專利名稱：一種檢測(cè)埃博拉病毒的熒光定量pcr檢測(cè)方法及其引物和試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物檢測(cè)領(lǐng)域，特別涉及一種埃博拉病毒SYBR Green I熒光定量PCR檢測(cè)方法。
背景技術(shù)：
埃博拉出血熱(Ebolahemorrhagic fever,EHF)是由埃博拉病毒(Ebola virus,EB0V)引起的，主要以人和非人類靈長(zhǎng)類動(dòng)物為易感動(dòng)物的急性出血性傳染病。該病1976年首次發(fā)生于埃博拉河流域的剛果民主共和國(guó)(前扎伊爾)，因感染者全身呈出血癥狀，故命名為埃博拉出血熱。據(jù)推測(cè)最初人類感染EBOV主要是因?yàn)槿祟惤佑|感染了病毒的動(dòng)物宿主或者間接宿主的身體。在這之后人與人之間通過直接接觸已經(jīng)感染了病毒的人的身體進(jìn)行傳播。在經(jīng)歷一段2-21天的潛伏期之后，感染病毒的病人就會(huì)出現(xiàn)一些發(fā)熱的癥狀。EHF的主要特征是迅速發(fā)熱，寒冷，頭痛和肌肉疼痛，之后會(huì)產(chǎn)生咽喉腫痛，惡心，嘔吐，腹瀉以及腹痛。大約一半的病人會(huì)出現(xiàn)出血癥狀，例如從鼻孔出血，出現(xiàn)血尿或者是胃腸出血和陰道出血。EHF目前為止主要呈現(xiàn)地方性流行，絕大部分集中于非洲。非洲以外地區(qū)偶有病例報(bào)道，均屬于輸入性或?qū)嶒?yàn)室意外感染，未發(fā)現(xiàn)有EHF流行。EBOV已經(jīng)被證實(shí)是通過體液傳播的，如口腔和結(jié)膜接觸傳播，這在非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物試驗(yàn)已確證。自然界的動(dòng)物各種行為和其它因素都有可能造成EBOV的爆發(fā)。為了防止EBOV進(jìn)入我國(guó)，對(duì)我國(guó)的經(jīng)濟(jì)以及人身安全造成嚴(yán)重的損失，目前我國(guó)急需建立一種快速、準(zhǔn)確、敏感的檢測(cè)方法。EHF的病原是EB0V，屬于絲狀病毒科(Filoviridae)絲狀病毒屬(Filovirus)成員，是非分節(jié)段的單股負(fù)鏈RNA病毒。目前已鑒定的埃博拉病毒有5種亞型，分別是:EBOV-扎伊爾型(Ebola-Zaire，簡(jiǎn)稱 EB0V-Z)，EBOV-蘇丹型(Ebola-Sudan 簡(jiǎn)稱 EB0V-S)，EBOV-本迪布焦型(Ebola-Bundibugyo,簡(jiǎn)稱 EB0V-B), EBOV-科特迪瓦型(Ebola-1voryCoast,簡(jiǎn)稱 EB0V-C)，EBOV-萊斯頓型(Ebola-Reston，簡(jiǎn)稱 EB0V-R)。感染 EB0V-Z，EB0V-S和EBOV-B的致死率大約在2 5% -90%。EBOV屬于我國(guó)必須嚴(yán)密監(jiān)控其傳播入我國(guó)的急性烈性外來人獸共患傳染病，建立一種敏感、特異的，能夠同時(shí)檢測(cè)EB0V5種亞型病毒的檢測(cè)方法對(duì)我國(guó)EBOV的防控工作具有重要意義。熒光定量PCR具有快速、敏感和高通量的特點(diǎn)，SYBR Green I熒光定量PCR利用SYBR Green I能結(jié)合到雙鏈DNA的小溝部位放出熒光的方法廣泛應(yīng)用于核酸的特異性檢測(cè)。在EBOV的檢測(cè)方法研究領(lǐng)域，IgG-捕獲ELISA和IgM-捕獲ELISA是僅有的兩類常用檢測(cè)方法，建立一種敏感、特異的，同時(shí)針對(duì)5種亞型EBOV的熒光定量PCR方法更具有重要的實(shí)踐意義。經(jīng)對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的文獻(xiàn)檢索發(fā)現(xiàn)，國(guó)內(nèi)沒有EBOV檢測(cè)技術(shù)的專利公布。

發(fā)明內(nèi)容
