專利名稱：Pcv2重組桿狀病毒構建及其亞單位疫苗制備方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種PCV2重組構建及其亞單位疫苗制備方法，具體說是指一種PCV2 重組苜蓿丫紋夜蛾核型多角體病毒構建及其亞單位疫苗制備方法，屬生物技術領域獸用生物制品行業(yè)。
背景技術：
豬圓環(huán)病毒(Porcine circovirus,PCV)屬于圓環(huán)病毒科(Circoviridae)圓環(huán)病毒屬(Circovirus)，無囊膜，是目前發(fā)現(xiàn)的最小的動物病毒。根據(jù)致病性、抗原性和核酸序列的差異，將PCV可分為PCV-I和PCV-2。PCV-I尚未知有致病性；PCV-2具有致病性，能引起豬表現(xiàn)多種臨床癥狀。PCV-I基因組全長1759bp，PCV-2全長1768bp或1767bp，二者序列同源性小于80%?，F(xiàn)已經證實，PVC有兩個主要的閱讀框，ORFl和0RF2。ORFl是最大的閱讀框，與病毒的復制轉錄有關。0RF2編碼病毒的Cap蛋白，可以與PCV-2的抗血清反應， 是主要的免疫原。豬圓環(huán)病毒現(xiàn)已成為全球廣泛傳播的豬病病毒，其具有流行范圍廣、各生長階段豬感染嚴重、混合感染突出等特點。PCV2在我國的流行始于2000年，在我國該病毒的陽性率也呈逐年上升的趨勢，2001-2002年在我國華南地區(qū)出現(xiàn)過一次爆發(fā)高潮，目前在許多省份危害嚴重，給我國養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的損失，嚴重威脅了我國養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展。目前世界上研發(fā)的圓環(huán)病毒疫苗主要種類有PCV2全病毒滅活疫苗CIRC0VAC ； PCV1-PCV2嵌合病毒滅活疫苗SuvaXynPCV2 ；桿狀病毒表達多肽PCV2基因工程疫苗 CircoFLEX和Porci 1 isPCV，其中SuvaxynPCV2是第一個在美國獲得了完整許可證的疫苗。與其他表達系統(tǒng)相比，桿狀病毒表達系統(tǒng)具有以下的優(yōu)越性桿狀病毒的衣殼和基因組大，可容納101Λ左右外源DNA且不影響復制，還可同時進行多個外源片段的表達； 應用晚期蛋白啟動子，即使外源基因產物對細胞有毒性，也不影響表達水平(韓慶功、崔艷紅、劉寶國.昆蟲桿狀病毒表達系統(tǒng)在禽流感病毒研究中的應用.吉林農業(yè)科學.2010， 35(1) :38-41,44.)；桿狀病毒具有明顯的宿主界限，對脊椎動物無致病性，也不能在脊椎動物細胞內復制表達更不能整合，因此對眾多生物具有很高安全性；多角體蛋白與PlO基因是非必需片段，啟動子均很強；外源基因插入多角體蛋白基因的座位引起后者的缺失或失活，無多角體蛋白形成，從而導致重組病毒在自然環(huán)境下極易失活，不會造成對人的危害和對環(huán)境的污染；昆蟲細胞作為真核細胞能完成外源蛋白的一系列轉譯后加工修飾，表達產物的理化和生物學特性與天然產物相似度很高；其病毒在昆蟲細胞內產量高，因此可以高效表達轉座基因蛋白。此外，昆蟲細胞的無血清培養(yǎng)技術已經十分成熟，表達產物的下游處理更加方便。利用傳統(tǒng)的豬腎細胞培養(yǎng)技術生產圓環(huán)病毒滅活疫苗，病毒效價低，抗原含量不足，生物安全性差。利用桿狀病毒表達系統(tǒng)對PCV2 Cap蛋白進行高效表達，可得到更高含量的抗原蛋白，且下游處理工藝更加成熟，對圓環(huán)病毒流行的監(jiān)測和防控都有巨大的應用價值。

發(fā)明內容
