專利名稱：一種2-苯乙醇的制備方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種2-苯乙醇的生物制備方法。
背景技術：
2-苯乙醇(2-phenylethanol，2_PE)，又名β -苯乙醇、二苯基乙醇，是一種具有玫瑰花香的芳香醇，其味淡雅細膩，多存在于玫瑰、水仙、百合、茉莉等植物精油中，2-苯乙醇也是面包、奶酪、餅干、葡萄酒等食品中的風味物質，該物質在堿性環(huán)境以及對空氣的氧化作用穩(wěn)定，其衍生酯類物質，如乙酸苯乙酯等也是重要的芳香產(chǎn)品。由于2-苯乙醇香氣輕柔甜和，不僅是所有玫瑰香型香氣的基本組分，還具有協(xié)同增效作用，是多種香型配方所需成分。目前2-苯乙醇為第二大香料產(chǎn)品，其用量僅次于香蘭素，廣泛應用于食品、煙草、化妝品和洗滌日化用品中。目前生物轉化2-苯乙醇的前體為發(fā)酵法或酶法生產(chǎn)的L-苯丙氨酸，碳源一般采用常見的葡萄糖、蔗糖、糖蜜等糖類物質，由于葡萄糖、蔗糖等代謝產(chǎn)生大量乙醇，從而對 2-苯乙醇的生物轉化產(chǎn)生明顯的抑制和毒害，研究表明除了單獨存在的乙醇對2-苯乙醇生物合成產(chǎn)生抑制外，乙醇與2-苯乙醇同時存在于生物轉化體系中時，對產(chǎn)物2-苯乙醇的協(xié)同抑制更加顯著，最終導致2-苯乙醇的產(chǎn)率較低。發(fā)酵結束時包括乙醇在內的副產(chǎn)物含量達30%-70%，發(fā)酵液中殘留的乙醇副產(chǎn)物含量較高，一般達到10g/L以上，糖類物質為碳源對產(chǎn)物2-苯乙醇生成的利用效率(以下以t_PE/sug 表示)較低，如以葡萄糖作為碳源， 乙-PE/duc^ 一般低于 0. 1 (g/g)。

發(fā)明內容
本發(fā)明為解決上述的技術問題而提供了一種以乙醇替代葡萄糖等糖類物質發(fā)酵生產(chǎn)2-苯乙醇的方法。即通過選取可氧化降解乙醇的活性干酵母，以L-苯丙氨酸為底物， 以乙醇為唯一碳源發(fā)酵生產(chǎn)2-苯乙醇。發(fā)酵過程控制溫度為25 38°C，時間15 60h， 乙醇初始濃度2 30g/L，發(fā)酵結束后2-苯乙醇濃度可達到0. 68 3. 81g/L。同時發(fā)酵過程產(chǎn)生的副產(chǎn)物種類和濃度明顯降低，碳源的利用率明顯提高。本發(fā)明的技術方案
一種2-苯乙醇的制備方法，包括下列步驟
(1)、將活性干酵母接入到發(fā)酵培養(yǎng)基，控制發(fā)酵過程的溫度為25 38°C，發(fā)轉速為 100 800rpm/min,時間為15 60h,發(fā)酵結束； 當使用搖瓶發(fā)酵時，轉速100 300rpm/min ；
當使用發(fā)酵罐發(fā)酵時，轉速100 SOOrpm/min，且采用發(fā)酵罐進行生產(chǎn)時，發(fā)酵過程通入的空氣量按照通氣速率比發(fā)酵液體積為0. 3 1. 5V/Vmin ；
所述的高活性干酵母包括安琪耐高糖型高活性干酵母、丹寶利高活性干酵母或番禺梅山-馬利高活性干酵母等具備氧化降解乙醇能力的酵母。
所述活性干酵母接入發(fā)酵培養(yǎng)基的量按其與發(fā)酵培養(yǎng)基的重量體積比計算，即活性干酵母發(fā)酵培養(yǎng)基為0. 5 3. 0% (W/V)；
所述的發(fā)酵培養(yǎng)基按每升計算，其組成為L-苯丙氨酸5 30g，乙醇2 30g， K2HPO4. 3H20 0.3 1. 5g, MgSO4. 7H20 0. 1 1. 5g, NaCl 0· 5 lg，余量為水，pH 自然； (2)、分離純化
