專利名稱：：治療帕金森病的可調(diào)控雙基因表達的重組腺病毒伴隨病毒載體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于基因治療帕金森病領(lǐng)域，特別是利用四環(huán)素誘導(dǎo)雙基因表達治療帕金森病的腺病毒伴隨病毒(adeno-associatedbvirus，AAV)載體構(gòu)建。該載體攜帶的基因是人膠質(zhì)源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(humanglial-derivedneurotrophicfactor，hGDNF)基因和人酪氨酸羥化酶(humantyrosinehydroxylase，hTH)基因，它們由一個四環(huán)素調(diào)控反應(yīng)的雙向啟動子進行轉(zhuǎn)錄控制，外側(cè)有多聚腺苷酸序列和腺病毒伴隨病毒的兩端ITR；同時涉及了在體治療和體外培養(yǎng)細胞水平，如何導(dǎo)入治療基因的方法，便于治療帕金森病的使用，可以根據(jù)癥狀的變化，服用四環(huán)素類藥物對治療基因的表達進行調(diào)控。帕金森病(Parkinson’sdisease，PD)是發(fā)生在中老年人一種常見的神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，由于黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元變性，造成紋狀體多巴胺(Dopamine，DA)含量下降，導(dǎo)致震顫、肌僵直和運動減少等癥狀，嚴重者可以致殘，影響患者的生活質(zhì)量，給患者家庭和社會造成沉重負擔(dān)。目前治療方法主要是沿用60年代開始的左旋多巴(L-DA)替代療法，雖可使癥狀緩解，但無法阻止病情發(fā)展，長期用藥副作用大，且產(chǎn)生“開關(guān)”現(xiàn)象，失去療效。近年開展起來應(yīng)用電針毀損紋狀體治療帕金森氏病方法，適應(yīng)癥窄，只對以震顫、肌僵直等癥狀為主的PD療效較好，且還需藥物輔助治療，療效維持時間有限。因此，尋找一種全新的治療方法已迫在眉睫。隨著分子生物學(xué)技術(shù)發(fā)展和人類基因組計劃的實施，基因治療帕金森病成為研究熱點之一。近幾年來基因治療PD取得不小進展，主要采用向腦內(nèi)導(dǎo)入基因并表達(1)神經(jīng)營養(yǎng)因子[1]如神經(jīng)生長因子、膠源性神經(jīng)營養(yǎng)因子等，特別是GDNF[2]，能預(yù)防多巴胺能神經(jīng)元的變性死亡，促使病變的DA能神經(jīng)元結(jié)構(gòu)和功能恢復(fù)。(2)神經(jīng)遞質(zhì)合成酶主要是酪氨酸羥化酶[3]，它是DA合成的限速酶。這些雖都取得了較好的療效，但仍存在問題，那就是導(dǎo)入TH基因，可以緩解臨床癥狀，但不能阻止多巴胺能神經(jīng)元的持續(xù)變性壞死，最終導(dǎo)致病情惡化；而導(dǎo)入GDNF基因，雖然保護了殘存的多巴胺能神經(jīng)元，防止病情惡化，但對已存在的癥狀卻得不到改善和恢復(fù)。因此，選擇合適的目的基因?qū)胫涟屑毎?，并在其中長期、穩(wěn)定、可調(diào)控的表達，是基因治療成敗的關(guān)鍵?；蛑委熥钤缡前讶笔У幕?qū)氲綑C體治療遺傳性疾病，隨著分子生物學(xué)和基因工程技術(shù)的發(fā)展，越來越多的相關(guān)基因從疾病中分離、鑒定出來，改變了人們關(guān)于基因治療的概念，現(xiàn)在通常指采用設(shè)計的方法將有功能和活性的治療基因?qū)氲桨屑毎虬薪M織，轉(zhuǎn)錄翻譯成有功能的活性蛋白、細胞因子、細胞膜受體或任何能調(diào)節(jié)細胞生長、分化的蛋白質(zhì)，通過調(diào)節(jié)信號通道或轉(zhuǎn)錄方式在細胞內(nèi)起作用，或者被細胞分泌到細胞外產(chǎn)生生物學(xué)作用。開始基因治療只能采用間接導(dǎo)入方法，就是把體細胞從機體上取出來，在體外用重組DNA轉(zhuǎn)染或感染后，再移殖到體內(nèi)進行治療。隨著技術(shù)的發(fā)展，發(fā)明了一些新方法可以把治療基因直接導(dǎo)入到機體組織里，如用脂質(zhì)體包裹DNA[4]、結(jié)合了病毒殼受體的蛋白脂質(zhì)體、磷酸鈣共沉淀DNA、DNA與多聚賴氨酸-糖蛋白的復(fù)合物等方法。除了上述非病毒載體外，最常用的就是借助用重組的復(fù)制缺陷型病毒載體攜帶治療基因?qū)氲姆椒ā２《据d體具有天然的感染能力，轉(zhuǎn)染效率高；這些病毒在基因治療中的應(yīng)用，依賴于對這些病毒載體改造的策略、制備的優(yōu)化等研究，一些病毒載體已經(jīng)被改造成有效運輸治療基因的工具[5]。常用的有單純皰疹病毒(herpessimplexvirus，HSV)、人類免疫缺陷病毒(humanimmunodeficiencyvirus，HIV)、逆轉(zhuǎn)錄病毒(retrovirus，RV)、腺病毒(Adenovirus，Ad)和腺病毒伴隨病毒(AAV)等載體。HSV病毒具有嗜神經(jīng)性，與HIV病毒一道作為載體，具有攜帶基因容量大，導(dǎo)入基因效率高、感染的靶細胞廣泛等優(yōu)點，但由于本身攜帶有病毒基因序列，容易產(chǎn)生野生型病毒的污染和介導(dǎo)的外源基因表達時間短。目前的HSV介導(dǎo)的離體試驗和在體試驗均觀察到明顯的細胞毒性[6]。逆轉(zhuǎn)錄病毒是應(yīng)用最廣泛的病毒載體之一，它能夠隨機插入靶細胞的染色體中，穩(wěn)定表達。