為了解決和抑制豬圓環(huán)病毒的廣泛傳播，本發(fā)明的目的是提供一種更有效的預防豬圓環(huán)病毒2型感染的的豬圓環(huán)病毒2型Cap蛋白亞單位疫苗和其構建及生產方式，亦可制備PCV2特異性快速診斷用品。本發(fā)明所指PCV2重組苜蓿丫紋夜蛾核型多角體病毒是用分子生物學手段后獲得的含有密碼子優(yōu)化后的PCV2 0RF2核苷酸序列(SEQ ID No. 3)和氨基酸序列(SEQ ID No. 4)能高效表達PCV2表面抗原(Cap蛋白)的苜蓿丫紋夜蛾核型多角體病毒(Autographa californica multicapsid nucleopolyhedrovirus，AcMNPV)，本發(fā)明以下簡稱為PCV2重組桿狀病毒或重組桿狀病毒。本發(fā)明主要通過以下技術方案實施的1.構建一株含SEQ ID No. 3核苷酸序列和SEQ ID No. 4氨基酸序列、能高效表達 PCV2表面抗原(Cap蛋白)的PCV2重組桿狀病毒。2.本發(fā)明PCV2重組桿狀病毒的構建方法為(1)以根據(jù)文獻中0RF2基因序列設計引物，擴增PCV2HZ株DNA為模板，以 Seq-U(SEQ ID No. 1. )ID No. 2)為引物，用 TaKaRa rTaq 酶進行 PCV2-0RF2 片段的PCR擴增；反應程序為95變性5min后進入循環(huán)，94 V變性60s，56°C退火45s，72°C 延伸30s, 30個循環(huán)后，72°C充分延伸IOmin。取5 μ L擴增產物加1 μ L 6 X Loading Buffer 混勻后，于瓊脂糖凝膠中電泳，分析擴增產物。0RF2基因克隆擴增產物DNA，經過PCR檢測結果與預期的結果一致，約為760bp。(2)將擴增產物經雙酶切后連接到苜蓿丫紋夜蛾核型多角體病毒穿梭載體pPAK/ mod上，再轉化至大腸桿菌DHlOBac感受態(tài)細胞中，提取高純度的質粒pPAK/CY ；(3)將pPAK/CY質粒與缺失0RF16^基因的苜蓿丫紋夜蛾核型多角體病毒基因組 DNA共轉染昆蟲細胞，篩選得到重組的桿狀病毒；(4)根據(jù)蝕斑克隆方法純化病毒，并感染Sf9_F細胞；通過血清免疫熒光方法鑒定篩選出高表達量的陽性重組桿狀病毒Bac/CY株(此毒株已于2011年09月沈日送交北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號中國科學院微生物研究所中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，保藏編號為CGMCC No. 5267)。3.亞單位疫苗制備采用懸浮細胞培養(yǎng)技術培養(yǎng)昆蟲細胞Sf9_F，培養(yǎng)環(huán)境為 270C 120r/min,培養(yǎng)約4 其細胞處在對數(shù)生長期時將接入重組的桿狀病毒Bac/CY，再經過7 培養(yǎng)，收獲感染細胞，病毒效價能達到108_°TCID5Q/ml以上，反復凍融3次，用PBS離心洗滌方法數(shù)次后取上清，上述重組蛋白提純加入佐劑并經過乳化即可生產出對PCV2的 0RF2亞單位疫苗。


圖IPCR擴增產物電泳2穿梭載體示意3穿梭質粒示意4免疫小鼠的血清中和抗體滴度實驗圖5細胞生長曲線圖6抗原表達含量對比圖
具體實施例方式下面將結合具體實施例來輔助說明本發(fā)明，本領域一般技術人員可據(jù)此更好的理解本發(fā)明，但下述實施例僅作為技術示范，并不對本發(fā)明構成任何限制。本發(fā)明克隆并優(yōu)化PCV2 HZ株(本發(fā)明人由浙江省感染2型圓環(huán)病毒的發(fā)病豬分離、鑒定得到)0RF2序列，并將其重組至穿梭載體pPAK/mod(購自Clonetech Laboratories, Inc.)上。將苜蓿丫紋夜蛾核型多角體病毒基因組BacPAK6 (購自Clonetech Laboratories, Inc.)以限制性內切酶Bsu36I (購自Takara Bio, Inc.)酶切，使其缺失 0RF1629基因。提取pPAK/mod質粒與上述缺失0RF16^基因的BacPAK6桿狀病毒基因組共轉染昆蟲細胞Sf9-F株(購自Cambivac，Ltd.)，得到一株Bac/CY株重組桿狀病毒，利用重組桿狀病毒，感染昆蟲細胞Sf9-F，培養(yǎng)48-7 后，高效表達豬圓環(huán)病毒2型Cap蛋白，病毒蛋白混合物經滅活，純化，乳化后，制成亞單位疫苗。一、PCV2重組桿狀病毒構建1.豬圓環(huán)病毒2型浙江株0RF2基因的克隆按照hvitrogen DNAzol 說明書提取豬圓環(huán)病毒2型HZ株DNA作為模板，以 Seq-U(序列 1:5，-AGTGCTCGGAGGATCCATGACGTATCCAGGGAGGC-3，)與 Seq-D (序列 2:5' -G AGCAGATCTTTAGGTGTTAAGTGGGGGGTCTTTAAG-3 ‘)作為擴增引物，用 TaKaRariTaq 酶進行 PCV2-0RF2片段的PCR擴增，反應程序為95變性5min后進入循環(huán)，94°C變性60s，56°C退火 4&，721延伸308，30個循環(huán)后，721充分延伸101^11。