步驟(1)發(fā)酵結束后所得的發(fā)酵液先以4000 5000r/min離心，去除菌體后的上清液中加入活性碳進行吸附，吸附0. 5 1. 5h達到平衡，然后用洗脫劑對活性碳進行洗脫或解吸，采用IMNaOH或HCl將洗脫液或解吸液的pH控制在3. 5 10. 0 ；對洗脫液進行檢測， 直到2-苯乙醇的含量低于0. lg/L，洗脫后的洗脫液或解吸液再依次經(jīng)常壓、減壓蒸餾和精餾，收集115°C餾分，最終得到2-苯乙醇；
所用的活性炭為顆?；钚蕴浚６?. 5-4mm，加入的活性炭的量按每升發(fā)酵液16飛Og 計算；
所述的洗脫劑為無水乙醇或95% (V/V)的乙醇； 所述的常壓蒸餾溫度控制在80°C ；
所述的減壓蒸餾過程控制壓力為-O. 0Γ-0. 05MPa，溫度為78 160°C ； 所述的精餾過程控制壓力-O. 05一-0. 09MPa。本發(fā)明的有益效果
本發(fā)明的一種2-苯乙醇的制備方法，采用乙醇作為葡萄糖、蔗糖等碳源的替代物，通過乙醇的氧化降解，提供艾氏途徑所需的還原力NADH，從而推動2-苯乙醇的順利合成。由此，可從源頭解除由葡萄糖、蔗糖等糖類物質代謝蓄積的乙醇對2-苯乙醇轉化產(chǎn)生的抑制，最終發(fā)酵液中2-苯乙醇的產(chǎn)率達0. 68 3. 81g/L。此外，本發(fā)明采用乙醇為碳源時，發(fā)酵結束后發(fā)酵液中副產(chǎn)物的含量為7. 8% 15. 2%，殘留的乙醇濃度為(Γ2. 58g/L，相較以蔗糖、葡萄糖等為碳源時，發(fā)酵結束后，顯著降低了發(fā)酵液中副產(chǎn)物的含量，使得碳源的利用率得到了提高，72-PE/Ethanol介于0. 11 0. 34 (g/g)之間。同時，本發(fā)明的一種2-苯乙醇的制備方法，采用活性干酵母進行生物轉化生產(chǎn) 2-苯乙醇，代替了傳統(tǒng)的菌種培養(yǎng)發(fā)酵方式，減少了酵母菌生長繁殖的過程，使得發(fā)酵過程更易于控制又降低了發(fā)酵過程染菌的可能性，操作方便，生產(chǎn)成本低，工業(yè)化應用前景廣闊。
具體實施例方式下面通過實施例對本發(fā)明進一步詳細描述，但本發(fā)明的保護范圍不局限于此。發(fā)酵液中2-苯乙醇的測定方法，采用高效液相色譜法(HPLC)分析(Shaofeng Rong, Baomei Ding, Xiaoli Zhang, Xuesong Zheng, Yifei Wang. Enhanced Biotransformation of 2-Phenylethanol with Ethanol Oxidation in a Solid_ Liquid Two-Phase System by Active Dry Yeast [J]· Curr Microbiol, 2011, 63: 503-509),具體如下將發(fā)酵液樣品進行離心，4000rpm/min，離心后的上清液再用0. 45 μ m微孔濾膜過濾處理，濾液立即上Agilent 1100型高效液相色譜儀(Agilent Technologies, Ltd, USA) 分析，色譜柱為 C18 柱(Dikma DiamonsilC18, 250mmX4. 6mm, 5 μ m), DAD 檢測器，檢測波長 260nm，柱溫30°C，流動相為甲醇水=60 40 (v/v)，流動相流速lmL/min，進樣10 μ Lj