通常載體上攜帶有治療基因和病毒復(fù)制、包裝信號的長末端重復(fù)序列(longterminalrepeats，LTRs)，包裝細胞系可整合缺陷型前病毒的全長基因，但是沒有LTRs，本身不能包裝出病毒顆粒，當(dāng)將載體轉(zhuǎn)染到具有輔助功能的包裝細胞系時，就可以把治療基因包裝進逆轉(zhuǎn)錄病毒顆粒中，純化后應(yīng)用[7]。但是它的缺點也是顯而易見的，主要表現(xiàn)在穩(wěn)定性差，純化過程中易導(dǎo)致病毒滴度降低、只能感染整合到分裂的細胞，像成熟的神經(jīng)細胞等不分裂或復(fù)制慢的靶細胞不適合使用該載體、隨機插入細胞染色體可能激活原癌基因或抑制腫瘤抑制基因引起癌癥、一定時間后導(dǎo)入的基因表達水平降低、血清補體使逆轉(zhuǎn)錄病毒迅速失活和發(fā)生變化重組成能完全復(fù)制及自我包裝的野生病毒等，此外，逆轉(zhuǎn)錄病毒可導(dǎo)致某些動物致病，包括人類，因此，人們對它的安全性一直感到擔(dān)心[8]。使用腺病毒載體可克服逆轉(zhuǎn)錄病毒的許多缺點，人腺病毒是一種雙鏈DNA病毒，長約36kb，通過細胞膜受體介導(dǎo)的細胞內(nèi)吞作用進入細胞內(nèi)。它易培養(yǎng)和操作，能被敲除的DNA序列多，非常適宜做載體；特別是感染的靶細胞范圍廣，與逆轉(zhuǎn)錄病毒不同，它既可以感染分裂細胞，又可以感染非分裂細胞，如人呼吸道上皮細胞、造血細胞、脊髓等都是它的感染宿主；由于DNA不能整合到宿主的染色體，增加了安全性；此外，容易制備、滴度高，穩(wěn)定性好，容易純化和保存。盡管有這些優(yōu)點，它仍不可避免地也存在一些缺點。由于DNA不能整合到宿主的染色體上，它攜帶的基因表達時間短，隨著細胞的分裂而消失，一般只可表達兩個月。另外，載體表達的病毒蛋白可以引起機體的體液和細胞免疫反應(yīng)，導(dǎo)致感染的細胞死亡、被排除[9][10]。因此，腺病毒載體不適宜攜帶需長久表達的基因，而重復(fù)使用可增強機體免疫排斥反應(yīng)，故應(yīng)用的次數(shù)有限，這些都限制了它的應(yīng)用。AAV是一種帶有4681個核苷酸的單鏈DNA病毒，屬于微小病毒屬依賴病毒亞屬，至盡為止，還沒有發(fā)現(xiàn)對人致病。它的開放讀框主要編碼Rep(replication)和Cap(capsid)蛋白，在它的兩側(cè)是兩個145個核苷酸長的反向末端重復(fù)序列(invertedterminalrepeatsequences，ITR)，ITR可以折疊形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)，作為病毒復(fù)制起始時的引物，此外，它還是病毒整合、從宿主細胞中拯救、將病毒染色體DNA包裹在病毒蛋白殼內(nèi)和促進病毒成熟的必須元件[11]。AAV經(jīng)感染進入細胞內(nèi)后，有兩種變化途徑一種是當(dāng)存在輔助病毒時，AAV進入細胞裂解狀態(tài)，此時，病毒DNA轉(zhuǎn)錄、復(fù)制、包裝成新的病毒顆粒；當(dāng)沒有輔助病毒的功能存在時，AAV的ITR與宿主DNA序列之間通過重組，以原病毒的形式整合到宿主染色體上，分析發(fā)現(xiàn)它是特異性地整合到人19號染色體的長臂上[12]。ITR并不像LTR一樣具有轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)功能，與逆轉(zhuǎn)錄病毒相比，降低了插入誘發(fā)癌癥的機率?，F(xiàn)在發(fā)現(xiàn)AAV載體感染細胞后，有三種存在方式除了上面提到的定點整合外，還有隨機插入和游離于宿主染色體外的方式。因為它最大的包裝容量是4.7kb，所以缺陷是攜帶的基因容量小。如治療的靶基因較小，則不存在這些問題。原先人們不知道AAV哪些序列決定了將DNA進行復(fù)制、包裝成病毒顆粒的，現(xiàn)在知道，ITR在這個過程中起了關(guān)鍵作用，同時還決定了載體DNA同宿主染色體的整合，在基因治療PD病中具有光明的應(yīng)用前景[13]?；蛑委熥呦蚺R床應(yīng)用，解決最重要的兩個問題是長期、穩(wěn)定、安全表達和調(diào)控表達[14]，調(diào)控表達是指對表達量或/和表達時間進行調(diào)控。自從Gossen和Bujard[15]于1992年發(fā)明四環(huán)素調(diào)控系統(tǒng)以來，多次對它進行改進，此外又發(fā)明了糖皮質(zhì)激素調(diào)控系統(tǒng)和金屬硫蛋白調(diào)控系統(tǒng)等[16]，但以四環(huán)素調(diào)控系統(tǒng)最為靈敏、安全、副作用小，這是一個藥物劑量依賴性的調(diào)控表達系統(tǒng)，它由兩個元件組成四環(huán)素轉(zhuǎn)錄激活子(tetracyclinetransactivator，tTA)和四環(huán)素操縱子部分序列與巨細胞病毒即刻啟動子核心序列融合構(gòu)成的啟動子。有人將四環(huán)素調(diào)控系統(tǒng)裝載到HIV、Ad病毒載體中應(yīng)用，都獲得了較好的結(jié)果，而AAV載體由于包裝容量小，還沒有做到對外源基因表達進行調(diào)控。我們在以前的研究工作中，克隆了人的GDNF基因，并將它與人TH基因分別裝到Ad或AAV載體上，包裝成重組Ad或AAV病毒，感染神經(jīng)源性細胞系和原代培養(yǎng)的神經(jīng)細胞，證實能夠長期、穩(wěn)定的表達。采用腦立體定向注射方法，應(yīng)用于SD大鼠PD模型，治療PD取得較好的治療效果[17]，但是仍存在缺陷，就是不論病情輕重、痊愈與否，導(dǎo)入的目的基因均不受影響而持續(xù)表達；此外，這兩個基因由于分別包裝成病毒，不能保證將這兩個基因?qū)胪粋€靶細胞中產(chǎn)生協(xié)同作用。