取5 4 1^擴增產物加1口1^ 6XLoading Buffer混勻后，于瓊脂糖凝膠中電泳，分析擴增產物。0RF2基因克隆擴增產物DNA，經過PCR檢測結果與預期的結果一致，約為760bp(已包含了引物長度)，片段測序結果表明， 該片段為PCV2-0RF2片段。將回收鑒定后的PCV2-0RF2片段與pGEM-T easy載體(購自Promega Corporation)連接，參照!Iomega pGEM-T easy載體試劑盒說明進行操作。取上述連接產物，在無菌條件下加入到感受態(tài)細胞中，混勻后冰浴30min。迅速放入42°C水浴中熱激 90s，立即取出后，冰浴2 ;3min使之冷卻。將熱激后的混合物加入800 μ L預熱至37°C的 LB培養(yǎng)液(Amp-)中，37°C，170r/min搖床中振蕩培養(yǎng)1.證。將培養(yǎng)物5000r/min室溫離心 2min,棄去800 μ L上清?；靹蚴Ｓ嗟呐囵B(yǎng)液和細胞沉淀，均勻涂布于Amp+平板上。倒置平皿于37°C培養(yǎng)箱培養(yǎng)過夜挑取轉化菌落。從LB平板挑取重組轉化陽性菌落，接種于3mL含100 μ g/mLAmp的LB培養(yǎng)液中， 200r/min、37°C振蕩培養(yǎng)1 16h(或過夜)。無菌移取上述菌液1. 5mL置于滅菌離心管中，參照Qiagen Plasmid mini kit試劑盒進行質粒提取。2.用限制性內切酶Xho I和BamH I對PCV2 0RF2基因進行雙酶切，1 %瓊脂糖凝膠電泳檢查觀察結果。回收酶切后的PCV2 0RF2片段。3.重組穿梭質粒pPAK/mod的構建將pPAK8 質粒(Clonetech Laboratories, Inc.)以限制性內切酶 Xho I 和 BamH I雙酶切，瓊脂糖凝膠電泳分離并回收酶切后的PPAK8質粒。紫外分光光度計分析回收片段的純度與濃度。酶切后的PPAK8質粒與酶切后的PCV2 0RF2片段以1 3的摩爾比加入10 μ L連接體系中，16°C連接過夜。以全部連接產物轉化100 μ L的DHlOBac感受態(tài)細胞 (Clonetech Laboratories, Inc.)，^^取可疑轉化菌胃，參照 Qiagen Plasmid mini kit i式劑盒進行質粒提取，Xho I和BamH I雙酶切鑒定是否含有重組質粒pPAK/CY。挑取重組轉化陽性菌落，接種于6mL含抗生素的培養(yǎng)液中，200rpm、37°C振蕩培養(yǎng)12h 16h(或過夜)。無菌移取上述菌液1.5mL分裝置于滅菌離心管中，參照Qiagen Plasmid mini kit試劑盒進行質粒提取。獲得高純度的pPAK質粒。質粒同時進行序列測定，進一步確認含有PCV2-0RF2片段。4.重組質粒pPAK/CY與桿狀病毒0RF16^缺失基因組DNA共轉染SF9-F細胞本發(fā)明采用BacPAK桿狀病毒表達系統(tǒng)選擇了一個特殊構建的桿狀病毒，該病毒基因組BacPAK6經過Bsu36 I單酶切后，得到缺失了 0RF16^基因的桿狀病毒基因組DNA， 只有當與pPAK/CY質粒上攜帶的0RF16^基因共同轉染成功，才可以產生重組病毒顆粒。取長至對數(shù)生長期的Sf9_F細胞以3xl04細胞/cm2的密度接種密度，接種直徑為 35mm的培養(yǎng)皿，得到Sf9_F單層細胞。取2個微量離心管，將純化提取的重組質粒pPAK/ CY、陽性對照質粒、無菌水、0RF1629缺失的桿狀病毒基因組按比例混合，設置陰性對照與陽性對照，以pBacPAK8-GUS質粒替代pPAK/mod做為陽性對照，陰性對照不含pPAK/mod質粒及桿狀病毒基因組。向混合好的體系中加入4微升Bacfectin轉染試劑Ononetech Laboratories, Inc.)后，充分混勻，逐滴加至Sf9_F單層細胞上，27度孵育5小時后，吸去上層液體，加入1.5mLBacPAK完全培養(yǎng)基，同時向陽性對照上層培養(yǎng)基中添加50微升 X-gluc底物，27度培養(yǎng)約5天。