5標法定量。發(fā)酵液中乙醇的測定方法，采用5890A氣相色譜儀(Agilent Technologies, Ltd, USA)分析(參考文獻同上)，GC條件為色譜柱19091J-413 HP-5 30mX0. 32mmX0. 25 μ m ； 進樣量1 μ L ；進樣口溫度250°C ；檢測器溫度250°C ；程序升溫過程柱溫30°C保持3min， 再以20°C /min升至280°C保持5min。實施例1
本實施例所用的高活性干酵母為市售安琪耐高糖型高活性干酵母，安琪酵母股份有限公司，商品名“安琪高活性干酵母”。一種2-苯乙醇的制備方法，包括下列步驟
(1 )、將0. 25g的高活性干酵母接入到含有50mL發(fā)酵培養(yǎng)基的250mL搖瓶中，控制發(fā)酵過程的溫度為25°C，轉速為lOOrpm/min，時間為15h，發(fā)酵結束；
所述活性干酵母粉接入發(fā)酵培養(yǎng)基的量按其與發(fā)酵培養(yǎng)基的重量體積比計算，即活性干酵母發(fā)酵培養(yǎng)基為0. 5% (W/V)；
所述的發(fā)酵培養(yǎng)基按每升計算，其組成為，L-苯丙氨酸5g，乙醇2g，K2HPO4.3H20 0. 3g， MgSO4. 7H20 0. lg, NaCl 0. 5g，余量為水，pH 自然，121°C高壓蒸汽滅菌 20min ；
取步驟(1)發(fā)酵結束后所得的發(fā)酵液進行2-苯乙醇含量的檢測，經(jīng)過HPLC分析，發(fā)酵液中的2-苯乙醇的濃度為0. 68g/L ；
取步驟(1)發(fā)酵結束后發(fā)酵結束后所得的發(fā)酵液進行乙醇含量的檢測，經(jīng)過GC分析， 消耗的乙醇濃度為2g/L，發(fā)酵液中幾乎沒有乙醇剩余，72_PE/Ethanol為0. 34 (g/g)；雜質含量為 7. 79%ο(2)、分離純化
將步驟(1)發(fā)酵結束后所得到的發(fā)酵液以4000rpm/min離心，去除菌體后加入0. 82g 活性碳(粒度0. 5mm)進行震搖吸附0. 5h后將活性碳濾出，用去離子水洗滌2次，然后將獲得的活性碳抽濾，抽濾后的活性碳加入到裝有50mL無水乙醇的搖瓶中振搖解吸，搖瓶速度 50rpm/min,時間池，振搖結束后采用HPLC分析，解吸液中2-苯乙醇的濃度為0. 65g/L。實施例2
本實施例所用的高活性干酵母為丹寶利高活性干酵母，廣州丹寶利酵母有限公司，商品名“丹寶利高活性干酵母”。一種2-苯乙醇的制備方法，包括下列步驟
(1)、將1. 5g的高活性干酵母接入到50mL發(fā)酵培養(yǎng)基的250mL搖瓶中，控制發(fā)酵過程的溫度為38°C，轉速為300rpm/min，時間為60h，發(fā)酵結束；
所述活性干酵母粉接入發(fā)酵培養(yǎng)基的量按其與發(fā)酵培養(yǎng)基的重量體積比計算，即活性干酵母發(fā)酵培養(yǎng)基為3% (W/V)；
所述的發(fā)酵培養(yǎng)基按每升計算，其組成為，L-苯丙氨酸30g，乙醇30g，K2HPO4. 3H20 1. 5g，MgSO4. 7H20 1. 5g, NaCl lg，余量為水，pH 自然，121°C高壓蒸汽滅菌 20min ;
取步驟(1)發(fā)酵結束后所得的發(fā)酵液進行2-苯乙醇含量的檢測，經(jīng)過HPLC分析，發(fā)酵液中的2-苯乙醇的濃度為3. 21g/L ；
取步驟(1)發(fā)酵結束后所得的發(fā)酵液進行乙醇含量的檢測，經(jīng)過GC分析，消耗的乙醇濃度為28. 52g/L，發(fā)酵液中剩余的乙醇濃度為1. 48g/L,72_PE/Ethanol為0. 11 (g/g);雜質含量為 15. 21%。(2)、分離純化
