋白質(zhì)在制造治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病或失調(diào)的藥物中的用途。中國專利文獻CN101078013A公開了神經(jīng)營養(yǎng)因子BDNF、NT-3信號通路新成員Dok5的鑒定和應用，克隆了人dok5的基因為治療多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病提供了新的作用靶點，因此可用于開發(fā)神經(jīng)系統(tǒng)疾病的藥物。中國專利文獻CN101302529A公開了共表達⑶NF和BDNF的轉基因神經(jīng)干細胞，描述了ー種構建共表達⑶NF和BDNF的轉基因神經(jīng)干細胞的方法及其用途和意義，為臨床治療神經(jīng)退行性疾病-帕金森氏病和/或其他中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病提供了ー種轉基因神經(jīng)干細胞治療新途徑。王海珍等通過克隆人BDNF基因，構建含有TAT-BDNF的重組表達載體，為進ー步表達融合蛋白及探討TAT攜帯BDNF穿透血腦屏障治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病奠定了基礎(詳見:王海珍等.BDNF的克隆及pTAT/HA-BDNF重組表達載體的構建[J].神經(jīng)損傷與功能重建，2008，3(5):304-306.)。李惠明等采用PCR和體外連接的方法構建了帶有信號肽的腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)的融合基因，將此基因插入到腺相關病毒載體穿梭質(zhì)粒PSNAV，然后用重組質(zhì)粒pSNAV-1g-BDNF轉染包裝細胞，篩選出永久細胞株后，用攜帯腺相關病毒rep及cap基因的單純皰疹病毒超感染包裝細胞，成功包裝出含有目的基因的一型血清型腺相關病·毒(詳見:李惠明等.表達分泌型腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子的腺相關病毒載體的構建及其表達的檢測[J].生物工程學報，2008，24(2):328-332.)。但是關于ー種表達BDNf-HA2TAT的重組腺相關病毒及其構建方法目前還未見報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是針對現(xiàn)有技術中的不足，提供一種表達BDNf-HA2TAT的重組腺相
關病毒。本發(fā)明的另ー的目的是，提供一種表達BDNf-HA2TAT的重組腺相關病毒的構建方法。為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采取的技術方案是:一種表達BDNf-HA2TAT的重組腺相關病毒，所述的表達BDNf-HA2TAT的重組腺相關病毒是由下列方法構建得到的:
a、克隆BDNFcDNA融合基因，將PCR產(chǎn)物連接入pGEM_T Easy載體，獲得的pGEM_TEasy/BDNF轉化受體菌^: Coli DH5 a，堿裂解法提取重組質(zhì)粒DNA ；
b、酶切獲取帶有粘性末端的BDNF基因，將BDNF基因插入攜帯穿膜肽TAT的載體質(zhì)粒pSSCMV-HA2TAT，構建重組載體質(zhì)粒 pSSCMV-BDNF_HA2TAT ；
C、在磷酸鈣作用下，重組載體質(zhì)粒pSSCMV-BDNF-HA2TAT、包裝質(zhì)粒pAAV/Ad和輔助質(zhì)粒PFG140三質(zhì)粒共轉染HEK293細胞，轉染的包裝細胞繼續(xù)培養(yǎng)，收獲病毒上清，即表達BDNF-HA2TAT的重組腺相關病毒。所述的BDNF cDNA具有SEQ ID N0.1所述的核苷酸序列。所述的步驟a中BDNF基因擴增的上游引物和下游引物分別具有SEQ ID N0.2和SEQ ID N0.3所述的核苷酸序列。為實現(xiàn)上述第二個目的，本發(fā)明采取的技術方案是:一種表達BDNf-HA2TAT的重組腺相關病毒的構建方法，所述的構建方法包括以下步驟:
a、克隆BDNF cDNA融合基因，將PCR產(chǎn)物連接入pGEM_T Easy載體，獲得的pGEM_TEasy/BDNF轉化受體菌^: Cb7iDH5 a，堿裂解法提取重組質(zhì)粒DNA ；b、酶切獲取帶有粘性末端的BDNF基因，將BDNF基因插入攜帯穿膜肽TAT的載體質(zhì)粒pSSCMV-HA2TAT，構建重組載體質(zhì)粒 pSSCMV-BDNF_HA2TAT ；
C、在磷酸鈣作用下，重組載體質(zhì)粒pSSCMV-BDNF-HA2TAT、包裝質(zhì)粒pAAV/Ad和輔助質(zhì)粒PFG140三質(zhì)粒共轉染HEK293細胞，轉染的包裝細胞繼續(xù)培養(yǎng)，收獲病毒上清，即表達BDNF-HA2TAT的重組腺相關病毒。所述的BDNF cDNA具有SEQ ID N0.1所述的核苷酸序列。所述的步驟a中B·DNF基因擴增的上游引物和下游引物分別具有SEQ ID N0.2和SEQ ID N0.3所述的核苷酸序列。本發(fā)明優(yōu)點在于:
1、本發(fā)明構建了攜帶融合基因BDNf-HA2TAT的腺相關病毒載體bdnf-ha2tat/aav，表達BDNf-HA2TAT的重組腺相關病毒即可以分泌表達大分子蛋白BDNF，表達的BDNF又有穿過血腦屏障作用，同時將BDNF基因序列導入AAV載體，可以持續(xù)分泌表達BDNF，解決了 BDNF需反復給藥的難題；
2、通過抗抑郁效カ篩選實驗證明了可分泌表達BDNf-HA2TAT的重組腺相關病毒具有抗抑郁的作用，建立了一種有效預防和治療抑郁障礙和應激障礙等精神疾病的手段和方法。


附圖1是目的基因BDNF克隆結果:1，DNA Marker ;2，PCR產(chǎn)物。附圖2是重組質(zhì)粒pGEM-T Easy/BDNF酶切鑒定結果:1，重組質(zhì)粒；2，重組質(zhì)粒酶切；3, DNA Marker。附圖3是重組質(zhì)粒pSSCMV-BDNF-HA2TAT酶切鑒定結果:1，重組質(zhì)粒；2，重組質(zhì)粒酶切;3，DNA Marker。附圖4是重組質(zhì)粒PUC19-BDNF-HA2TAT酶切鑒定結果:1，DNA Marker ;2，重組質(zhì)粒酶切；3，重組質(zhì)粒。附圖5是BDNf-HA2TAT測序結果。附圖6是Hela細胞免疫組織化學染色結果。附圖7是BDNF-HA2TAT/AAV連續(xù)經(jīng)鼻給5d的FST結果。數(shù)據(jù)為mean土SEM，* p
<0.05 ;*** p < 0.0Ol0附圖8是BDNF-HA2TAT/AAV連續(xù)經(jīng)鼻給5d的OPF結果。數(shù)據(jù)為mean 土 SEM，** p
<0.01。附圖9是BDNF_HA2TAT/AAV連續(xù)經(jīng)鼻給IOd的FST結果。數(shù)據(jù)為mean土SEM，* p
<0.05 ;** p く 0.01 ;*** p く 0.0Ol0附圖10是BDNF-HA2TAT/AAV連續(xù)經(jīng)鼻給IOd的OPF結果。數(shù)據(jù)為mean土 SEM，* p
<0.05。
具體實施例方式下面結合附圖對本發(fā)明提供的具體實施方式
作詳細說明。實施例1構建包裝表達BDNF的重組腺相關病毒
克隆BDNF cDNA融合基因，將PCR產(chǎn)物連接入pGEM_T Easy載體，獲得的pGEM_TEasy/BDNF轉化受體菌^: Colimb a，堿裂解法提取重組質(zhì)粒DNA，酶切鑒定；酶切獲取帶有粘·性末端的BDNF基因，將BDNF基因插入攜帶穿膜肽TAT的載體質(zhì)粒，構建重組載體質(zhì)粒 pSSCMV-BDNF-HA2TAT，重組質(zhì)粒 pSSCMV-BDNF-HA2TAT 經(jīng) EcoRI 和 BamHI 酶切制備BDNf-HA2TAT片段并連接到TOC19質(zhì)粒中測序；在磷酸鈣作用下，重組載體質(zhì)粒Psscmv-BDNF-HA2TAT、包裝質(zhì)粒pAAV/Ad和輔助質(zhì)粒PFG140三質(zhì)粒共轉染HEK293細胞，制備表達BDNf-HA2TAT的重組腺相關病毒，純化病毒，滴定效價。一、重組載體的構建 (一)實驗材料:
1.主要試劑 dNTPs IOmM
Tap DNA聚合酶天根公司
T4 DNA連接酶promaga公司
限制性內(nèi)切酶EcoR IMBI公司
KpnIMBI 公司
BamHIMBI 公司
瓊脂糖
胰蛋白胨
酵母提取物
SYPR Green Kit
2.重要試劑配制
(I)TE緩沖液
IM Tirs-HCl Iml (PH8.0),0.5M EDTA 0.2ml (PH8.0)，ddH20 定容至 100ml。(2) 2.5M CaCl2
稱取無水CaCl2 55.5g, ddH20定容至200ml,高壓滅菌,4°C保存。(3)制備固體含氨芐青霉素(Amp)的LB平板培養(yǎng)基
IOg胰蛋白胨；5g酵母提取物；1Og NaCl ； 12g瓊脂或瓊脂糖；加蒸懼水定容至1000ml，使其充分溶解，1 mo 1/L NaOH調(diào)PH至7.0，高壓滅菌25min，常溫保存?zhèn)溆谩Ｖ苽銵B固體平板時，取無抗菌素固體LB，在微波爐內(nèi)加熱融化，自然冷卻至約50°C時，加入Amp IOml (1:200)，混均后倒入無菌平皿中，每個平板導入32_40ml，常溫凝固，4°C保存。(4)喊裂解法提取質(zhì)粒所需液體
溶液 I: IM Tris-HCl 12.5ml,0.5M EDTA (PH 8.0) 10ml，葡萄糖 4.730g，加 ddH20至500ml。115°C高壓滅菌15min后,4°C保存。溶液II:10% SDS 10ml, IOM NaOH 2ml，加 ddH20 至 100ml。使用時臨時配制。溶液II1:5M 醋酸鉀 300ml，冰醋酸 57.5ml，ddH20 定容至 500ml。4°C保存。(5) 0.25%胰酶
稱取胰酶2.5g，D-Hank’ s液定容至1000ml，振蕩溶解，濾菌后-20°C保存。3.質(zhì)粒和菌株
F BDNF質(zhì)粒，pGEM-T Easy 質(zhì)粒(50 y g/y l，promaga 公司)，pSSCMV_HA2TAT質(zhì)粒，PUC19質(zhì)粒，pAAV/Ad質(zhì)粒，pFG140質(zhì)粒，大腸桿菌Top 10，HEK293細胞。4.實驗儀器:
PCR儀，低壓電泳儀，·水平電泳槽，紫外線透射儀，數(shù)碼相機，高壓滅菌鍋，電熱恒溫水浴箱，搖床，低溫高速離心機，水平式離心機，超凈工作臺，顯微鏡(ニ)實驗方法:
1.目的基因BDNF的克隆 (I)設計合成引物
以F BDNF質(zhì)粒為模板，應用PCR方法擴增獲得刪除了終止序列的BDNF片段，目的基因BDNF的cDNA核苷酸序列見SEQ ID N0.1。在其上游和下游分別加入限制性內(nèi)切酶EcoRI和KpnI位點。所需引物如下:
上游引物 F (50pmol/u I): 5，-CG GAA TTC ATG ACC ATC CTT TTC CTT AC-3，(SEQID N0.2)；
下游引物 R (50pmol/u I): 5，-C GGT ACC TCT TCC CCT TTT AAT GGT C_3’ (SEQ IDN0.3)。(2) BDNF基因的擴增
1)建立PCR反應體系(0.5ml離心管):
IOXPCR bufferIOu 1 dNTPmix2u 1 上游引物F1ul
下游引物R1 u 1 模版1 U 1 Taq DNA聚合酶1 U 1 MgCl2 (25mM)6u 1 加 ddH20 至100 ii 1 011石蠟油50 ill覆蓋表面；
2)PCR反應:
94°C 5min,
94°C lmin，48°C lmin，72°C 90s，共 30 個循環(huán)，
72 °C 5min ；
3)制備瓊脂糖凝膠，待PCR反應結束后，取5u I反應產(chǎn)物加樣、電泳，紫外燈下觀察電泳凝膠；