本發(fā)明改變了這種狀況，我們構(gòu)建了一個可受四環(huán)素調(diào)控的雙基因表達AAV載體，在載體上提供了AAV兩端ITR，ITR之間有一個四環(huán)素調(diào)控的雙向啟動子、它的兩端分別帶有各自的多克隆酶切位點和多聚腺苷酸序列，我們曾將增強型綠色熒光蛋白(EGFP)基因和紅色熒光蛋白(RFP)基因克隆到這兩個載體上，轉(zhuǎn)染細胞，證明可以表達EGFP和RFP并受四環(huán)素調(diào)控，呈劑量依賴性關(guān)系。把人TH(hTH)和人GDNF(hGDNF)基因克隆到這個可調(diào)控的AAV載體上，包裝成AAV病毒，感染靶細胞或靶組織，能夠根據(jù)需要長久持續(xù)表達，產(chǎn)生協(xié)同作用，保護DA能神經(jīng)元，防止退行性變，并增加DA合成分泌，改善和消除PD癥狀，治愈PD；同時，通過藥物誘導(dǎo)四環(huán)素調(diào)控系統(tǒng)，減少或關(guān)閉TH和GDNF基因的表達，達到安全、無副作用的目的。隨本發(fā)明，我們還提出了使用本產(chǎn)品的方法。用于本發(fā)明的原始生物材料pDsRed1-N1購買自CLONTECH公司生產(chǎn)的商業(yè)化質(zhì)粒。pKS^BtTA本單位在INVITROGEN公司的質(zhì)粒pKS基礎(chǔ)上構(gòu)建的質(zhì)粒，攜帶有四環(huán)素轉(zhuǎn)錄激活子tTA的序列pSV-bi本單位構(gòu)建并保存的四環(huán)素可調(diào)控的AAV載體質(zhì)粒，有兩個多克隆酶切位點，能同時攜帶兩個基因。pAV53本單位保存的AAV載體質(zhì)粒，在兩個ITR之間攜帶有多克隆酶切位點，見附圖1。pcDNAGDNF本單位在CLONTECH公司商業(yè)化質(zhì)粒pcDNA3基礎(chǔ)上構(gòu)建的質(zhì)粒，攜帶有人GDNF基因，它是本單位從人胎腦中用PCR的方法克隆得到的基因，DNA序列附后，見序列1。人TH基因本單位保存在pcDNA3上的人TH3型基因，見序列2。以上質(zhì)粒的宿主菌為Escherichiacoli大腸桿菌MAXEFFICIENCYDH5α(GIBCO#18528-012)。pSVbiGDNFTH的構(gòu)建過程見附圖2，首先用XhoI和HindIII將GDNF從pcDNAGDNF中切下，回收后連接到經(jīng)同樣酶切、回收處理的質(zhì)粒pAV53載體上，構(gòu)建成pAVGDNF；用XbaI+BamHI兩個限制性內(nèi)切酶把tTA基因從pKS^BtTA上切下，代之以用同樣酶切pAVGDNF得到的GDNF，構(gòu)成質(zhì)粒pKS^BGDNF，接著，用BamHI酶切、Klenow酶補平、連接的過程，將質(zhì)粒pKS^BGDNF的BamHI去除，再用XhoI+SalI雙酶切pKS^BGDNF，回收小片段，為GDNF-polyA；用XhoI對pSV-bi進行限制性酶切后，與前面得到的GDNF-polyA混合，用T4DNA連接酶連接載體和片斷，經(jīng)轉(zhuǎn)化、挑克隆、DNA的小量提取，得到單克隆，用XhoI+SalI雙酶切進行鑒定正確后，得到質(zhì)粒pSVbiGDNF，最后用BamHI+EcoRI將TH基因連接到pSVbiGDNF上，構(gòu)建成pSVbiGDNFTH。本發(fā)明構(gòu)建的AAV載體質(zhì)粒pSVbiGDNFTH，其宿主菌為Escherichiacoli大腸桿菌MAXEFFICIENCYDH5α(GIBCO#18528-012)。本發(fā)明的特征及用途本發(fā)明的特征在于將雙向四環(huán)素反應(yīng)啟動子、兩個治療基因、多聚腺苷酸序列構(gòu)建到AAV的兩個ITR之間，自從5’端至3’端如下AAV-2型的5’ITR、多聚腺苷酸序列-1、人GDNF序列、雙向四環(huán)素反應(yīng)啟動子、人TH序列、多聚腺苷酸序列-2和3’ITR序列；兩個ITR之外，AAV載體質(zhì)粒上有氨芐青霉素抗性基因表達盒和新霉素抗性基因表達盒。物理圖譜及酶切鑒定圖譜見附圖3。本發(fā)明所使用的方法涉及到病毒學(xué)、微生物學(xué)、分子生物學(xué)和重組DNA技術(shù)等，都是現(xiàn)有的、公開的、常用的技術(shù)，沒有使用獨有的技術(shù)。1.AAV載體質(zhì)粒本發(fā)明使用AAV的ITR核酸序列是血清2型，其序列已知，由于ITR序列是AAV病毒的復(fù)制、整合、拯救和包裝所必需的順式作用元件(見序列3)，具有轉(zhuǎn)錄啟動子的活性，各個ITR的作用是相同的，因此載體質(zhì)粒上的兩個ITR可以是相同的，也可以不同，可以換成其它血清型的ITR，例如血清1、3、4、5、6、和7型，也可以是對ITR進行核苷酸突變、替換、缺失等處理后的序列，，也可以在ITR的D區(qū)插入一個D區(qū)序列，構(gòu)成雙D區(qū)序列的ITR等。TH和GDNF基因在本發(fā)明中使用的是人源性3型TH和我們自己從人胚胎腦中克隆的GDNF，其中GDNF只有561核苷酸，與以往發(fā)現(xiàn)的基因有差別[18]，在細胞和動物上研究發(fā)現(xiàn)有生物活性[17]。但是為了治療帕金森病的需要，也可以使用不同的基因，只要能有相同的生物活性。如芳香族氨基酸脫羧酶(AromaticL-aminoacidDecarboxylase，AADC)[19]、GTP環(huán)水化酶(GTPCyclohydroxylaseI，GTPCHI)[20]和成纖維細胞生長因子、腦源性生長因子、神經(jīng)生長因子等，有實驗表明TH和GTP環(huán)水化酶共同應(yīng)用治療帕金森病，較單用TH產(chǎn)生更好的治療效果[11]；因此在本發(fā)明的基礎(chǔ)上改進，用GTP環(huán)水化酶代替GDNF，與TH一道治療帕金森病將也會產(chǎn)生滿意的療效。另外，老年性癡呆同帕金森病一樣，都屬于神經(jīng)退行性變，它們有相似的病理改變，本發(fā)明有可能在不遠的將來，通過替換治療靶基因也可用于治療其它神經(jīng)退行性疾病。