將步驟(1)發(fā)酵結束后所得到的發(fā)酵液以5000rpm/min離心，去除菌體后加入2. 53g 活性碳(粒度0. 5mm)進行振搖吸附Ih后將活性碳濾出，用去離子水洗滌2次，然后將獲得的活性碳抽濾，抽濾后的活性碳加入到裝有50mL無水乙醇的搖瓶中振搖解吸，搖瓶速度 100rpm/min,時間4h，振搖結束后采用HPLC分析，解吸液中2-苯乙醇的濃度為3. 15g/L。實施例3
本實施例所用的高活性干酵母為番禺梅山-馬利即發(fā)高活性干酵母，番禺梅山-馬利酵母有限公司，商品名“梅山即發(fā)干酵母”。一種2-苯乙醇的制備方法，包括下列步驟
(1)、將0. 6g的高活性干酵母接入到50mL發(fā)酵培養(yǎng)基的250mL搖瓶中，控制發(fā)酵過程的溫度為36°C，轉速為200rpm/min，時間為48h，發(fā)酵結束；
所述活性干酵母粉接入發(fā)酵培養(yǎng)基的量按其與發(fā)酵培養(yǎng)基的重量體積比計算，即活性干酵母發(fā)酵培養(yǎng)基為1. 2% (W/V)；
所述的發(fā)酵培養(yǎng)基按每升計算，其組成為，L-苯丙氨酸10g，乙醇20g，K2HPO4.3H20 lg， MgSO4. 7H20 1. 5g, NaCl 0. 75g，余量為水，pH 自然，121°C高壓蒸汽滅菌 20min ;
取步驟(1)發(fā)酵結束后所得的發(fā)酵液進行2-苯乙醇含量的檢測，經(jīng)過HPLC分析，發(fā)酵液中的2-苯乙醇的濃度為3. 52g/L ；
取步驟(1)發(fā)酵結束后所得的發(fā)酵液進行乙醇含量的檢測，經(jīng)過GC分析，消耗的乙醇濃度為18. 02g/L，發(fā)酵液中剩余的乙醇濃度為1. 98g/L，72_PE/Ethanol為0. 2 (g/g)；雜質含量為 10. 31%。(2)、分離純化
將步驟(1)發(fā)酵結束后所得到的發(fā)酵液以4000rpm/min離心，去除菌體后加入2. 42g活性碳(粒度2mm)進行振搖吸附Ih后將活性碳濾出，用去離子水洗滌2次，然后將獲得的活性碳抽濾，抽濾后的活性碳加入到裝有50mL無水乙醇的搖瓶中振搖解吸，搖瓶速度IOOrpm/ min,時間池，振搖結束后采用HPLC分析，解吸液中2-苯乙醇的濃度為3. 35g/L。實施例4
本實施例所用的高活性干酵母為番禺梅山-馬利即發(fā)高活性干酵母，番禺梅山-馬利酵母有限公司，商品名“梅山即發(fā)干酵母”。一種2-苯乙醇的制備方法，包括下列步驟
(1)、將52. 5g的活性干酵母接入到裝有3. 5L發(fā)酵培養(yǎng)基的5L機械攪拌發(fā)酵罐(NBS BIOFLO 3000)中，控制發(fā)酵過程的溫度為36°C，轉速為300rpm/min，通入空氣量按照通氣速率比發(fā)酵液體積為1 V/V · min，時間為48h，發(fā)酵結束；
所述活性干酵母粉接入發(fā)酵培養(yǎng)基的量按其與發(fā)酵培養(yǎng)基的重量體積比計算，即活性干酵母發(fā)酵培養(yǎng)基為1. 5% (W/V)；
所述的發(fā)酵培養(yǎng)基按每升計算，其組成為，L-苯丙氨酸8g，乙醇20g，K2HPO4. 3H20 0. 75g, MgSO4. 7H20 0. 5g, NaCl lg，余量為水，pH 自然，121°C高壓蒸汽滅菌 20min ;