4)收集從電泳凝膠下切下的含DNA片段的瓊脂糖凝膠至1.5ml離心管內(nèi)，稱重確定體積(姆IOOmg瓊脂糖凝膠相當于100 u I體積)；
5)加入等體積的酹/氯仿抽提，輕輕混勻，離心12000r/minX5min,取上清；
6)加入1/10體積的3M醋酸鈉，2.5倍體積預冷的無水こ醇，混勻；
7)-20°C放置30min，4°C離心 12000r/minX lOmin，棄上清；
8)70%こ醇洗離心物沉淀一次，離心12000r/minX5min，棄上清；
9)37°C干燥后，加50iUTE溶解沉淀，定量，4°C備用。(3)將PCR擴增產(chǎn)物與pGEM-T Easy載體連接建立連接反應體系(0.5ml離心管): pGEM-T Easy 質(zhì)粒1 ii 1 PCR 反應產(chǎn)物 0.1 ii g/ ill2 ill
T4DNA連接酶1 y 1 10 X T4DNA連接酶緩沖液2.5 ill
加 ddH20 至25 ii 1 混勻，23°C過夜。(4)受體菌制備:
1)取一單菌落ToplO菌種于5mlLB培養(yǎng)液的試管中，37°C振蕩培養(yǎng)4h ；
2)取1.5ml入離心管中，離心10000r/minX IOmin,棄上清；
3)沉淀用冰冷的1OOmMCaCl2洗一次,離心12000r/minX IOmin,棄上清；
4)再用冰冷的1OOmMCaCl2將細菌懸起，4°C備用。(5) pGEM-T Easy/BDNF 轉化 ToplO 菌
1)取連接產(chǎn)物pGEM-TEasy/BDNF 10 u I加入含100 u I ToplO菌的離心管中，混勻；
2)冰上放置30min，42°C熱休克90s，冰上放置2min；
3)加入0.4ml LB培養(yǎng)液，37°C水浴2h ；
4)將LB(含1.2%瓊脂)用微波爐融化后，自然放冷致50°C左右，加入Amp，倒入無菌培養(yǎng)皿中，4°C備用；
5)水浴2h后的轉化菌離心8000r/minX 1Omin,將上清棄到僅余100 U I,全部涂于上一步制備的LB培養(yǎng)皿中；
6)平皿在室溫下正向放置15min后，37°C倒置過夜；
7)第二天可見平皿中有百個菌落生成，挑取其中6個菌落種于5ml含Amp的LB中，37°C振蕩培養(yǎng)過夜。(6)小量提取重組質(zhì)粒DNA——堿裂解法
1)姆個樣本取1.5ml菌液，離心12000r/minX 5min,將液體倒盡；
2)將細菌重懸于預冷的100ill溶液I，劇烈震蕩；
3)加入200新鮮配制的溶液II懸浮，顛倒混勻；
4)加入150預冷的溶液III，顛倒混勻；
5)加入450ii I酹/氯仿抽提一次,離心12000r/minX IOmin ；
6)將上清移入新離心管中，用2.5倍體積預冷的無水こ醇沉淀，4°C離心12000r/minX IOmin,棄上清；
7)沉淀用Iml70%こ醇洗一次,離心12000r/minX 5min,棄上清；
8)37°C干燥30min后，用含RNase的TE 50 U I溶解沉淀，4°C備用。(7)提取的重組質(zhì)粒DNA酶切鑒定 1)建立酶切體系:
質(zhì)粒6個(0.2iig/個)
EcoRIIul
Buffer6 u 1 カロ ddH20 至60 ii 1先將ddH20，Buffer, EcoRI混勻后分裝6管，再加入樣本。37°C溫浴Ih ;
2) 1%瓊脂糖凝膠電泳，紫外燈下觀察電泳凝膠。(8)大量提取重組質(zhì)粒DNA——堿裂解法
1)大搖酶切鑒定陽性的細菌，4°C離心5000r/minX10min，棄上清；
2)用預冷的STE洗一次·細菌，4°C離心5000r/minXlOmin，棄上清；
3)將細菌沉淀物重懸于3ml溶液I中；
4)加溶液新鮮配制的II6ml;
5)加預冷的溶液III4.5ml，搖勻，4°C離心5000r/minX10min，上清移入新管內(nèi)；
6)用等體積的異丙醇沉淀，離心7000r/minXIOmin,棄上清；
7)37°C 干燥 30min 后，用 2ml TE 和 20 yl RNase 溶解，37 °C 溫浴 2h ;
8)等體積的酚/氯仿抽提后，無水こ醇沉淀，_20°C過夜；