陽性對照應轉為藍色，證明轉染正常。檢查Sf9-F細胞病變情況，當轉染的Sf9-F細胞出現(xiàn)病變后，收獲pPAK/CY轉染的Sf9-F細胞培養(yǎng)物上清，該上清中即含有重組桿狀病毒。5.重組病毒的純化與鑒定取少量初代重組桿狀病毒，10倍倍比稀釋后，接種單層Sf9_F細胞，27度孵育1小時后，吸走病毒液，加入含有1 %瓊脂的BacPAK完全培養(yǎng)基，置27度培養(yǎng)箱，加濕培養(yǎng)4 6天。逐天觀察細胞病變情況，挑取單一蝕斑后，接種新的Sf9-F細胞，待活細胞比例降至 20%以下收獲，獲得數(shù)個桿狀病毒單克隆。病毒液以蝕斑法測定效價，按蝕斑形成單位計
笪弁。取圓型蓋玻片數(shù)個，置M孔板中，加入100 μ 1多聚賴氨酸包被1小時，PBS沖洗 3次，向M孔板中加入Sf9-F細胞3xl04個/cm2，培養(yǎng)過夜后，以感染復數(shù)MOI 10. 0接種經過克隆的桿狀病毒，27度培養(yǎng)4天，丙酮固定，以PCV2陽性血清做為一抗，免疫熒光法檢測抗原表達，篩選高表達量的陽性毒株，并命名為重組桿狀病毒(苜蓿丫紋夜蛾核型多角體病毒 Autographa californica multicapsid nucleopolyhedrovirus, AcMNPV)Bac/ CY(CGMCCNo. 5267)。6.重組桿狀病毒株的特定重組蛋白的表達及分析抗原捕獲ELISA定量法分析抗原表達量以CsCl密度梯度離心的方法純化PCV2 HZ株，與弗氏佐劑混合后，免疫4_5周齡家兔2只。分別在觀，42，56天進行二免，三免及四免。前兩次免疫用弗氏完全佐劑，后兩次免疫用弗氏不完全佐劑。最終在第63天進行血清采集。
用ftOtein A凝膠層析柱對兔抗_PCV2 IgG進行純化，Bradford法測定純化的抗
體含量。利用包被液對兔抗-PCV2 IgG進行1 10000倍稀釋后，包被于微量滴定板中， 100 μ L/孔，4°C密封培育過夜。然后用含有吐溫20的磷酸緩沖液PBS洗滌該平板三次。 而后用BSA封閉液進行封閉，37 °C密封作用60min。繼續(xù)用含有吐溫20的磷酸緩沖液PBS洗滌該平板三次。下一步將預先稀釋200倍或500倍的待測抗原樣品加入到平板第一列各孔中，然后依次倍比稀釋，37°C密封作用60min。用洗液洗滌三次?？筆CV2 Cap蛋白的單抗(購自VMRD，he.)用稀釋液進行1 500倍稀釋后加入到各孔中，100 μ L/孔， 37°C密封作用60min。用洗液洗滌三次。用含有BSA的稀釋液1 10000稀釋堿性磷酸酶標記的羊抗兔IgG 二抗，每孔加入100 μ L，37°C密封作用60min。用洗液洗滌三次。加入100 μ L底物顯色，37°C密封作用30min，而后用每孔加入100 μ L 3Μ的NaOH終止反應。 然后通過酶標儀進行讀數(shù)，確定抗原稀釋終點，以此為基準，計算抗原含量。Sf9-F昆蟲細胞以120r/min 27°C搖瓶懸浮培養(yǎng)，當濃度達到1 2X 106/mL且活細胞比例高于95%時，以感染復數(shù)(M. 0.1. )1.0的比例接入重組的桿狀病毒。經過3-4天培養(yǎng)，IOOOOg離心Imin分離細胞碎片和上清，以上述抗原捕獲ELISA法檢測抗原表達量。 本發(fā)明所涉及重組病毒接種少量懸浮培養(yǎng)的昆蟲細胞，目的蛋白表達量可達150μ g/ml左右ο7.重組桿狀病毒Bac/CY在小鼠上免疫原性反應研究。接種重組桿狀病毒Bac/CY在Sf9_F昆蟲細胞上培養(yǎng)72h，將其收獲并_20°C /37°C 凍融三次，3000g離心10分鐘，取上清。以抗原捕獲ELISA檢測抗原含量。隨機選取8只成年昆明鼠，腹膜內注射16yg/只0. Iml ；同時隨機另選取8只成年小鼠作對比實驗，同樣采取腹膜內注射生理鹽水。第一次免疫14天后等量加強免疫一次， 第觀天眼球采血分離血清。將倍比稀釋的中和血清和200個TCID50的PCV2病毒混合37°C溫育1小時后接種 HQ5細胞的細胞板，然后加入細胞生長液培養(yǎng)72h。去除病毒液，用1 1的乙醇和丙酮固定細胞板30分鐘；用PBS清洗細胞板3次，加入5%脫脂奶封閉處理Ih ；然后用PBS清洗， 加入1 400稀釋的抗PCV2病毒的一抗作用1.5小時，然后用PBS清洗3次，加入1 200 稀釋的含F(xiàn)ITC的二抗避光處理1小時。