四環(huán)素反應(yīng)啟動子由7個Tn10轉(zhuǎn)座子的tetR結(jié)合序列(tetO)與去掉增強子的人巨細胞病毒即刻早期啟動子(minimalCMVpromoter)融合組成的，而雙向四環(huán)素啟動子是在tetO的另一端再融合一個相同的CMV啟動子(見序列4)，當(dāng)轉(zhuǎn)錄激活子與tetO結(jié)合，激活啟動子，可使轉(zhuǎn)錄向兩個方向進行；而四環(huán)素存在時，則使轉(zhuǎn)錄停止。CMV啟動子是強啟動子，根據(jù)需要，換用其它啟動子，如TK啟動子、逆轉(zhuǎn)錄病毒和小鼠乳房病毒的LTR啟動子、SV40早期啟動子、RSV啟動子、融合的啟動子或雜合啟動子等。為了使轉(zhuǎn)錄能夠?qū)崿F(xiàn)靶向性，除了使用特異性啟動子轉(zhuǎn)錄tTA外，還可以用膠質(zhì)纖維酸性蛋白啟動子等替代tetO兩端的CMV啟動子。另外，tetO可以由7個增多或減少，最多減少為1個tetO序列，或者進行突變，仍然保留與tTA特異結(jié)合的性質(zhì)。為了改變治療基因平常的分泌狀態(tài)，可以將四環(huán)素反應(yīng)系統(tǒng)換成“teton”，即加入四環(huán)素，治療基因進行轉(zhuǎn)錄、表達，當(dāng)撤除四環(huán)素時，治療基因轉(zhuǎn)錄停止，不進行表達。本發(fā)明使用兩種不同的SV40多聚腺苷酸連接在治療基因的3’端(見序列5、6)，能夠使轉(zhuǎn)錄、翻譯得以順利進行，這兩個多聚腺苷酸序列可以相同或不同，但一般認為當(dāng)兩個polyA不相同時，可以增加轉(zhuǎn)錄、翻譯的數(shù)量。它可以是下面的序列，但不限制本發(fā)明使用其它可以穩(wěn)定mRNA的核苷酸序列AUUAA、AAUUAA、AAUACA、AAUAAC、CAUAAA。該質(zhì)粒的構(gòu)建，可以用其它的途徑實現(xiàn)。例如，直接將AAVITR之間的基因編碼區(qū)用限制性內(nèi)切酶切除，換上本發(fā)明ITR之間的DNA序列；當(dāng)然，還有其它的辦法，如用DNA序列人工合成的方式就可以達到這個目的。2.病毒的生產(chǎn)與純化AAV病毒的生產(chǎn)需要以下四種成分參與第一.載體成分，含有治療基因的表達單位，其兩端是AAV的ITR，后者是AAV復(fù)制與包裝所需的最短的順式作用序列；第二.AAV的復(fù)制蛋白Rep和包裝蛋白Cap，支持重組AAV的復(fù)制與包裝，一般由助手質(zhì)粒反式提供；第三.輔助病毒，通常為腺病毒或HSV-1；第四.合適的細胞株。而本發(fā)明的載體質(zhì)粒是攜帶治療基因的載體成分，攜帶有ITR，適合生產(chǎn)的細胞株有酵母細胞、昆蟲細胞、哺乳細胞等，一般選用人胚腎細胞系(ATCCCRL1573)或BHK-21細胞系，先用腺病毒5型感染細胞系，再通過載體質(zhì)粒與攜帶Rep和Cap基因的助手質(zhì)粒共感染生產(chǎn)細胞，包裝出重組AAV，攜帶有治療基因。因為本發(fā)明的質(zhì)粒帶有新霉素抗性表達盒，可以采用先將助手質(zhì)粒與pSVbiGDNFTH轉(zhuǎn)染到BHK-21細胞系或293細胞系，在含有G418的培養(yǎng)基的條件下，篩選陽性細胞系，再感染輔助病毒，治療基因被包裝成重組AAV病毒。包裝成的病毒有許多方法可以進行純化。將病毒產(chǎn)品凍融3～4次后，加熱56℃、30～55分鐘；或者三氯甲烷等滅活輔助病毒，離心去除細胞碎片，接著用過硫酸胺、聚乙二醇等沉淀AAV進行粗提，接著用氯化銫超速離心(1.41～1.43g/cm3)或通過各種柱子進行純化，經(jīng)過這些過程，去除了輔助病毒、細胞碎片、輔助病毒的蛋白和核酸等污染物。rAAV載體理化性質(zhì)較為穩(wěn)定，可以-20℃保存數(shù)年，用于基因治療、制備轉(zhuǎn)基因鼠和體外轉(zhuǎn)染細胞等。3.可調(diào)控的AAV載體質(zhì)粒pSVbiGDNFTH對基因的轉(zhuǎn)染可將攜帶的基因轉(zhuǎn)染到細胞和體內(nèi)靶組織。用于質(zhì)?；駾NA轉(zhuǎn)染的方法很多，有脂質(zhì)體、磷酸鈣、電轉(zhuǎn)、直接注射到細胞內(nèi)等方法，將pSVbiGDNFTH和攜帶tTA的載體共轉(zhuǎn)染到細胞內(nèi)，用選擇性培養(yǎng)基篩選得到陽性細胞進行培養(yǎng)，當(dāng)細胞為神經(jīng)干細胞時，先共轉(zhuǎn)染DNA，再用血清和加入細胞因子的培養(yǎng)基培養(yǎng)促使細胞定向誘導(dǎo)、分化，并表達導(dǎo)入的基因，將獲得的轉(zhuǎn)基因細胞注射到體內(nèi)治療帕金森病或制做轉(zhuǎn)基因動物，也可以凍存?zhèn)溆谩．?dāng)轉(zhuǎn)染到體內(nèi)時，也是用上面提到的方法，將pSVbiGDNFTH和攜帶tTA的載體混合，用脂質(zhì)體等包裹注射到靶組織中。4.重組AAV在體外和體內(nèi)的感染一般重組AAV可以通過感染方式將攜帶的基因?qū)氲桨屑毎虬薪M織。當(dāng)感染細胞時，培養(yǎng)成纖維細胞或神經(jīng)干細胞，感染了重組AAV(攜帶治療基因)和攜帶tTA的AAV，凍存?zhèn)溆没蛑苯右浦驳侥X紋狀體；或者其它細胞，這種細胞可以是來源于患者的體細胞，也可以是培養(yǎng)的細胞系，只要在體內(nèi)不會引起免疫反應(yīng)或產(chǎn)生腫瘤。將治療基因和tTA導(dǎo)入腦內(nèi)的方法與細胞的導(dǎo)入方法比較，前者要簡單的多，只需把重組AAV(攜帶治療基因)、攜帶tTA的AAV與適當(dāng)?shù)淖魟┗旌?，如注射用水、生理鹽水、緩沖液等，立體定向注射到腦紋狀體或靶組織。以上的產(chǎn)品組成都可以采用包裝成治療盒等形式，以方便運輸、保存和使用。5.