因此，本發(fā)明要解決的技術(shù)問題就是針對(duì)沒有EBOV熒光定量PCR檢測(cè)技術(shù)的問題，提供一種EBOV 5種亞型的熒光定量PCR檢測(cè)方法及其試劑盒。該方法檢測(cè)的敏感性可達(dá)到100個(gè)拷貝的病毒RNA分子，對(duì)于單個(gè)樣本檢測(cè)小于2個(gè)小時(shí)，操作簡(jiǎn)易，可以進(jìn)行高通量的樣品檢測(cè)。本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的。本發(fā)明的技術(shù)方案一為，一種檢測(cè)埃博拉病毒的遺傳標(biāo)記分子，所述的遺傳標(biāo)記分子是埃博拉病毒NP基因的第857位至第1130位所示序列的核苷酸中連續(xù)的50-273個(gè)核苷酸，或者是埃博拉病毒NP基因的第878位至第1074位所示序列的核苷酸中連續(xù)的50-196個(gè),優(yōu)選196bp個(gè)核苷酸,所述的位置是指在埃博拉病毒株Zaire Ebola virusstrain Mayinga的NCBI登錄號(hào)AF499101.1所示NP基因上位置。所有的埃博拉病毒NP基因等位基因在上述位置范圍內(nèi)的核苷酸片段都是本發(fā)明保護(hù)的檢測(cè)埃博拉病毒的遺傳標(biāo)記。優(yōu)選的，所述的遺傳標(biāo)記分子是博拉病毒NP基因的第857位至第1130位所示序列的核苷酸，或者是埃博拉病毒NP基因的第878位至第1074位所示序列的核苷酸，所述的位置是指在埃博拉病毒株Zaire Ebola virus strain Mayinga的NCBI登錄號(hào)AF499101.1所示NP基因上位置。更優(yōu)選的，所述的遺傳標(biāo)記分子是SEQ ID NO :1、SEQ ID NO :2、SEQ IDNO :3、SEQID NO :4、或SEQ ID NO :5所示序列的核苷酸。 本發(fā)明的技術(shù)方案二為，一種檢測(cè)埃博拉病毒的遺傳標(biāo)記分子的弓I物對(duì)，所述的引物長(zhǎng)度 25-38 個(gè)核苷酸，且一個(gè)與 SEQ ID NO U SEQ ID NO :2、SEQ ID NO :3、SEQ IDNO :4、或 SEQ ID NO :5 所示序列相同，另一個(gè)相應(yīng)的與 SEQ ID NO USEQ ID NO :2、SEQ IDNO 3, SEQ ID NO :4、或SEQ IDNO :5所示序列互補(bǔ)，并且擴(kuò)增產(chǎn)物的長(zhǎng)度為50_300bp，優(yōu)選297bp。優(yōu)選的，所述的 引物對(duì)中，一條引物的序列是SEQ ID NO :6、另一條是SEQ ID NO:7;或者一條是SEQ ID NO :8、另一條是SEQ ID NO :9 ;或者一條是SEQ ID N0:10、另一條是SEQ ID NO : 11 ;或者一條是 SEQ ID NO :12、另一條是 SEQ ID NO : 13 ;或者一條是 SEQ IDNO :14、另一條是 SEQ IDNO :15。本發(fā)明的技術(shù)方案三為，一種檢測(cè)埃博拉病毒的弓I物對(duì)，該弓I物對(duì)中，引物長(zhǎng)度15-30bp，更佳的是20-22，其中一個(gè)引物含有一到兩個(gè)簡(jiǎn)并堿基，該簡(jiǎn)并堿基分別和Z、S、B、C、R五種亞型EBOV的特異性遺傳標(biāo)志序列的差異位點(diǎn)相同，該引物中該簡(jiǎn)并堿基以外的序列與Z、S、B、C、R五種亞型EBOV的特異性遺傳標(biāo)志序列相同或有個(gè)別不同，但是不影響PCR擴(kuò)增反應(yīng)；另一個(gè)引物也含有一到兩個(gè)簡(jiǎn)并堿基，該簡(jiǎn)并堿基分別和Z、S、B、C、R五種亞型EBOV的特異性遺傳標(biāo)志序列的差異位點(diǎn)互補(bǔ)，該引物中該簡(jiǎn)并堿基以外的序列與Z、S、