然后再用PBS清洗3次。最后在免疫熒光顯微鏡下觀察，判定小鼠血清的中和抗體效價。實驗結果如附圖4，實驗結果發(fā)現(xiàn)在兩次免疫后小鼠中和血清中和效價最高為 1 128，最低1 32。說明收獲病毒液內表達出的PCV2 Cap蛋白可以誘導小鼠產生很強的細胞免疫，本發(fā)明制成的PCV2 Cap蛋白具有很好的免疫原性。二、以本發(fā)明構建的重組桿狀病毒株(Bac/CY)，接種昆蟲細胞表達的PCV2 Cap蛋白產物為抗原，制備亞單位疫苗。取培養(yǎng)至對數(shù)生長期的Sf9_F細胞，苔酚藍染色并計數(shù)細胞數(shù)，細胞數(shù)量應在l-26/ml之間，活細胞比例應在98 %以上。依據(jù)細胞計數(shù)結果，接種所需病毒數(shù)量。 270C 120r/min培養(yǎng)，每對小時取樣一次。抗原捕獲ELISA法檢測抗原表達量。研究試驗對制備重組蛋白在昆蟲細胞的表達參數(shù)進行了優(yōu)化，用5個感染單位種毒接種昆蟲細胞，用表達的5批次重組蛋白作為抗原進行了亞單位疫苗的研制。將重組蛋白培養(yǎng)物與免疫佐劑乳化制備亞單位疫苗。制作方法如下首先將重組病毒培養(yǎng)物收獲后，凍融三次進行細胞破碎，在HITACHI連續(xù)流離心機內17000r/min離心，出去細胞碎片。配制IM溴乙胺氫溴酸鹽(BEA)溶液及20%的硫代硫酸鈉溶液，過濾除菌后備用。將離心后的上清液在37°C中進行溫度平衡，加入終濃度 0. 25%的酚紅后，緩慢向病毒上清液中加入BEA，混勻后用2M的NaOH調pH值至7. 5 8. 0 ； 37°C滅活18h，之后再用2M的HCl調pH值至6. 5，最后加入硫代硫酸鈉溶液中和過剩的BEA， 37°C孵育池后4°C保存?zhèn)溆?。激流反應器AP20C培養(yǎng)的Sf 9-F細胞，接種重組桿狀病毒株Bac/CY (CGMCC No. 5267)，高量表達PCV2 Cap蛋白。昆蟲細胞的生長受制于氧氣的供給與營養(yǎng)的消耗，往往不能達到較高的細胞密度，用激流式培養(yǎng)的方式(見附注)，可以在產生低剪切力的同時，使系統(tǒng)內的溶氧均一得到更高的細胞培養(yǎng)密度。接種該細胞后，檢測結果顯示，目的蛋白表達量更高。試驗操作程序將5L SF900-II昆蟲細胞培養(yǎng)基注入AP20C系統(tǒng)激流袋(購自 AmProtein-China, Inc.)內，27°C 50r/min pH 7. IDO 60%運轉過夜，檢驗系統(tǒng)是否無菌。 接種培養(yǎng)至7. 57ml的Sf9-F細胞懸液共200ml，27°C 80r/min其余參數(shù)不變。每隔6小時取樣一次，待細胞生長至36/ml時，以10個感染復數(shù)(MOI)接種CGMCC No. 5267株病毒種子懸液，培養(yǎng)參數(shù)不變。每隔12小時取樣一次，IOOOOg離心lmin，分離細胞與上清，細胞沉淀以等體積PBS重懸，檢測上清與沉淀中抗原表達量。試驗結果接種Sf9_F細胞于激流袋，經84小時培養(yǎng)，細胞數(shù)達到2.986個/ml (附圖5)。接種重組桿狀病毒后繼續(xù)培養(yǎng)6天，抗原表達檢測結果顯示病毒感染初期，抗原蛋白主要集中在細胞沉淀中，上清中抗原含量很少；病毒感染后期，抗原主要分布于上清中； 抗原表達最高水平出現(xiàn)在接毒后120小時，總抗原含量可達238. 17 μ g/ml (附圖6)。以下進行乳化的過程首先進行油相與水相的配制白油與司本-80按照94%和6%的配比進行配制，混勻，并進行高壓滅菌，待溫度降低至20 30°C時備用。將吐溫-80進行高壓滅菌，待溫度降低至20 30°C時備用。將稀釋至50 μ g/ml的抗原原液與滅菌的吐溫_80按照95%和 5%的比例進行混勻，并讓吐溫-80充分的溶解在抗原液中，儲存至2 8°C備用。油相與水相配制完成后按1 1的比例進行乳化分裝，抗原最終含量約為25 μ g/ ml。按獸用《中國獸藥典》(中國獸藥典委員會.中華人民共和國獸藥典二〇〇五年版三部中國農業(yè)出版社，2006，本發(fā)明簡稱《中國獸藥典》)要求進行了半成品與成品疫苗的檢驗，用檢驗合格制品進行臨床試驗。試驗結果用試制的PCV2_Cap亞單位疫苗2倍劑量(4mL/頭)肌肉接種25日齡仔豬5頭，臨床觀察洲天未見無異常反應，證明疫苗制品對本動物是安全的。疫苗免疫效力試驗是采用0. 5mL、lmL、2mL三種劑量免疫25日齡仔豬，每組5頭，設未接種疫苗對照豬 3頭。所有疫苗免疫后觀天抗體檢測全部轉陽；強毒攻擊試驗結果表明，ImL和2mL免疫組均獲得100%保護，0. 5mL組獲得80% (4/5)保護率。三、亞單位疫苗的檢驗1.使用本發(fā)明方法表達的PCV2 Cap蛋白制備亞單位疫苗并進行安全性檢驗。