9)離心12000r/minX10min，沉淀干燥后，用750U I TE溶解；
10)加入750 u 1 14% 的 PEG8000,1.6M NaCl 沉淀 DNA,離心 12000r/minX IOmin,棄除液相RNA，干燥后，用400 u 1 TE溶解；
11)重復一次步驟8;
12)沉淀用70%こ醇洗一次，離心12000r/minX10min，棄上清，干燥后，用200TE溶解，-20°C備用。2.融合基因BDNf-HA2TAT的克隆 (I)制備 BDNF 和 psscmv-ha2tat 載體
此處應用EcoRI和KpnI酶切，因為KpnI的緩沖液是無鹽的Buffer，所以要分兩次消化，先消化KpnI，再補齊NaCl后消化EcoRI。第一步:消化KpnI:
DT-BDNF 大提質(zhì)粒 liig/yl 5u g (5u I)
KpnI1ul
KpnI緩沖液2 u 1 加 ddH20 至20 ii 1 充分混勻，37 °C 2h。1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。2)psscmv-ha2tat iu g/u I 2u 1KpnI0.5 u 1 KpnI緩沖液2 u 1 加 ddH20 至20 ii 1 充分混勻，37 °C 2h。1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。第二步:消化EcoRI
I) T-BDNF/ KpnI19U 1 EcoRI4 u 1 EcoRI緩沖液5 u 1 加 ddH20 至50 ii 1 充分混勻，37°C 2h。制備1%瓊脂糖凝膠，電泳，膠回收片段，-20°C備用。2) pSSCMV_HA2TAT/ KpnI19 U 1EcoRI0.5 u 1 EcoRI緩沖液3 u 1 加 ddH20 至30 ii 1 充分混勻，37°C 2h。制備1%瓊脂糖凝膠，電泳，膠回收片段，-20°C備用。(2)目的基因片段與psscmv-ha2tat載體連接 建立連接反應體系
T-BDNF0.1 u g/ u 11 u 1 psscmv-ha2tat 0.05u g/u 1i u 1 IOXbuffer2.5 u 1 T4DNA連接酶I y 1 加 ddH20 至25 ii 1 充分混勻，23°C過夜。(3) pSSCMV-BDNF-HA2TAT 轉化 ToplO 菌
方法同步驟I中(5) pGEM-T Easy/BDNF轉化ToplO菌。(4)小提重組質(zhì)粒以及酶切鑒定
方法同步驟I中(6) pGEM-T Easy/BDNF重組質(zhì)粒的小提以及(7)酶切鑒定。酶切鑒定時用EcoRI和BamHI:
Psscmv-BDNF-HA2TAT4 個
EcoRI0.2 Ii 1 BamHI0.2 U 1 IOXbufferI4 U 1 加 ddH20 至40 ill
37°C溫浴lh。1%瓊脂糖凝膠電泳，紫外燈下觀察電泳凝膠。(5)大提質(zhì)粒
方法同步驟I中(8) pGEM-T Easy/BDNF重組質(zhì)粒的大提。定量，-20°C備用。(6)制備BDNf-HA2TAT片段并連接到PUC19質(zhì)粒中測序
I)BDNf-HA2TAT片段和PUC19載體的制備 Psscmv-BDNF-HA2TAT5 U 1 EcoRI0.5 Ii 1 BamHI0.5 U 1 2 XbufferTIOu 1 加 ddH20 至50 ii 1 充分混勻，37°C 2h。1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，膠回收片段。PUC192u 1 EcoRI 0.75 u 1 BamHI 0.75 U 1 2 XbufferTIOu 1 加 ddH20 至50 ii 1充分混勻，37°C 2h。1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，膠回收片段。定量。2) BDNf-HA2TAT 片段連接到 PUC19 質(zhì)粒 BDNf-HA2TAT1 U 1 PUC191 u 1 T4DNA連接酶1 U 1 IOXbuffer2.5 U 1 加 ddH20 至25 ii 1 充分混勻，23°C過夜。(7)基因重組產(chǎn)物的篩選、鑒定