B、C、R五種亞型EBOV的特異性遺傳標(biāo)志序列互補(bǔ)或有個(gè)別不互補(bǔ)，但是不影響PCR擴(kuò)增反應(yīng)，該引物對(duì)的擴(kuò)增片段為70-300bp。優(yōu)選的，所述的引物對(duì)中，一條是SEQ ID NO :16所示序列的核苷酸，另一條是SEQID NO :17所示序列的核苷酸。該引物對(duì)的擴(kuò)增片段為196bp。本發(fā)明的技術(shù)方案四為，一種檢測(cè)埃博拉病毒的PCR試劑盒，該試劑盒包括如上所述的本發(fā)明的引物。優(yōu)選的，所述的試劑盒還包括陽性對(duì)照品、陰性對(duì)照品、RNA提取試劑、反轉(zhuǎn)錄試劑、和SYBR Green I熒光定量反應(yīng)液。本發(fā)明的技術(shù)方案五為，一種檢測(cè)埃博拉病毒的熒光定量PCR方法，包括以下步驟I)提取待檢樣品的RNA ；2)將上述提取的RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA ；3)將上述cDNA加入熒光定量反應(yīng)液中用實(shí)時(shí)熒光PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增檢測(cè)；4)通過比較待檢樣品和標(biāo)準(zhǔn)品的循環(huán)閾值而對(duì)待檢樣品的其實(shí)拷貝數(shù)進(jìn)行定量。本發(fā)明的技術(shù)方案六為，一種埃博拉病毒NP基因的用途，其用于制備埃博拉病毒的遺傳標(biāo)記分子。本發(fā)明的技術(shù)方案七為，本發(fā)明所述的檢測(cè)埃博拉病毒的遺傳標(biāo)記分子作為埃博拉病毒的特征序列在常規(guī)非生物安全P4級(jí)實(shí)驗(yàn)室中檢測(cè)埃博拉病毒的應(yīng)用。本發(fā)明所用的原料或試劑除特別說明之外，均市售可得。相比于現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明的有益效果如下本發(fā)明采用的EBOV SYBR Green I熒光定量PCR檢測(cè)方法利用了 PCR技術(shù)的核酸高效擴(kuò)增、SYBR Green I熒光染料和計(jì)算機(jī)輔助熒光檢測(cè)技術(shù)敏感性的優(yōu)點(diǎn)，克服了常規(guī)PCR檢測(cè)的不足，具有極大的優(yōu)點(diǎn)。(I)通用性好。本發(fā)明可以同時(shí)檢測(cè)5種亞型的EB0V，只需要一次反應(yīng)就可以特異性的檢測(cè)EB0V。只要待檢樣品中有Z、S、B、C、R五種亞型EBOV中的任何一種存在或者多種同時(shí)存在，就能檢測(cè)出來陽性。(2)敏感性高。由于熒光定量PCR利用擴(kuò)增產(chǎn)物的積累和熒光信號(hào)建立對(duì)應(yīng)關(guān)系，計(jì)算機(jī)輔助設(shè)備接受熒光信號(hào)并判定結(jié)果。檢測(cè)敏感性比常規(guī)PCR更高。`(3)操作簡(jiǎn)單、高通量、防污染。使用熒光定量PCR檢測(cè)，不需要打開反應(yīng)管蓋進(jìn)行瓊脂糖電泳，不易污染后續(xù)待檢測(cè)樣品。操作簡(jiǎn)單，適合高通量大規(guī)模樣品檢測(cè)。(4)節(jié)約時(shí)間。熒光定量PCR擴(kuò)增產(chǎn)物較短，不需要PCR產(chǎn)物的延伸時(shí)間，整個(gè)實(shí)驗(yàn)可以更快速完成。(5)安全性高。本發(fā)明中采用的陽性對(duì)照是根據(jù)EBOV五種亞型病毒NP基因序列體外轉(zhuǎn)錄的一段273nt的RNA分子，相對(duì)于以滅活病毒液作為陽性對(duì)照的檢測(cè)，增加了安全性，體外轉(zhuǎn)錄的RNA分子還可以大量制備，陽性對(duì)照來源穩(wěn)定、可靠，避免了滅活病毒株在每次實(shí)驗(yàn)中帶來的可能生物安全風(fēng)險(xiǎn)。(6)EBOV屬于我國(guó)必須嚴(yán)密監(jiān)控其傳播入我國(guó)的急性烈性外來人獸共患傳染病，本發(fā)明建立的敏感性高、特異性強(qiáng)、安全性好，能夠同時(shí)檢測(cè)EBOV 5種亞型病毒的檢測(cè)方法對(duì)我國(guó)EBOV的防控工作具有重要意義。
(7)本發(fā)明是一種通用檢測(cè)方法，在一次PCR檢測(cè)中就可以檢測(cè)五種亞型EB0V。只要待檢樣品中有五種亞型EBOV中的任何一種存在或者多種同時(shí)都存在，就能檢測(cè)出來陽性。


以下結(jié)合