將所述所制備的亞單位疫苗成品接種4頭20日齡的仔豬，連續(xù)觀察30天，在此期間仔豬的精神食欲正常，未見異常變化，通過ELISA方法均可以檢測到豬圓環(huán)病毒2型抗體。強毒對照組4頭仔豬全部出現(xiàn)PCV2感染，并且有3只死亡(即死亡率75%)，尸體組織檢驗發(fā)現(xiàn)均發(fā)生淋巴結水腫，肺臟水腫，腎臟發(fā)黃或有點狀壞死等病變。而對照組4頭無任何異常臨床表現(xiàn)。所制備的亞單位疫苗成品接種和未接種的妊娠母豬，窩產仔數(shù)基本相當，均沒有出現(xiàn)死胎等現(xiàn)象，證實該亞單位疫苗是安全的。2.使用本發(fā)明方法表達的PCV2 Cap蛋白制備亞單位疫苗并進行效力檢驗。將所述所制備的亞單位疫苗成品接種4頭20日齡的仔豬，且在14天后進行二免， 在二免后21天進行強毒攻毒，攻毒后逐天觀察均未出現(xiàn)明顯的臨床癥狀，精神食欲正常。 強毒對照組，在攻毒后出現(xiàn)體溫升高、食欲減退、消瘦和生長速度緩慢。剖檢后發(fā)現(xiàn)有淋巴結、肺部水腫，腎臟有點狀病變。將所述所制備的亞單位疫苗成品在后備母豬配種前15天接種，然后分別在42、60 天進行強毒攻毒，妊娠母豬均未出現(xiàn)明顯的臨床癥狀，精神食欲正常，并能檢測到高水平的豬圓環(huán)病毒2型血清中和抗體。分娩豬在分娩時未出現(xiàn)死胎等現(xiàn)象。而接種強毒的對照妊娠母豬，部分出現(xiàn)胎兒重吸收，腹圍減小妊娠終止，產下死胎及少數(shù)弱胎，母豬則出現(xiàn)體溫升高、食欲減退、消瘦和生長速度緩慢等現(xiàn)象。這些結果表明，所述亞單位疫苗可以保護豬免受圓環(huán)病毒2型強毒株的攻擊。3.其他項目檢驗按《中國獸藥典》規(guī)定的項目進行疫苗成品的檢驗。性狀外觀乳白色乳狀液。劑型為油包水型。取一清潔吸管，吸取少量疫苗滴于冷水表面，除第1滴外，均應不擴散。穩(wěn)定性在37°C左右條件下放置21日或取疫苗IOmL裝于離心管中，以3000r/min 離心15min，應不破乳。黏度按《中國獸藥典》規(guī)定進行，應不超過200cP。無菌檢驗按《中國獸藥典》規(guī)定的方法檢驗，應無菌生長。甲醛和汞類防腐劑殘留量測定按中國獸藥典的規(guī)定進行，甲醛殘留量應不超過 0.2%的甲醛溶液(含40%甲醛)量；苯酚殘留量應不超過0.5% ；汞類防腐劑殘留量應不超過0.01%。四、以本發(fā)明構建的重組桿狀病毒株(Bac/CY)，接種昆蟲細胞表達的PCV2 Cap蛋白產物為抗原，由于該蛋白具有良好的免疫原性，能按現(xiàn)有技術制備制成豬圓環(huán)病毒2型病毒檢測試劑盒(如ELISA檢測試劑盒)用于非疾病診斷目的檢測豬圓環(huán)病毒2型病毒流行病學和病毒學研究。將重組桿狀病毒表達的PCV2 Cap蛋白120 μ g/ml與等量弗氏佐劑乳化完全，免疫 5-6周齡家兔2只。分別在觀，42進行二免，三免。第一次免疫用弗氏完全佐劑，后兩次免疫用弗氏不完全佐劑。最終在第50天進行血清采集。用ftOtein A凝膠層析柱對兔抗-PCV2 IgG進行純化，Bradford法測定純化的抗
體含量。純化的抗體用包被液進行1 8000倍稀釋后，包被于微量滴定板中，100 μ L/孔，4°C密封培育過夜。然后用含有吐溫20的磷酸緩沖液PBS洗滌該平板三次。而后用 BSA封閉液進行封閉，37°C密封作用60min。繼續(xù)用含有1 %吐溫20的磷酸緩沖液PBS洗滌該平板三次。用含有BSA的PBS按1 40的比例稀釋待測抗原樣品，將稀釋好的待檢樣品100 μ L加入到樣品孔中，在其相鄰兩側各加入100 μ L陰性血清和陽性血清作為對照，同時設置空白對照孔，37°C密封作用60min。用洗液洗滌三次?？筆CV2 Cap蛋白的單抗 (購自VMRD，Inc.)