1)應用步驟I(4)中的CaCl2法制備ToplO感受菌；
2)應用步驟I(5)中pGEM-T Easy/BDNF轉化ToplO菌的方法轉化細菌；
3)應用步驟1(6)中的方法小提重組質(zhì)粒；
4)應用步驟I(7)中的方法對小提重組質(zhì)粒進行鑒定；
PUC19- BDNf-HA2TAT5 U 1 EcoRI0.3 u1 BamHI0.3 U 1 2XbufferTIOu 1 加 ddH20 至50 ii 1 37°C溫浴lh。1%瓊脂糖凝膠電泳，紫外燈下觀察電泳凝膠；
5)選電泳結果正確者進行測序。ニ、病毒包裝
1.病毒包裝 (I)轉染前準備
I)復蘇HEK293細胞:取出凍存的HEK293細胞，37°C溫浴約Imin融化。吸出細胞懸液，離心1200rpmX5min，留取細胞沉淀。用19%胎牛血清，DMEM高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)，擴增細胞至直徑15cm的平皿中，待細胞70-80%成片時開始轉染。2)準備輔助質(zhì)粒:
pAAV/Ad 質(zhì)粒(1 yg/yl) 375 ill ;
pAAV/Ad 質(zhì)粒輔助子(pFG140) (1 u g/U I) 375 u I ；
psscmv-bdnf-ha2tat (i y g/ y I) 375 y I。3)準備轉染試劑
陽離子轉染試劑PEL 9ml (8u 1/u g DNA)；
質(zhì)粒稀釋液45ml ；
轉染試劑稀釋液36ml。(2)轉染和收獲重組腺相關病毒AAV/BDNF_HA2TAT
1)將質(zhì)粒3種依次加入45ml質(zhì)粒稀釋液中；
2)將轉染試劑9ml加入36ml轉染試劑稀釋液中；
3)將稀釋后的轉染試劑加入質(zhì)粒稀釋液中，室溫IOmin；
4)每個平皿的293細胞中加入3ml質(zhì)粒和轉染試劑混合液；5)72h后取細胞，將細胞懸存于30ml HEPES buffer中，凍容3次；
6)超聲粉碎細胞，離心10000r/minX20min，留上清，加等體積上的飽和(NH4)2SO4M
淀；
7)4°C過夜，離心12000r/minX20min，取沉淀，容在含Ca、Mg的PBS中，透析三天；
8)離心，除殘渣，·過膜除菌，加保護液分裝，_20°C保存。2.病毒定量——熒光定量PCR
1)取病毒液0.1ml,加入 DNasel 100iU，37°C溫浴 Ih ；
2)加等體積的蛋白酶K 消化液(20mM Tris HCl PH8.0, 20mMEDTA, 0.1%SDS)，37°C溫浴
Ih ；
3)酚/氯仿抽堤，こ醇沉淀，純化核酸備用；
4)建立PCR反應體系:
2 X SYPR Green Mix IOu 1 F引物1yl
R引物1ul
模板1 U 1 加 ddH20 至20 ii 1 PCR 反應引物為:上游引物 F:5’-AAGTCCCGTTGITGAnTTGGTG-3’ (SEQ ID N0.4);下游引物 R:5，-CAAGTACGCCCCCTATTGAC-3，(SEQ ID N0.5)。5) PCR 反應 預變性940C 3min ；
變性94°C lmin,退火54°C lmin,延伸68°C lmin,共40個循環(huán)；
再延伸68 0C 5min。3.免疫組織化學證實BDNF的表達
DHela細胞復蘇后用5%的牛血清，DMEM高糖培養(yǎng)基；
2)用6孔板，細胞計數(shù)1X 105/ml ；
3)過夜后，換成無血清培養(yǎng)液，加病毒液0.1ml，2h后換成完全培養(yǎng)基，72 h后固定做免疫組化。三、結果
1.BDNf-HA2TAT融合基因的構建和鑒定
(I)目的基因BDNF的克隆