本發(fā)明的特征和有益效果。圖1是引物序列與EBOV、MARV, XFHV, DHFV相應(yīng)基因比對(duì)結(jié)果。圖2是EBOV SYBR Green I熒光定量PCR檢測(cè)方法特異性擴(kuò)增曲線。圖3是EBOV SYBR Green I熒光定量PCR檢測(cè)方法敏感性擴(kuò)增曲線。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明人經(jīng)過深入而廣泛的研究，從埃博拉病毒的NP基因中發(fā)現(xiàn)較合適的擴(kuò)增序列。其中，NP為主要的核衣殼蛋白。NP蛋白對(duì)于核衣殼組成至關(guān)重要。核衣殼是病毒吸附、侵入宿主細(xì)胞的主要功能者，與致病性關(guān)系重大，也是引起宿主細(xì)胞抗體反應(yīng)的關(guān)鍵。因此，選擇這一 NP基因序列作為引物，具有很好的特征性。由于埃博拉病毒的傳染性和致病性極強(qiáng)，埃博拉病毒的實(shí)驗(yàn)必須在生物安全4級(jí)實(shí)驗(yàn)室內(nèi)操作。目前世界上具備上述條件的實(shí)驗(yàn)室為數(shù)不多。本發(fā)明發(fā)現(xiàn)埃博拉病毒NP基因的某一片段是埃博拉病毒的特征序列，可以代表埃博拉病毒而與其他病毒區(qū)分開來。而這一核苷酸片段沒有任何傳染性或致病性，可以在普通實(shí)驗(yàn)室中應(yīng)用，而不必在生物安全4級(jí)實(shí)驗(yàn)室內(nèi)操作。由此本發(fā)明建立了一種在世界上非P4級(jí)實(shí)驗(yàn)室可以用的檢測(cè)方法，可應(yīng)用于調(diào)查我國(guó)人或動(dòng)物是否感染了 EB0V。特異性遺傳標(biāo)志物目前埃博拉病毒共有5種亞型，該5種亞型的多個(gè)埃博拉病毒株的NP基因進(jìn)行同源性比較結(jié)果表明，5種亞型間基因序列同源性大于65%，亞型內(nèi)部不同毒株序列同源性95%以上，亞型間的差異區(qū)域集中在固定的點(diǎn)。雖然通過同源性比較，NP基因的全長(zhǎng)基因中有多個(gè)區(qū)域可以作為5種亞型埃博拉病毒的各個(gè)亞型的特異性標(biāo)志區(qū)域。但是SEQ ID NO USEQ IDNO :2、SEQ ID NO :3、SEQ IDNO 4, SEQ ID NO :5所示的核苷酸序列是特別優(yōu)選的分別適合作為EBOV Z、S、B、C、R的特異性遺傳標(biāo)志的序列。因此,基于 SEQ ID NO :1、SEQ ID NO :2、SEQ ID NO :3、SEQ ID NO 4、SEQID NO :5，本發(fā)明提供了各型埃博拉病毒的陽性標(biāo)準(zhǔn)分子。還提供了特異性擴(kuò)增這些陽性標(biāo)準(zhǔn)分子的引物對(duì)，所述的引物長(zhǎng)度25-38個(gè)核苷酸，且一個(gè)與SEQ ID NO U SEQ IDNO 2,SEQ ID NO :3、SEQ ID NO :4、或 SEQ ID NO 5 所示序列相同，另一個(gè)相應(yīng)的與 SEQ IDNO USEQ ID N0:2、SEQ ID NO :3、SEQ ID NO :4、或 SEQ ID NO :5 所示序列互補(bǔ)，并且擴(kuò)增產(chǎn)物的長(zhǎng)度為50-300bp，較佳的如297bp、196bp。例如，SEQ ID NO :6與SEQ ID N0:1所示的序列相同，而另一個(gè)引物SEQ ID NO :7與SEQ ID NO :1所示的序列互補(bǔ)，且擴(kuò)增產(chǎn)物的長(zhǎng)度為297bp。這些引物序列優(yōu)選SEQ ID NO 6 15所示。
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引物對(duì)本發(fā)明人根據(jù)5種亞型埃博拉病毒的NP基因特異性標(biāo)志片段，利用他們之間序列上的共同點(diǎn)及其差異，設(shè)計(jì)了引物對(duì)。該引物對(duì)在目前所有的五種埃博拉病毒標(biāo)準(zhǔn)株中擴(kuò)增出相應(yīng)的DNA片段，而未在其他相關(guān)病毒，包括馬爾堡病毒、新疆出血熱病毒、登革熱病毒、乙型腦炎病毒、豬瘟病毒、豬流感病毒、豬繁殖與呼吸綜合征病毒中擴(kuò)增出相應(yīng)片段，說明以NP基因片段為基礎(chǔ)設(shè)計(jì)的PCR反應(yīng)系統(tǒng)具有良好的特異性。