用稀釋液進行1 500倍稀釋后加入到各孔中，100 μ L/孔，37°C密封作用60min。用洗液洗滌三次。用含有BSA的稀釋液1 10000稀釋堿性磷酸酶標記的羊抗兔IgG 二抗，每孔加入100 μ L，37°C密封作用60min。用洗液洗滌三次。加入100 μ L稀釋至工作濃度的P-NPP底物顯色，37°C密封作用30min，而后用每孔加入100 μ L 3Μ的NaOH 終止反應。然后通過酶標儀讀取0D405，計算Ρ/Ν值。以Ρ/Ν彡2.1判定為陽性，介于2.1 和1. 5之間為可疑，低于1. 5為陰性。陰性陽性對照血清都成立時，判定檢測結果有效。實施例以下實施例為進一步對本發(fā)明進行闡述，但這些實施例不構成對本發(fā)明的限制。實施例1亞單位疫苗的制備采用普通細胞培養(yǎng)裝置用懸浮培養(yǎng)細胞技術培養(yǎng)昆蟲細胞Sf9_F，培養(yǎng)環(huán)境為27°C 120r/min，培養(yǎng)約4 其細胞處在對數(shù)生長期時將接入重組的桿狀病毒Bac/ CY(CGMCCNo. 5267株)，再經過72h培養(yǎng)，收獲感染細胞，病毒效價能達到108_°TCID5(1/ml以上，反復凍融3次，用PBS離心洗滌方法數(shù)次后取上清，上述重組蛋白提純加入常規(guī)疫苗佐劑并經過乳化即成PCV2重組桿狀病毒亞單位疫苗。實施例2激流反應器AP20C培養(yǎng)的Sf9_F細胞，制備亞單位疫苗將Sf9_F細胞接種到激流袋，經84小時培養(yǎng)，細胞數(shù)達到2. 986個/ml (附圖5)。 接種重組桿狀病毒CGMCC No. 5267株病毒種子懸液后繼續(xù)培養(yǎng)6天，抗原表達檢測結果顯示病毒感染初期，抗原蛋白主要集中在細胞沉淀中，上清中抗原含量很少；病毒感染后期，抗原主要分布于上清中；抗原表達最高水平出現(xiàn)在接毒后120小時，總抗原含量可達 238. 17 μ g/ml (附圖6)。其他過程同實施例1。實施例3PCV2重組桿狀病毒亞單位疫苗制備可以采用轉瓶培養(yǎng)細胞技術培養(yǎng)昆蟲細胞Sf9_F，制備PCV2重組桿狀病毒亞單位疫苗。其他過程同實施例1。實施例4疫苗檢驗性狀外觀乳白色乳狀液。劑型為油包水型。取一清潔吸管，吸取少量疫苗滴于冷水表面，除第1滴外，均不擴散。穩(wěn)定性在37°C左右條件下放置21日或取疫苗IOmL裝于離心管中，以3000r/min 離心15min，不破乳。黏度按《中國獸藥典》規(guī)定進行，不超過200cP。
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無菌檢驗按《中國獸藥典》規(guī)定的方法檢驗，均無菌生長。安全檢驗用PCV2-Cap亞單位疫苗2倍劑量(4mL/頭)肌肉接種25日齡仔豬5 頭，臨床觀察觀天未見無異常反應，證明疫苗制品對本動物是安全的。效力檢驗疫苗免疫效力試驗是采用2mL三種劑量免疫25日齡仔豬5頭，設未接種疫苗對照豬3頭。所有疫苗免疫后觀天抗體檢測全部轉陽(5/5)，為免疫豬(3/ 仍為陰性；強毒攻擊試驗，疫苗免疫之后三周滴鼻接種PCV2-HZ株，每頭豬接種106_5TCID5tlt5結果表明，ImL和2mL免疫組均獲得(5/5) 100%保護，對照組豬(3/ 全部體溫升高、食欲減退、精神沉郁，解剖發(fā)現(xiàn)肺部淋巴結均出現(xiàn)水腫，腎臟有點狀壞死。甲醛和汞類防腐劑殘留量測定按中國獸藥典的規(guī)定進行，甲醛殘留量不超過 0.2%的甲醛溶液(含40%甲醛)量；苯酚殘留量不超過0.5% ；汞類防腐劑殘留量不超過 0. 01%。注激流式生物反應器是一種新型細胞培養(yǎng)設備，采用高效“激流式給氧機制”(W02007/1似664和W02006/13814;3)進行傳氧。通過機械振蕩產生激流，反復沖刷聚集于培養(yǎng)袋內表面的氧分子層，使氧分子迅速溶解于培養(yǎng)液中，并不斷地混合，充分傳遞，每個細胞都能得到充足的氧，維持細胞正常生長代謝。這種激流式給氧機制避免了傳統(tǒng)鼓泡式給氧產生的氣泡破裂對細胞形成的損傷和強機械攪拌對細胞形成的剪切力，使細胞培養(yǎng)密度大幅度提高，病毒產量明顯增加。
權利要求