重組AAV數(shù)量與療效重組AAV在體內(nèi)的表達可以維持12個月以上，在治療過程中，要考慮使用AAV的數(shù)量，以便治療基因的表達量要達到治療的藥物劑量，另外，當(dāng)表達過高時，口服四環(huán)素類藥物，降低治療基因的表達，當(dāng)治療基因的表達量低時，及時重復(fù)注射重組AAV，使基因的表達能夠持續(xù)、穩(wěn)定、可調(diào)控表達。在基因治療的過程中，還可以配合使用藥物治療，例如L-多巴等。實施例以下實施例對四環(huán)素調(diào)控重組腺病毒伴隨病毒載體攜帶雙基因治療帕金森病的用途作了詳細說明，但并不意味著限制本發(fā)明的內(nèi)容。實施例1質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染神經(jīng)干細胞參照MolecularCloning-ALaboratoryManual，2nded.(SzmbroolJ.etal，1996))用堿裂解法大量制備質(zhì)粒DNA，聚乙二醇(PEG)沉淀法進行純化。用無血清神經(jīng)細胞培養(yǎng)基體外培養(yǎng)人神經(jīng)干細胞，當(dāng)細胞長至40～60％時，用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染的方法，進行DNA轉(zhuǎn)染實驗預(yù)先準備2個無菌小離心管，分別準備溶液A和溶液B。于A管中加入5μgpSVbiGDNFTH和5μg的pUHD15-1DNA及200μl無血清、無抗菌素的DMEM/F12(含N2)培養(yǎng)液，充分混勻，即得溶液A；于B管中加入10μlLipofectamineReagent和190μl無血清、無抗菌素的DMEM/F12(含N2)培養(yǎng)液，充分混勻，即得溶液B。將A液和B液混合，得溶液C，室溫放置15～45min，使質(zhì)粒DNA充分被LipofectamineReagent包裹。這期間，用無血清神經(jīng)細胞培養(yǎng)液輕柔地將細胞沖洗2～3次，隨后加入3.8ml培養(yǎng)液和0.4mlC液，于5％CO2孵箱內(nèi)37℃培養(yǎng)8～10小時，換去無血清培養(yǎng)液，用含血清、抗菌素的神經(jīng)細胞培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)24～36小時，同時加入細胞因子對神經(jīng)干細胞進行定向誘導(dǎo)，在培養(yǎng)液中采用無限稀釋法將分化的神經(jīng)細胞培養(yǎng)到96孔板，達到0～1個細胞/孔，每3～4天換液一次，在培養(yǎng)液中加入G418(150～200μg/ml)，當(dāng)長成克隆時，換用無血清培養(yǎng)液培養(yǎng)24小時，再改用含血清的神經(jīng)細胞培養(yǎng)液，把無血清培養(yǎng)液收集，用ELISA(enzyme-linkedimmunosorbentassay)方法檢測GDNF的含量，用反向高壓液相(HPLC)的方法檢測多巴胺的含量，挑選產(chǎn)量高的細胞株進行擴大培養(yǎng)。實施例2質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染人成纖維細胞質(zhì)粒DNA的大量制備同實施例1。用DMEM培養(yǎng)液體外培養(yǎng)人成纖維細胞，當(dāng)細胞長至60～70％時，用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染的方法，將5μg的pSVbiGDNFTH和5μg的pUHD15-1共轉(zhuǎn)染到細胞內(nèi)，20小時后，在培養(yǎng)液中加入G418(250～300μg/ml)，采用無限稀釋法將分化的神經(jīng)細胞培養(yǎng)到96孔板，達到0～1個細胞/孔，每3～4天換液一次，當(dāng)長成克隆時，換用無血清培養(yǎng)液培養(yǎng)24小時，再改用含血清的神經(jīng)細胞培養(yǎng)液，把無血清培養(yǎng)液收集，用ELISA方法檢測GDNF的含量，用反向高壓液相(HPLC)的方法檢測多巴胺的含量，挑選產(chǎn)量高的細胞株進行擴大培養(yǎng)。實施例3重組AAV-GDNF-TH感染小鼠原代培養(yǎng)的中腦神經(jīng)細胞1.生產(chǎn)細胞的制備質(zhì)粒DNA的大量制備同實施例1，BHK-21細胞是人腎小管上皮細胞，本所保存。細胞復(fù)蘇后，傳入25cm2的玻璃細胞培養(yǎng)瓶，在1640培養(yǎng)液(GIBCO公司產(chǎn)品)中培養(yǎng)，待細胞長至60～70％即可進行DNA轉(zhuǎn)染實驗預(yù)先準備2個無菌小離心管，分別準備溶液A和溶液B。于A管中加入5～8μg載體質(zhì)粒DNA和200μl無血清、無抗菌素的DMEM培養(yǎng)液，充分混勻，即得溶液A；于B管中加入10μlLipofectamineReagent和190μl無血清、無抗菌素的DMEM培養(yǎng)液，充分混勻，即得溶液B。將A液和B液混合，得溶液C，室溫放置15～45分鐘，使質(zhì)粒DNA充分被LipofectamineReagent包裹。這期間，用無血清DMEM培養(yǎng)液輕柔地將細胞沖洗2～3次，隨后加入3.8ml培養(yǎng)液和0.4mlC液，于5％CO2孵箱內(nèi)37℃5～6小時，換去轉(zhuǎn)染培養(yǎng)液，用含血清、抗菌素的常規(guī)培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)18～24小時，然后將細胞傳入一個六孔板，待細胞貼壁后，用G418選擇培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，以篩選抗藥性細胞克隆。