并且該引物對(duì)可以在一個(gè)反應(yīng)體系中同時(shí)對(duì)五種亞型埃博拉病毒進(jìn)行檢測(cè)。在一次PCR反應(yīng)中，就可以鑒定樣品中是否含有埃博拉病毒病毒。只要待檢樣品中有五種亞型埃博拉病毒中的任何一種存在或者多種同時(shí)存在，就能檢測(cè)出來陽性。就敏感性而言，本發(fā)明以NP基因特異性標(biāo)志片段為基礎(chǔ)設(shè)計(jì)的PCR反應(yīng)系統(tǒng)能夠檢測(cè)到IO2個(gè)陽性標(biāo)準(zhǔn)分子/μ I。本發(fā)明檢測(cè)的敏感性可達(dá)到100個(gè)拷貝的病毒RNA分子(體外轉(zhuǎn)錄獲得)，對(duì)于單個(gè)樣本檢測(cè)小于2個(gè)小時(shí)，操作簡(jiǎn)易，可以進(jìn)行高通量的樣品檢測(cè)。本發(fā)明的引物對(duì)對(duì)于五種亞型EBOV中的任何一種都可以特異性擴(kuò)增得到產(chǎn)物，而對(duì)其他序列不能特異性擴(kuò)增，從而可以一次性檢測(cè)出待檢樣品中是否含有五種亞型EBOV中的任何一種或者多種RNA。該引物對(duì)中，引物長(zhǎng)度25±5nt，更佳的是20±2bp，其中一個(gè)引物含有一到兩個(gè)簡(jiǎn)并堿基，該簡(jiǎn)并堿基分別和Z、S、B、C、R五種亞型EBOV的特異性遺傳標(biāo)志序列的差異位點(diǎn)相同，該引物中該簡(jiǎn)并堿基以外的序列與Z、S、B、C、R五種亞型EBOV的特異性遺傳標(biāo)志序列相同或有個(gè)別不同，但是不影響PCR擴(kuò)增反應(yīng)；另一個(gè)引物也含有一到兩個(gè)簡(jiǎn)并堿基，該簡(jiǎn)并堿基分別和Z、S、B、C、R五種亞型EBOV的特異性遺傳標(biāo)志序列的差異位點(diǎn)互補(bǔ)，該引物中該簡(jiǎn)并堿基以外的序列與Z、S、B、C、R五種亞型EBOV的特異性遺傳標(biāo)志序列互補(bǔ)或有個(gè)別不互補(bǔ)，但是不影響PCR擴(kuò)增反應(yīng)，該引物對(duì)的擴(kuò)增片段為70-300bp。優(yōu)選的，所述的引物對(duì)中，一條是SEQ ID NO :16所示序列的核苷酸，另一條是SEQ ID NO17所示序列的核苷酸，該引物對(duì)的擴(kuò)增片段為196bp。本發(fā)明所述的特異性擴(kuò)增埃博拉病毒的引物，可根據(jù)本發(fā)明的遺傳標(biāo)記物的序列(SEQ ID NO 1 5)進(jìn)行設(shè)計(jì)，并通過常規(guī)的DNA合成方法獲得，例如可以用商業(yè)化的DNA自動(dòng)合成儀合成。本發(fā)明所述的引物具有很好的亞種特異性。用本發(fā)明的引物進(jìn)行常規(guī)RT-PCR反應(yīng)，結(jié)果能從含有埃博拉病毒RNA材料中擴(kuò)增出大小196bp的產(chǎn)物。因此，以本發(fā)明引物進(jìn)行常規(guī)PCR反應(yīng)，并通過判斷相應(yīng)大小PCR產(chǎn)物的有無可以準(zhǔn)確、快速的檢測(cè)埃博拉病毒，而且所需的樣品量很少。試劑盒將本發(fā)明的引物與熒光染料技術(shù)結(jié)合，便得到了本發(fā)明的埃博拉病毒的熒光定量PCR檢測(cè)方法及其試劑盒。這種方法不僅克服了常規(guī)PCT方法中的誤差，而且分析所需的樣品量少，檢出極限低，靈敏度高。為了增加對(duì)埃博拉病毒定量的功能，還可以使用熒光定量PCR?？梢圆捎们逗蠠晒馊玖戏ǎ捎脽晒馊玖蟂YBR Green I。SYBR Green I是熒光定量PCR最常用的DNA結(jié)合染料，與雙鏈DNA非特異性結(jié)合。在游離狀態(tài)下，SYBR Green I發(fā)出微弱的熒光，但一旦與雙鏈DNA結(jié)合，其熒光增加10 00倍。所以，一個(gè)反應(yīng)發(fā)出的全部熒光信號(hào)與出現(xiàn)的雙鏈DNA量呈比列，且會(huì)隨擴(kuò)增產(chǎn)物的增加而增加。在PCR反應(yīng)過程中，當(dāng)SYBR Green I與擴(kuò)增產(chǎn)生的雙鏈DNA結(jié)合，通過測(cè)定熒光強(qiáng)度，即可確定雙鏈DNA的含量。