取步驟(1)發(fā)酵結束后所得的發(fā)酵液進行2-苯乙醇含量的檢測，經(jīng)過HPLC分析，發(fā)酵液中的2-苯乙醇的濃度為3. 81g/L ；取步驟(1)發(fā)酵結束后所得的發(fā)酵液進行乙醇含量的檢測，經(jīng)過GC分析，消耗的乙醇濃度為17. 42g/L，發(fā)酵液中剩余的乙醇濃度為2. 58g/L，72_PE/Ethanol為0. 22 (g/g)；雜質含量為8. 31%。(2)、分離純化
將步驟(1)發(fā)酵結束后所得到的3. 5L發(fā)酵液以4000rpm/min離心，去除菌體后加入 150g活性碳(粒度4mm)進行攪拌吸附1.證，溫度25°C，再用0. 3mm的篩網(wǎng)過濾出活性碳，用去離子水洗滌3次，將活性碳抽濾；
將所述抽濾后的活性碳裝柱，柱內徑3. 5cm,柱高65cm，柱體積580ml，采用95%乙醇洗脫，流速2. Oml/min，當乙醇洗脫收集液為1. 8L時，取柱下端流出液樣進行HPLC分析，至柱下端流出液中2-苯乙醇的濃度為0. 08 g/L，結束洗脫；
將所述收集的1. 8L洗脫液搖勻，取樣進行HPLC分析，洗脫液中2-苯乙醇的濃度為 6. 91 g/L，換算為發(fā)酵液2-苯乙醇的終濃度為3. 55g/L。將收集到的1. 8L洗脫液進行常壓蒸餾，蒸餾溫度80°C，蒸餾濃縮到約400ml時，蒸餾瓶內壁可見少量粘稠物附著，將濃縮液轉入另外一個2L燒瓶中，取樣按本發(fā)明實施例1 的方法進行HPLC分析，2-苯乙醇濃度為31. ^g/L，繼續(xù)常壓蒸餾，直到蒸餾塔頂溫度達到 95 °C，停止常壓蒸餾；
將所述常壓蒸餾所得的濃縮液56ml進行下一步的減壓蒸餾，采用油泵對蒸餾釜內抽真空，控制真空度-0. OlMPa以下，蒸餾溫度從80°C緩慢升溫，到130°C基本粗蒸完畢，獲得蒸餾粗品液為21ml，采用HPLC分析蒸餾粗品中2-苯乙醇濃度為590. ^g/L，所述蒸餾粗品液準備進行精餾操作；
將待精餾粗品進料后，油泵預真空，先將表壓力降至-0. 05MPa以下，緩慢升高蒸餾釜溫度，先將粗品中少量水蒸出，連續(xù)抽真空，壓力可至-0. 09MPa，收集115°C餾分。按所述氣相分析方法，產(chǎn)品純度99. 5%。以上所述內容僅為本發(fā)明構思下的基本說明，而依據(jù)本發(fā)明的技術方案所作的任何等效變換均應屬于本發(fā)明的保護范圍。
權利要求
1.一種2-苯乙醇的制備方法，其特征在于通過選取可氧化降解乙醇的活性干酵母，以 L-苯丙氨酸為底物，以乙醇為唯一碳源進行發(fā)酵生產(chǎn)2-苯乙醇。
2.如權利要求1所述2-苯乙醇的制備方法，其特征在于所述的可氧化降解乙醇的活性干酵母為安琪耐高糖型高活性干酵母、丹寶利高活性干酵母或番禹梅山-馬利高活性干酵母。
3.如權利要求1或2所述的一種2-苯乙醇的制備方法，其特征在于具體包括下列步驟(1)、將高活性干酵母接入到發(fā)酵培養(yǎng)基中，控制發(fā)酵過程的溫度為25 38°C，轉速 100 800rpm/min，時間為15 60h，發(fā)酵結束；所述活性干酵母接入發(fā)酵培養(yǎng)基的量按其與發(fā)酵培養(yǎng)基的重量體積比計算，即活性干酵母發(fā)酵培養(yǎng)基為0. 5 3. 0% (W/V)；所述的發(fā)酵培養(yǎng)基按每升計算，其組成為，L-苯丙氨酸5 30g，乙醇2 30g， K2HPO4. 3Η20 0· 3 1. 5g, MgSO4. 7H20 0· 1 1. 5g, NaCl 0· 5 lg,余量為水；(2)、分離純化步驟(1)發(fā)酵結束后所得的發(fā)酵液先以4000 5000r/min離心，去除菌體后的上清液中加入活性碳進行吸附；然后用洗脫劑對活性碳進行洗脫或解吸，采用IMNaOH或HCl將洗脫液或解吸液的pH 控制在3. 5 10. 0 ；所得洗脫液或解吸液再依次經(jīng)常壓、減壓蒸餾和精餾，收集115°C餾分，最終得到2-苯乙醇；所用的活性炭為顆?；钚蕴浚６?. 5-4mm，加入的活性炭的量按每升發(fā)酵液16飛Og 計算；所述的洗脫劑為無水乙醇或95% (V/V)的乙醇。