G418的劑量從200μg/ml培養(yǎng)液開始，每兩天遞增200μg/ml，直至升到800μg/ml。待多克隆細胞形成后，用0.125％胰酶、0.15％EDTA消化細胞，并傳入25cm2培養(yǎng)瓶，繼續(xù)在含有800μg/mlG418的選擇培養(yǎng)液中培養(yǎng)。此后傳代、凍存、保種，得包裝細胞系BHK/GDNF-TH。2.重組腺病毒伴隨病毒的制備、純化和檢測細胞大量擴增，進行轉(zhuǎn)瓶(110mm×480mm，Wheaton公司產(chǎn)品)培養(yǎng)，細胞長滿后(約為6～8×108個細胞)用攜帶Rep和Cap的HSV-1感染(MOI為0.1～1.0)。當(dāng)48小時細胞完全病變、變圓、容易脫落時，蓋緊瓶蓋劇烈振搖，將瓶壁上的細胞全部洗脫至培養(yǎng)液中，分裝至500ml的三角燒瓶中，進行下一步純化。參閱Synder[22]和Clark[23]的方法稍做改進如下將回收的細胞與培養(yǎng)液反復(fù)凍融3～4次，加熱56℃、45～50min；滅活攜帶反式作用元件的輔助病毒HSV-?。辉僭谝后w中加入DNaseI和RNase，使終濃度為1μg/ml，37℃、30分鐘；加入氯化鈉至終濃度為1mol/L，劇烈搖動30分鐘后，1,2000轉(zhuǎn)/分鐘、離心15分鐘，收集上清；加入PEEG6000至終濃度為13％(W/V)，溶解后，放置4℃1小時，1,2000轉(zhuǎn)/分鐘，離心15分鐘，棄去上清，用少量PBS溶解沉淀，加入DNaseI至終濃度1ug/ml，37℃、30分鐘；三氯甲烷抽提，1,2000轉(zhuǎn)/分鐘，離心3～5分鐘，收集水相，經(jīng)過柱子層吸，收集備用。待測的rAAV-GFP樣品用DNaseI和RNase(終濃度均為1μg/ml/ml)于37℃消化1小時，提取重組AAV的DNA(方法見SynderRO等1996CurrentProtocolsinHumanGenetics.JohnWileyNewYork，.12.1.1-12.1.20.)，沸水浴加熱5分鐘變性之后置于冰浴中。用試劑盒提供的稀釋緩沖液以1∶10做系列稀釋后點膜。預(yù)雜交、雜交、洗膜、顯色按BoehringerMannheim公司試劑盒說明書進行。通過計算pSVbiGDNFTH的分子數(shù)、再乘以與其雜交信號強度一致的病毒液樣品的稀釋倍數(shù)而得出rAAVGDNFTH的物理滴度，結(jié)果為1×1011～1012顆粒/ml。將純化的重組AAV-GDNFTH(1×1011病毒顆粒)感染六孔培養(yǎng)板中的50％鋪滿的人胚胎腎細胞293，待細胞長滿后，在倒置顯微鏡下觀察是否出現(xiàn)細胞病變效應(yīng)(cytopathiceffect，CPE)，以此判斷rAAV中是否含有HSV-1。將細胞連同上清一起凍融3次，離心去除細胞碎片后，上清液再感染六孔培養(yǎng)板中的50％鋪滿的293細胞，如此連續(xù)感染5代，實驗觀察表明輔助病毒去除徹底，無CPE出現(xiàn)。3.感染與檢測采用常規(guī)的方法用無血清培養(yǎng)液培養(yǎng)小鼠原代中腦神經(jīng)細胞，當(dāng)細胞長至1×105時，向培養(yǎng)液中加入重組AAV(1×109)，感染細胞4～6小時后，更換成無病毒的培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)2周，收集上清，用ELISA方法檢測GDNF的含量為8.90pg/ml，免疫組化檢測TH的表達，顯示強陽性。當(dāng)感染重組病毒后2天，在培養(yǎng)液中加入強力霉素1ng/ml，培養(yǎng)2周檢測，結(jié)果都為陰性。4.無菌條件下收集培養(yǎng)的中腦神經(jīng)細胞，儲備后用。實施例5重組AAV-GDNF-TH感染體外培養(yǎng)的SH-SY5Y細胞系SH-SY5Y細胞系是神經(jīng)母細胞瘤細胞系，采用常規(guī)方法，在玻璃細胞培養(yǎng)瓶中，用DMEM培養(yǎng)液(GIBCO公司產(chǎn)品)進行培養(yǎng)(FBS10～5％、5％CO2)，待細胞長至60～70％即可進行重組腺病毒伴隨病毒感染實驗。在培養(yǎng)液中加入重組AAV-GDNFTH(1×109)，感染細胞4～6小時后，更換成無病毒的培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)2周，收集細胞，用Bowtell法(1987年)提取細胞中的總DNA，分別用標(biāo)記上地高辛的寡核苷酸探針對GDNF和TH進行標(biāo)記，結(jié)果陽性。實施例6重組AAV-GDNF-TH感染神經(jīng)干細胞細胞培養(yǎng)方法同實施例1，無菌分離人胚胎(12周)中腦神經(jīng)干細胞，培養(yǎng)于無血清培養(yǎng)基DMEM/F12(GIBCO公司)中，用免疫熒光顯微鏡或共聚焦顯微鏡檢測神經(jīng)干細胞早期標(biāo)志抗原——巢蛋白(nestin)的表達，摻入BrdU以便進行細胞增殖特性的研究。培養(yǎng)2w后，培養(yǎng)的神經(jīng)干細胞開始形成球狀克隆，經(jīng)共聚焦顯微鏡檢測顯示大部分細胞表達nestin，并具有增殖能力。將神經(jīng)干細胞接種于24孔培養(yǎng)板中，用重組AAV-GDNFTH(約105病毒顆粒/ml)感染4～6小時，更換成含血清培養(yǎng)液進行培養(yǎng)，中腦神經(jīng)干細胞發(fā)生分化神經(jīng)突起細長，可見明顯神經(jīng)元胞體；收集細胞，用Bowtell法(1987年)提取細胞中的總DNA，分別用標(biāo)記上地高辛的寡核苷酸探針對GDNF和TH進行標(biāo)記，結(jié)果陽性。