SYBR Green I特別是能用于所有PCR反應(yīng)體系，無需熒光探針，使檢測(cè)方法變得簡(jiǎn)便，同時(shí)也降低了檢測(cè)的成本。并且在PCR結(jié)束后可直接進(jìn)行融解曲線反應(yīng)分析。通過融解曲線的分析，能判斷是否存在著變異或非特異性的擴(kuò)增。SYBR Green I的最大吸收波長(zhǎng)約為497nm,發(fā)射波長(zhǎng)最大約為520nmo在一優(yōu)選例中，一種快速定量檢測(cè)埃博拉病毒的熒光定量PCR試劑盒，該試劑盒包括特異性擴(kuò)增埃博拉病毒遺傳標(biāo)記分子的引物和熒光探針。優(yōu)選的如引物序列為SEQ IDNO 16 和 SEQ ID NO :17。該試劑盒較佳的還包括陽性對(duì)照品，陰性對(duì)照品。其中，陽性對(duì)照品是埃博拉病毒的遺傳標(biāo)記核苷酸，優(yōu)選SEQ ID NO :1 5所示序列核苷酸中的任何一種或多種。陰性對(duì)照品是馬爾堡病毒、新疆出血熱病毒、或者登革熱病毒的NP基因?yàn)榛A(chǔ)的遺傳標(biāo)記核苷酸?；蛘呤且倚湍X炎病毒、豬瘟病毒、豬流感病毒、豬繁殖或呼吸綜合征病毒的培養(yǎng)物。該試劑盒較佳的還包括定量校準(zhǔn)品。本發(fā)明中所述的定量標(biāo)準(zhǔn)品是陽性對(duì)照分子SEQ ID NOI (選擇本發(fā)明所述的5種亞型病毒陽性對(duì)照分子都可以)，定量時(shí)采用SEQ ID N0:1的10倍梯度水稀釋液，稀釋度從ΙΟ'ΙΟ'ΙΟ'ΙΟ'ΙΟ'ΙΟ'ΙΟ'ΙΟΛ在熒光定量PCR中，由于每個(gè)稀釋度中RNA分子不同，得到的Ct值就不同，根據(jù)定量標(biāo)準(zhǔn)品(梯度稀釋的陽性對(duì)照分子)Ct值定量樣品中的病毒RNA分子。該試劑盒較佳的還包括常規(guī)的兩步法RT-PCR SYBR Green I熒光定量檢測(cè)試劑盒所包含的成分，如包括RNA提取試劑、反轉(zhuǎn)錄試劑、SYBR GreenI熒光定量檢測(cè)試劑。其中較佳的，RNA提取試劑含有Trizol、RNA酶抑制劑。反轉(zhuǎn)錄試劑含有逆轉(zhuǎn)錄酶(AMV)、AMV緩沖液。AMV緩沖液含有dNTPs、隨機(jī)引物、RNA酶抑制劑、無菌雙蒸水。SYBR Green I熒光定量檢測(cè)試劑含有SYBR Green I熒光定量反應(yīng)液，其中包括SYBR Green I熒光染料、PCR緩沖液、dNTPs溶液、Taq DNA聚合酶、無菌雙蒸水、MgCl2溶液。本試劑盒采用了 SYBR Green I嵌合熒光法進(jìn)行Real Time PCR的專用試劑，可快速對(duì)目的基因進(jìn)行定量檢測(cè)。較佳的，本試劑盒提供的SYBR Green I熒光定量檢測(cè)試劑中含有反應(yīng)液熒光定量組合物，其包含了引物、Taq酶等所有組份。使用時(shí)只需加入模板即可進(jìn)行PCR反應(yīng)，操作非?？旖莺?jiǎn)單。熒光可以被定量PCR儀內(nèi)的熒光信號(hào)采集系統(tǒng)檢測(cè)，熒光量的增加與PCR產(chǎn)物的積累量成正比例關(guān)系。對(duì)埃博拉病毒的定量可以通過與定量標(biāo)準(zhǔn)品的循環(huán)閾值(Ct，Threshold Cycle)相比較得出。Ct值是PCR過程中，熒光量的積累超過基底熒光量的循環(huán)數(shù)。Ct值與起始模板數(shù)成一定比例關(guān)系，Ct值越小,起始模板數(shù)越多；相反，Ct值越大,起始模板數(shù)越少。利用梯度稀釋標(biāo)準(zhǔn)品的Ct值制成標(biāo)準(zhǔn)曲線，再根據(jù)待測(cè)樣品的Ct值可以準(zhǔn)確測(cè)出該樣品的起始拷貝數(shù)。本發(fā)明的檢測(cè)埃博拉病毒的熒光定量PCR試劑盒，通過對(duì)各組分，如引物濃度、Mg2+濃度、退火溫度等的優(yōu)化，反復(fù)實(shí)驗(yàn)，試劑盒完全可以滿足快速特異檢測(cè)埃博拉病毒的實(shí)際需求。