1.一種PCV2重組苜蓿丫紋夜蛾核型多角體病毒，其特征在于該PCV2重組苜蓿丫紋夜蛾核型多角體病毒含SEQ ID No. 3核苷酸序列和SEQ ID No. 4氨基酸序列、能高效表達 PCV2Cap蛋白；該Bac/CY株病毒已于2011年09月沈日送交北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號中國科學院微生物研究所中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，保藏編號為CGMCC No. 5267。
2.如權利要求1所述一種PCV2重組苜蓿丫紋夜蛾核型多角體病毒構建，其特征在于重組苜蓿丫紋夜蛾核型多角體病毒的構建主要步驟包括(1)以根據(jù)文獻中0RF2基因序列設計引物，擴增PCV2HZ株DNA為模板，以kq-U (SEQ ID No. 1.)和 kq-D(SEQ ID No. 2)為引物，進行 PCV2-0RF2 片段的 PCR 擴增；(2)將擴增產物連接至克隆載體pGEM-T上進行鑒定；陽性質粒經雙酶切后連接到苜蓿丫紋夜蛾核型多角體病毒穿梭載體pPAK/mod上，再轉化至大腸桿菌DHlOBac感受態(tài)細胞中，提取高純度的質粒pPAK/CY ；(3)將pPAK/CY質粒與缺失0RF16^基因的苜蓿丫紋夜蛾核型多角體病毒基因組DNA 共轉染昆蟲細胞，篩選得到重組的苜蓿丫紋夜蛾核型多角體病毒；(4)根據(jù)蝕斑克隆方法純化病毒，并感染Sf9-F細胞；通過血清免疫熒光方法鑒定篩選出高表達量的陽性Bac/CY株(CGMCC No. 5267)。
3.含有權利要求1所述的一種PCV2重組苜蓿丫紋夜蛾核型多角體病毒的亞單位疫苗， 其特征在于該亞單位疫苗的主要成分是由Bac/CY株PCV2重組苜蓿丫紋夜蛾核型多角體病毒(CGMCC No. 5267)所表達的豬圓環(huán)病毒2型Cap蛋白。
4.制備權利要求3—種PCV2重組苜蓿丫紋夜蛾核型多角體病毒亞單位疫苗的制備方法，其特征在于，采用懸浮培養(yǎng)細胞技術培養(yǎng)昆蟲細胞Sf9-F，培養(yǎng)環(huán)境為27°C 120r/ min，培養(yǎng)約4 其細胞處在對數(shù)生長期時將接入PCV2重組苜蓿丫紋夜蛾核型多角體病毒 CGMCCNo. 5267，再經過72h培養(yǎng)，收獲感染細胞，病毒效價能達到108_°TCID5(1/ml以上，反復凍融3次，用PBS離心洗滌方法數(shù)次后取上清，上述重組蛋白提純加入常規(guī)疫苗佐劑并經過乳化即成PCV2重組苜蓿丫紋夜蛾核型多角體病毒亞單位疫苗。
5.如權利要求4所述的一種PCV2重組苜蓿丫紋夜蛾核型多角體病毒亞單位疫苗制備方法，其特征在于，可以采用懸浮細胞培養(yǎng)技術培養(yǎng)昆蟲細胞Sf9-F以復制PCV2重組苜蓿丫紋夜蛾核型多角體病毒CGMCC No. 5267，制備PCV2重組苜蓿丫紋夜蛾核型多角體病毒亞單位疫苗。
6.如權利要求4所述一種PCV2重組苜蓿丫紋夜蛾核型多角體病毒亞單位疫苗制備方法，其特征在于，可以采用激流式生物反應器培養(yǎng)昆蟲細胞Sf9-F以復制PCV2重組苜蓿丫紋夜蛾核型多角體病毒CGMCC No. 5267，培養(yǎng)昆蟲細胞至1 ^106/ml，震蕩速度為80r/ min，溶氧飽和度為60%，培養(yǎng)4 6天并收獲，制備PCV2重組苜蓿丫紋夜蛾核型多角體病毒亞單位疫苗。
7.權利1所述的一種PCV2重組苜蓿丫紋夜蛾核型多角體病毒，其特征在于其PCV2重組苜蓿丫紋夜蛾核型多角體病毒CGMCC No. 5267表達的產物可用制備PCV2抗體診斷試劑品.ο
全文摘要
本發(fā)明涉及一種PCV2重組苜蓿丫紋夜蛾核型多角體病毒構建及其亞單位疫苗制備方法。新型重組苜蓿丫紋夜蛾核型多角體病毒構建方法，用以表達豬圓環(huán)病毒2型主要表面抗原進而制備有較好免疫效果的亞單位疫苗。具體說的是，在新型重組苜蓿丫紋夜蛾核型多角體病毒載體表達系統(tǒng)中，定向插入PCV2 ORF2基因，使得該基因能在昆蟲細胞中高效表達且具有良好的免疫原性，制備出相應的亞單位疫苗可以刺激豬產生抵抗豬圓環(huán)病毒2型強毒的攻擊的保護性免疫反應。
文檔編號C12N15/34GK102352347SQ20111031228
公開日2012年2月15日 申請日期2011年10月14日 優(yōu)先權日2011年10月14日
發(fā)明者孟超, 嵇康, 張鵬超, 沈元 申請人:浙江諾倍威生物技術有限公司