采用PCR的方法，以F BDNF質(zhì)粒為模版，克隆出兩端分別帶有EcoRI和KpnI限制性內(nèi)切酶序列；PCR產(chǎn)物與pGEM-T Easy載體相連，應用EcoRI限制性內(nèi)切酶消化，瓊脂糖凝膠電泳鑒定重組質(zhì)粒，陽性質(zhì)粒可見760bp的目的片段(見圖1和圖2)。(2)構建重組質(zhì)粒 pSSCMV-BDNF-HA2TAT
重組質(zhì)粒pGEM-T Easy/BDNF和pSSCMV_HA2TAT載體分別應用EcoRI和KpnI酶切后，將目的基因片段與psscmv-ha2tat載體連接，重組質(zhì)粒psscmv/bdnf-ha2tat經(jīng)EcoRi和BamHI酶切后，瓊脂糖凝膠電泳可見865bp的目的片段(見圖3和圖4)，證實融合基因成功插入載體質(zhì)粒的多克隆位點。(3)融合基因 BDNf-HA2TAT 測序重組質(zhì)粒pSSCMV-BDNF-HA2TAT經(jīng)EcoRl和BamHI酶切制備BDNf-HA2TAT片段并連接到PUC19質(zhì)粒中測序。采用Sanger單鏈末端終止法測出全部的核苷酸序列，應用DNASIS軟件分析比較該序列與設計的序列完全一致(見圖5)
2.重組腺相關病毒的包裝和滴定
包裝分泌表達BDNf-HA2TAT的重組腺相關病毒
用3質(zhì)粒(pAAV/Ad質(zhì)粒、pAAV/Ad質(zhì)粒輔助子、pSSCMV -BDNF-HA2TAT)磷酸鈣共沉淀法轉染293細胞系，轉染的包裝細胞·，繼續(xù)培養(yǎng)72h后，收獲病毒上清。應用熒光定量PCR測定病毒滴度為8.32X 109/ml，應用免疫組織化學證實BDNF的表達(見圖6)。實施例2表達BDNf-HA2TAT的重組腺相關病毒的動物實驗
表達腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子的重組腺相關病毒經(jīng)鼻腦通路進入大腦產(chǎn)生抗抑郁樣作用:C57 BL/6雌性和雄性成年小鼠各分為經(jīng)鼻滴入生理鹽水和BDNF-HA2TAT/AAV兩處理組，兩處理又各分為Id給藥組，連續(xù)5天給藥組和連續(xù)10天給藥組；ld給藥組分別在給藥后1，2,3天進行行為學測試(強迫游泳實驗(forced swimming test, FST)和曠場探究實驗(open-field exploration test, 0PF),連續(xù)5天給藥組和連續(xù)10天給藥組分別在給藥后1,3,7天進行行為學測試(FST和OPF)。C57 BL/6 小鼠經(jīng)鼻給予 BDNF_HA2TAT/AAV:BDNF-HA2TAT/AAV 連續(xù)經(jīng)鼻給藥 5d 和10d，各組小鼠分別在ld，3d，7d進行行為學測試:早上為0PF，晚上為FST。(1)BDNF-HA2TAT/AAV連續(xù)經(jīng)鼻給5d，各組小鼠分別在ld，3d，7d后進行行為學測試:雌性和雄性C57 BL/6小鼠Id后測試組，經(jīng)鼻給予BDNF-HA2TAT/AAV會顯著減少FST6min的不動時間，同時均不會影響OPF的Ih總的活動距離(見圖7和圖8)。(2)BDNF_HA2TAT/AAV連續(xù)經(jīng)鼻給10d，各組小鼠分別在ld，3d，7d后行為學測試:雌性和雄性C57 BL/6小鼠Id后測試組，經(jīng)鼻給予BDNF-HA2TAT/AAV會顯著減少FST 6min的不動時間，同時均不會影響OPF的Ih總的活動距離；雌性C57 BL/6小鼠7d后測試組，經(jīng)鼻給予BDNF-HA2TAT/AAV會顯著減少FST 6min的不動時間，同時均不會影響OPF的Ih總的活動距離，但是雄性C57 BL/6小鼠7d后測試組，經(jīng)鼻給予BDNF-HA2TAT/AAV在顯著減少FST 6min的不動時間的同時會增加OPF Ih總的活動距離(見圖9和圖10)。結論:分泌表達BDNf-HA2TAT的重組腺相關病毒可感染鼻粘膜細胞，經(jīng)鼻給藥達到一定劑量時在正常C57BL/6小鼠產(chǎn)生抗抑郁樣作用，其中雌鼠對這種給藥方式更敏感，效果也更持久。以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，應當指出，對于本技術領域的普通技術人員，在不脫離本發(fā)明方法的前提下，還可以做出若干改進和補充，這些改進和補充也應視為本發(fā)明的保護范圍。