本發(fā)明還提供了 一種利用本發(fā)明的試劑盒檢測(cè)埃博拉病毒的方法，該方法包括以下步驟I)提取待檢樣品的RNA ；2)將上述提取的RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA ；3)將上述cDNA加入熒光定量反應(yīng)液中用實(shí)時(shí)熒光PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增檢測(cè)；4)通過比較待檢樣品和標(biāo)準(zhǔn)品的循環(huán)閾值而對(duì)待檢樣品的其實(shí)拷貝數(shù)進(jìn)行定量。下面用實(shí)施例來進(jìn)一步說明本發(fā)明，但本發(fā)明并不受其限制。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，或按照制造廠商所建議的條件。實(shí)施例中所述的“室溫”是指進(jìn)行試驗(yàn)的操作間的溫度，一般為25°C。以下實(shí)施例中，T7 RiboMAX Express RNAi System試劑盒購(gòu)自上海吉泰生物科技有限公司。dNTPs、dUTP、SYBR Premix Ex Taq(Perfect Real Time)試劑盒、AMV、RNA酶抑制劑購(gòu)自大連寶生物工程有限公司。引物由上海英俊生物技術(shù)有限公司合成。其它生化試劑均為進(jìn)口分裝或國(guó)產(chǎn)分析純。突光定量PCR儀是Mactercycler ep realplex4 (Effendorf Inc·)。ND-1000 微量紫外可見分光光度計(jì)購(gòu)自 NanoDrop Technologies,Inc. ο實(shí)施例1引物設(shè)計(jì)一、實(shí)驗(yàn)步驟
EBOV SYBR Green I熒光定量PCR引物指的是長(zhǎng)度25±5nt的寡核苷酸鏈，其與EBOV的Z、S、B、C、R 5種亞型病毒NP基因序列完全相同或者互補(bǔ)。根據(jù)NCBI基因數(shù)據(jù)庫(kù)中公布的EBOV和MARV、XFHV、DHFV的NP基因序列(參考毒株信息見表I)，利用引物和探針設(shè)計(jì)軟件Primer Express 2. O (美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)公司)設(shè)計(jì)了對(duì)Z、S、B、C、R 5種亞型EBOV特異性的引物。引物序列見表2，表2中引物基因位置指在 Zaire Ebola virus strain Mayinga(NCBI 登錄號(hào) AF499101.1)基因上位置。設(shè)計(jì)的引物與EBOV、MARV, XFHV, DHFV相應(yīng)基因序列比對(duì)結(jié)果見圖1。表1.設(shè)計(jì)引物和探針參考的毒株信息
權(quán)利要求
1.一種檢測(cè)埃博拉病毒的遺傳標(biāo)記分子,其特征在于，所述的遺傳標(biāo)記分子是埃博拉病毒NP基因的第857位至第1130位所示序列的核苷酸中連續(xù)的50-273個(gè)核苷酸，或者是埃博拉病毒NP基因的第878位至第1074位所示序列的核苷酸中連續(xù)的50-196個(gè)核苷酸，所述的位置是指在埃博拉病毒株Zaire Ebola virus strain Mayinga的NCBI登錄號(hào)AF499101.1所示NP基因上位置。所有的埃博拉病毒NP基因等位基因在上述位置范圍內(nèi)的核苷酸片段都是本發(fā)明保護(hù)的檢測(cè)埃博拉病毒的遺傳標(biāo)記。
2.如權(quán)利要求1所述的的遺傳標(biāo)記分子，其特征在于，所述的遺傳標(biāo)記分子是博拉病毒NP基因的第857位至第1130位所示序列的核苷酸，或者是埃博拉病毒NP基因的第878位至第1074位所示序列的核苷酸,所述的位置是指在埃博拉病毒株Zaire Ebola virusstrain Mayinga的NCBI登錄號(hào)AF499101.1所示NP基因上位置。
3.—種檢測(cè)埃博拉病毒的遺傳標(biāo)記分子的引物對(duì)，其特征在于，所述的引物長(zhǎng)度25-38 個(gè)核苷酸，且一個(gè)與 SEQ ID NO U SEQ ID NO :2、SEQ IDNO :3、SEQ ID NO :4、或 SEQID NO :5 所示序列相同，另一個(gè)相應(yīng)的與 SEQID NO USEQ ID N0:2、SEQ ID N0:3、SEQ IDNO :4、或SEQ ID N0:5所示序列互補(bǔ)，并且擴(kuò)增產(chǎn)物的長(zhǎng)度為50-300bp。