實施例7腦紋狀體定向注射重組AAV-GDNF-TH病毒對PD模型大鼠行為的影響制作PD大鼠模型[24]后，將大鼠隨機分成兩組，采用腦立體定向注射的方法，向?qū)嶒灲M大鼠紋狀體內(nèi)注射重組AAV-GDNFTH6μl(約1×109)和重組AAV-tTA4μl(約1×108)，對照組大鼠紋狀體內(nèi)注射相同量的重組AAV-GFP代替重組AAV-GDNFTH，15天后，各組大鼠每周腹腔注射Amphetamine，3mg/kg一次，測轉(zhuǎn)45分鐘，記錄PD模型大鼠的自轉(zhuǎn)圈數(shù)，實驗一直進行了4個月，數(shù)據(jù)表明實驗組大鼠的自轉(zhuǎn)圈數(shù)明顯減少，與對照組差別顯著(P＜0.05)，免疫組化染色TH、ELISA檢測GDNF和HPLC檢測多巴胺，結(jié)果均為陽性；而實驗組服用強力霉素后(水中加入強力霉素1mg/ml)，則與對照組差別不顯著，TH、GDNF和多巴胺檢測也與對照組無顯著差別(P＞0.05)。實施例8攜帶GDNF和TH基因的工程細胞移植到紋狀體治療PD模型大鼠將實施例4儲備的中腦神經(jīng)細胞定向移植到帕金森病模型大鼠的紋狀體中，飼養(yǎng)2周后，每周大鼠腹腔注射Amphetamine(3mg/kg)一次，測轉(zhuǎn)45分鐘，記錄PD模型大鼠的自轉(zhuǎn)圈數(shù)，觀測6個月，數(shù)據(jù)表明大鼠的自轉(zhuǎn)圈數(shù)明顯減少，與未進行細胞移植的帕金森病模型大鼠相比，有顯著差別(P＜0.05)。本發(fā)明相關(guān)的DNA序列序列1(a)序列特征長度558bp類型核酸鏈數(shù)雙鏈幾何結(jié)構(gòu)線性(b)分子類型DNA(基因組)(c)來源人胎腦ATGAAGTTATGGGATGTCGTGGCTGTCTGCCTGGTGCTGCTCCACACCGCGTCCGCCTTCCCGCTGCCCGCCGCAAATAGTCCAGAGGATTATCCTGATCAGTTCGATGATGTCATGGATTTTATTCAAGCCACCATTAAAAGACTGAAAAGGTCGCCAGATAAACAAATGGCAGTGCTTCCTACAAGAGAGCGGAATCGGCAGGCTGCAGCTGCCAACCCAGAGAATTCCAGAGGAAAAGGTCGGAGAGGCCAGAGGGGCAAAAACCGGGGTTGTGTCTTAACTGCAATACATTTAAATGTCACTGACTTGGGTCTGGGCTATGAAACCAAGGAGGAACTGATTTTTAGGTACTGCAGCGGCTCTTGCGATGCAGCTGAGACAACGTACGACAAAATATTGAAAAACTTATCCAGAAATAGAAGGCTGGTGAGTGACAAAGTAGGGCAGGCATGTTGCAGACCCATCGCCTTTGATGATGACCTGTGGTTTTTAGATGATAACCTGGTTTACCATATTCTAAGAAAGCATTCCGCTAAAAGGTGTGGATGTATCTGA(終止密碼子)序列2(a)序列特征長度1575bp類型核酸鏈數(shù)雙鏈幾何結(jié)構(gòu)線性(b)分子類型DNA(基因組)來源人類組織ATGCCCACCCCCGACGCCACCACGCCACAGGCCAAGGGCTTCCGCAGGGCCGTGTCTGAGCTGGACGCCAAGCAGGCAGAGGCCATCATGGGCGCCCCGGGGCCCAGCCTCACAGGCTCTCCGTGGCCTGGAACTGCAGCCCCAGCTGCATCCTACACCCCCACCCCAAGGTCCCCGCGGTTCATTGGGCGCAGGCAGAGCCTCATCGAGGACGCCCGCAAGGAGCGGGAGGCGGCGGTGGCAGCAGCGGCCGCTGCAGTCCCCTCGGAGCCCGGGGACCCCCTGGAGGCTGTGGCCTTTGAGGAGAAGGAGGGGAAGGCCGTGCTAAACCTGCTCTTCTCCCCGAGGGCCACCAAGCCCTCGGCGCTGTCCCGAGCTGTGAAGGTGTTTGAGACGTTTGAAGCCAAAATCCACCATCTAGAGACCCGGCCCGCCCAGAGGCCGCGAGCTGGGGGCCCCCACCTGGAGTACTTCGTGCGCCTCGAGGTGCGCCGAGGGGACCTGGCCGCCCTGCTCAGTGGTGTGCGCCAGGTGTCAGAGGACGTGCGCAGCCCCGCGGGGCCCAAGGTCCCCTGGTTCCCAAGAAAAGTGTCAGAGCTGGACAAGTGTCATCACCTGGTCACCAAGTTCGACCCTGACCTGGACTTGGACCACCCGGGCTTCTCGGACCAGGTGTACCGCCAGCGCAGGAAGCTGATTGCTGAGATCGCCTTCCAGTACAGGCACGGCGACCCGATTCCCCGTGTGGAGTACACCGCCGAGGAGATTGCCACCTGGAAGGAGGTCTACACCACGCTGAAGGGCCTCTACGCCACGCACGCCTGCGGGGAGCACCTGGAGGCCTTTGCTTTGCTGGAGCGCTTCAGCGGCTACCGGGAAGACAATATCCCCCAGCTGGAGGACGTCTCCCGCTTCCTGAAGGAGCGCACGGGCTTCCAGCTGCGGCCTGTGGCCGGCCTGCTGTCCGCCCGGGACTTCCTGGCCAGCCTGGCCTTCCGCGTGTTCCAGTGCACCCAGTATATCCGCCACGCGTCCTCGCCCATGCACTCCCCTGAGCCGGACTGCTGCCACGAGCTGCTGGGGCACGTGCCCATGCTGGCCGACCGCACCTTCGCGCAGTTCTCGCAGGACATTGGCCTGGCGTCCCTGGGGGCCTCGGATGAGGAAATTGAGAAGCTGTCCACGCTGTCATGGTTCACGGTGGAGTTCGGGCTGTGTAAGCAGAACGGGGAGGTGAAGGCCTATGGTGCCGGGCTGCTGTCCTCCTACGGGGAGCTCCTGCACTGCCTGTCTGAGGAGCCTGAGATTCGGGCCTTCGACCCTGAGGCTGCGGCCGTGCAGCCCTACCAAGACCAGACGTACCAGTCAGTCTACTTCGTGTCTGAGAGCTTCAGTGACGCCAAGGACAAGCTCAGGAGCTATGCCTCACGCATCCAGCGCCCCTTCTCCGTGAAGTTCGACCCGTACACGCTGGCCATCGACGTGCTGGACAGCCCCCAGGCCGTGCGGCGCTCCCTGGAGGGTGTCCAGGATGAGCTGGACACCCTTGCCCATGCGCTGAGTGCCATTGGCTAG(終止密碼子)序列3(a)序列特征長度145bp類型核酸鏈數(shù)單鏈幾何結(jié)構(gòu)線性帶發(fā)夾結(jié)構(gòu)(b)分子類型DNA來源Hela細胞中感染的腺病毒伴隨病毒2H型左側(cè)末端反向重復(fù)序列(ITR-L)TTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCGACCAAAGGTCGCCCGACGCCCGGGCTTTGCCCGGGCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTAGGGGTTCCT右側(cè)末端反向重復(fù)序列(ITR-R)AGGAACCCCTAGTGATGGAGTTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCGACCAAAGGTCGCCCGACGCCCGGGCTTTGCCCGGGCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAA序列4(a)序列特征長度557bp類型核酸鏈數(shù)雙鏈幾何結(jié)構(gòu)線性(b)分子類型DNA(基因組)來源人工構(gòu)建CGGGGCCGCGGAGGCTGGATCGGTCCCGGTGTCTTCTATGGAGGTCAAAACAGCGTGGATGGCGTCTCCAGGCGATCTGACGGTTCACTAAACGAGCTCTGCTTATATAGGTCGAGTTTACCACTCCCTATCAGTGATAGAGAAAAGTGAAAGTCGAGTTTACCACTCCCTATCAGTGATAGAGAAAAGTGAAAGTCGAGTTTACCACTCCCTATCAGTGATAGAGAAAAGTGAAAGTCGAGTTTACCACTCCCTATCAGTGATAGAGAAAAGTGAAAGTCGAGTTTACCACTCCCTATCAGTGATAGAGAAAAGTGAAAGTCGAGTTTACCACTCCCTATCAGTGATAGAGAAAAGTGAAAGTCGAGTTTACCACTCCCTATCAGTGATAGAGAAAAGTGAAAGTCGAGCTCGGTACCCGGGTCGAGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGCCTATATAAGCAGAGCTCGTTTAGTGAACCGTCAGATCGCCTGGAGACGCCATCCACGCTGTTTTGACCTCCATAGAAGACACCGGGACCGATCCAGCCTCCGCGGCCC序列5(a)序列特征長度222bp類型核酸鏈數(shù)雙鏈幾何結(jié)構(gòu)線性(b)分子類型DNA(基因組)來源SV40病毒CAGACATGATAAGATACATTGATGAGTTTGGACAAACCACAACTAGAATGCAGTGAAAAAAATGCTTTATTTGTGAAATTTGTGATGCTATTGCTTTATTTGTAACCATTATAAGCTGCAATAAACAAGTTAACAACAACAATTGCATTCATTTTATGTTTCAGGTTCAGGGGGAGATGTGGGAGGTTTTTTAAAGCAAGTAAAACCTCTACAAATGTGGTA序列6(a)序列特征長度452bp類型核酸鏈數(shù)雙鏈幾何結(jié)構(gòu)線性(b)分子類型DNA(基因組)來源SV40病毒AGACATGATAAGATACATTGATGAGTTTGGACAAACCACAACTAGAATGCAGTGAAAAAAATGCTTTATTTGTGAAATTTGTGATGCTATTGCTTTATTTGTAACCATTATAAGCTGCAATAAACAAGTTAACAACAACAATTGCATTCATTTTATGTTTCAGGTTCAGGGGGAGGTGTGGGAGGTTTTTTAAAGCAAGTAAAACCTCTACAAATGTGGTATGGCTGATTATGATCCTGCAAGCCTCGTCGTCTGGCCGGACCACGCTATCTGTGCAAGGTCCCCGGACGCGCGCTCCATGAGCAGAGCGCCCGCCGCCGAGGCAAGACTCGGGCGGCGCCCTGCCCGTCCCACCAGGTCAACAGGCGGTAACCGGCCTCTTCATCGGGAATGCGCGCGACCTTCAGCATCGCCGGCATGTCCCCTGGCGGACGGGAAGTATCAGCTCGACC專利參考文獻1.MandelRJ，SprattSK，SnyderRO.Midbraininjectionofrecombinantadeno-associatedneurotrophicvirusencodingratglialcellline-derivedneurotrophicfactorprotectsnigralneuronsinaprogressive6-hydroxydopamine-induceddegenerationandbehavioralimpairmentinaratm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