權利要求
1.一種表達BDNf-HA2TAT的重組腺相關病毒，其特征在于，所述的表達BDNf-HA2TAT的重組腺相關病毒是由下列方法構建得到的: a、克隆BDNFcDNA融合基因，將PCR產(chǎn)物連接入pGEM_T Easy載體，獲得的pGEM_TEasy/BDNF轉化受體菌^: Coli DH5 a，堿裂解法提取重組質(zhì)粒DNA ； b、酶切獲取帶有粘性末端的BDNF基因，將BDNF基因插入攜帯穿膜肽TAT的載體質(zhì)粒pSSCMV-HA2TAT，構建重組載體質(zhì)粒 pSSCMV-BDNF_HA2TAT ； C、在磷酸鈣作用下，重組載體質(zhì)粒pSSCMV-BDNF-HA2TAT、包裝質(zhì)粒pAAV/Ad和輔助質(zhì)粒PFG140三質(zhì)粒共轉染HEK293細胞，轉染的包裝細胞繼續(xù)培養(yǎng)，收獲病毒上清，即表達BDNF-HA2TAT的重組腺相關病毒。
2.根據(jù)權利要求1所述的表達BDNf-HA2TAT的重組腺相關病毒，其特征在于，所述的BDNF cDNA具有SEQ ID N0.1所述的核苷酸序列。
3.根據(jù)權利要求1所述的表達BDNf-HA2TAT的重組腺相關病毒，其特征在于，所述的步驟a中BDNF基因擴增的上游引物和下游引物分別具有SEQ ID N0.2和SEQ ID N0.3所述的核苷酸序列。
4.一種表達BDNf-HA2TAT的重組腺相關病毒的構建方法，其特征在于，所述的構建方法包括以下步驟: a、克隆BDNFcDNA融合基因，將PCR產(chǎn)物連接入pGEM_T Easy載體，獲得的pGEM_TEasy/BDNF轉化受體菌^: Coli DH5 a，堿裂解法提取重組質(zhì)粒DNA ； b、酶切獲取帶有粘性末端的BDNF基因，將BDNF基因插入攜帯穿膜肽TAT的載體質(zhì)粒pSSCMV-HA2TAT，構建重組載體質(zhì)粒 pSSCMV-BDNF_HA2TAT ； C、在磷酸鈣作用下，重組載體質(zhì)粒pSSCMV-BDNF-HA2TAT、包裝質(zhì)粒pAAV/Ad和輔助質(zhì)粒PFG140三質(zhì)粒共轉染HEK293細胞，轉染的包裝細胞繼續(xù)培養(yǎng)，收獲病毒上清，即表達BDNF-HA2TAT的重組腺相關病毒。
5.根據(jù)權利要求4所述的構建方法，其特征在于，所述的BDNFcDNA具有SEQ ID N0.1所述的核苷酸序列。
6.根據(jù)權利要求4所述的構建方法，其特征在于，所述的步驟a中BDNF基因擴增的上游引物和下游引物分別具有SEQ ID N0.2和SEQ ID N0.3所述的核苷酸序列。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種表達BDNF-HA2TAT的重組腺相關病毒及其構建方法。本發(fā)明優(yōu)點在于本發(fā)明構建了攜帶融合基因BDNF-HA2TAT的腺相關病毒載體BDNF-HA2TAT/AAV，表達BDNF-HA2TAT的重組腺相關病毒即可以分泌表達大分子蛋白BDNF，表達的BDNF又有穿過血腦屏障作用，同時將BDNF基因序列導入AAV載體，可以持續(xù)分泌表達BDNF，解決了BDNF需反復給藥的難題；通過抗抑郁效力篩選實驗證明了可分泌表達BDNF-HA2TAT的重組腺相關病毒具有抗抑郁的作用，建立了一種有效預防和治療抑郁障礙和應激障礙等精神疾病的手段和方法。
文檔編號C12N15/63GK103087997SQ20111033223
公開日2013年5月8日 申請日期2011年10月28日 優(yōu)先權日2011年10月28日
發(fā)明者高成閣, 馬現(xiàn)倉, 黨永輝, 楊廣笑, 李強, 陳策, 楊小波, 郭麗陽 申請人:西安交通大學醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院