4.一種檢測(cè)埃博拉病毒的引物對(duì)，其特征在于，該引物對(duì)中，引物長(zhǎng)度15-30bp，其中一個(gè)引物含有一到兩個(gè)簡(jiǎn)并堿基，該簡(jiǎn)并堿基分別和Z、S、B、C、R五種亞型EBOV的特異性遺傳標(biāo)志序列的差異位點(diǎn)相同，該引物中該簡(jiǎn)并堿基以外的序列與Z、S、B、C、R五種亞型EBOV的特異性遺傳標(biāo)志序列相同或有個(gè)別不同，但是不影響PCR擴(kuò)增反應(yīng)；另一個(gè)引物也含有一到兩個(gè)簡(jiǎn)并堿基，該簡(jiǎn)并堿基分別和Z、S、B、C、R五種亞型EBOV的特異性遺傳標(biāo)志序列的差異位點(diǎn)互補(bǔ)，該引物中該簡(jiǎn)并堿基以外的序列與Z、S、B、C、R五種亞型EBOV的特異性遺傳標(biāo)志序列互補(bǔ)或有個(gè)別不互補(bǔ)，但是不影響PCR擴(kuò)增反應(yīng)，該引物對(duì)的擴(kuò)增片段為 70-300bp。
5.如權(quán)利要求4所述的引物對(duì)，其特征在于，所述的引物對(duì)中，一條是SEQID N0:16所示序列的核苷酸，另一條是SEQ ID NO :17所示序列的核苷酸。
6.一種檢測(cè)埃博拉病毒的PCR試劑盒，其特征在于，該試劑盒包括如權(quán)利要求4或5所述的引物。
7.如權(quán)利要求6所述的PCR試劑盒，其特征在于，所述的試劑盒還包括陽性對(duì)照品、陰性對(duì)照品、RNA提取試劑、反轉(zhuǎn)錄試劑、和SYBR GreenI熒光定量反應(yīng)液。
8.—種檢測(cè)埃博拉病毒的熒光定量PCR方法，其特征在于，包括以下步驟 1)提取待檢樣品的RNA； 2)將上述提取的RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA； 3)將上述cDNA加入熒光定量反應(yīng)液中用實(shí)時(shí)熒光PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增檢測(cè)； 4)通過比較待檢樣品和標(biāo)準(zhǔn)品的循環(huán)閾值而對(duì)待檢樣品的其實(shí)拷貝數(shù)進(jìn)行定量。
9.一種埃博拉病毒NP基因的用途，其特征在于，用于制備埃博拉病毒的遺傳標(biāo)記分子。
10.如權(quán)利要求1或2所述的檢測(cè)埃博拉病毒的遺傳標(biāo)記分子作為埃博拉病毒的特征序列在常規(guī)非生物安全P4級(jí)實(shí)驗(yàn)室中檢測(cè)埃博拉病毒的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種檢測(cè)埃博拉病毒(EBOV)的熒光定量PCR檢測(cè)方法及其引物和試劑盒。本發(fā)明是一種通用型檢測(cè)方法，只要待檢樣品中有Z、S、B、C、R五種亞型EBOV中的任何一種或者多種同時(shí)存在，就能檢測(cè)出來陽性。本發(fā)明利用PCR技術(shù)的核酸高效擴(kuò)增、SYBR Green I熒光染料和計(jì)算機(jī)輔助熒光檢測(cè)技術(shù)敏感性的優(yōu)點(diǎn)，克服了常規(guī)PCR檢測(cè)的不足，極大的提高了檢測(cè)的敏感性、特異性和操作的便利性。同時(shí)，本發(fā)明中采用的陽性對(duì)照是NP基因體外轉(zhuǎn)錄的一段RNA分子，相對(duì)于以滅活病毒液作為陽性對(duì)照的檢測(cè)，增加了安全性。體外轉(zhuǎn)錄的RNA分子還可以大量制備，陽性對(duì)照來源穩(wěn)定、可靠。
文檔編號(hào)C12R1/93GK103045755SQ20111031291
公開日2013年4月17日 申請(qǐng)日期2011年10月14日 優(yōu)先權(quán)日2011年10月14日
發(fā)明者馬志永, 史子學(xué), 魏建超, 邵東華, 王少輝, 李蓓蓓, 劉陽, 王宗堯 申請(qǐng)人:中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所