4.如權利要求3所述的一種2-苯乙醇的制備方法，其特征在于步驟(2)中 所述的常壓蒸餾溫度控制在80°C ；所述的減壓蒸餾過程控制壓力為-O. 0Γ-0. 05MPa，溫度為78 160°C ； 所述的精餾過程控制壓力-O. 05一-0. 09MPa。
5.如權利要求4所述的一種2-苯乙醇的制備方法，其特征在于步驟(1)中使用搖瓶發(fā)酵時，轉速100 300rpm/min。
6.如權利要求4所述的一種2-苯乙醇的制備方法，其特征在于步驟(1)中使用發(fā)酵罐發(fā)酵時，轉速100 800rpm/min。
7.如權利要求6所述的一種2-苯乙醇的制備方法，其特征在于步驟(1)中使用發(fā)酵罐進行生產(chǎn)時，發(fā)酵過程通入空氣，其中通氣量按照通氣速率比發(fā)酵液體積為0. 3 1. 5V/ Vmin0
8.如權利要求7所述的一種2-苯乙醇的制備方法，其特征在于步驟(1)中發(fā)酵過程中控制溫度為36°C，轉速為300rpm/min，通入空氣量按照通氣速率比發(fā)酵液體積為1 V/V · min,時間為48h ；所述活性干酵母粉接入發(fā)酵培養(yǎng)基的量按其與發(fā)酵培養(yǎng)基的重量體積比計算，即活性干酵母發(fā)酵培養(yǎng)基為1. 5% (W/V)；所述的發(fā)酵培養(yǎng)基按每升計算，其組成為，L-苯丙氨酸8g，乙醇20g，K2HPO4. 3H20 0. 75g，MgSO4. 7H20 0. 5g, NaCl lg，余量為水，pH 自然，121°C高壓蒸汽滅菌 20min。
9.如權利要求3所述的一種2-苯乙醇的制備方法所用的發(fā)酵培養(yǎng)基，其特征在于所述的發(fā)酵培養(yǎng)基按每升計算，其組成為，L-苯丙氨酸5 30g，乙醇2 30g，K2HPO4. 3H20 0· 3 1. 5g, MgSO4. 7Η20 0· 1 1. 5g, NaCl 0· 5 lg，余量為水。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種2-苯乙醇的制備方法。即通過選取可氧化降解乙醇的活性干酵母，以L-苯丙氨酸為底物，以乙醇為唯一碳源進行發(fā)酵生產(chǎn)2-苯乙醇。發(fā)酵過程控制溫度為25～38℃，轉速為100～800rpm/min，時間15～60h，乙醇初始濃度2～30g/L，發(fā)酵結束后產(chǎn)物2-苯乙醇濃度可達到0.68～3.81g/L。本發(fā)明通過活性干酵母氧化降解乙醇并進一步轉化為2-苯乙醇，克服了發(fā)酵液中高濃度乙醇對產(chǎn)物2-苯乙醇合成的抑制，又降低了生物轉化過程染菌的可能性，也降低了2-苯乙醇發(fā)酵液中有機雜質的含量，顯著提高了碳源的利用率，同時本發(fā)明的制備方法具有操作方便，生產(chǎn)成本低，工業(yè)化應用前景廣等特點。
文檔編號C12P7/22GK102392055SQ201110324669
公開日2012年3月28日 申請日期2011年10月24日 優(yōu)先權日2011年10月24日
發(fā)明者丁保妹, 張曉麗, 管世敏, 榮紹豐, 陳奕涵 申請人:上海應用技術學院