專利名稱：一株具有水稻促生功能的根瘤菌及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及具有促進(jìn)植物生長功能的根瘤菌及其用途。
背景技術(shù)：
植物內(nèi)生菌是指能夠定殖在植物各種組織和器官的細(xì)胞間或細(xì)胞內(nèi)、并與植物建立和諧聯(lián)合關(guān)系的一類微生物，包括真菌和細(xì)菌。一部分植物內(nèi)生細(xì)菌可通過分泌生長素，富集根際土壤中的鐵離子和固氮作用等不同機制，對植物發(fā)揮抗生促生作用，為我們提供了一類新的微生物資源。近年來，有關(guān)植物內(nèi)生細(xì)菌的論著數(shù)量日趨增加，隨著植物內(nèi)生細(xì)菌研究的深入，不同學(xué)者從不同植物中不僅分離鑒定出多種細(xì)菌新種，還獲得了一大批具 有防病、促生或固氮等生物學(xué)功能的內(nèi)生細(xì)菌，顯示出了良好的研究和應(yīng)用前景，已成為植物學(xué)、微生物學(xué)、植物保護(hù)學(xué)及植物育種學(xué)等多學(xué)科的研究熱點。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，在自然條件下，根瘤菌作為多種非豆科植物的內(nèi)生菌廣泛存在，如棉花、玉米、小麥、油菜、甘蔗、胡蘿卜、水稻等植物。從不同地區(qū)不同品種的水稻中，已報道的內(nèi)生根瘤菌主要包括如下Rhizobium leguminosarum、R. loti、R. oryza、Bradyrhizobium elkanii、B. japonicum、Azorhizobium cau Linodans^Ensifer (Sinorhizobium)meliloti^Mesorhizobium hukuii 以及 Agrobacterium 屬不同種的菌株等，同時還從在水稻根部分離到可與菜豆結(jié)瘤的Burkholderia cepacia菌株,根瘤菌能夠定殖在植株根、莖、葉組織但并不形成真正的根瘤。目前的許多試驗已經(jīng)證明，根瘤菌對水稻的生長有著促進(jìn)作用。在埃及，將水稻和埃及車軸草進(jìn)行輪作系統(tǒng)已經(jīng)有幾個世紀(jì)的歷史，這種輪作系統(tǒng)好像是R. leguminosarum bv. trifolii的生物庫。從水稻根內(nèi)分離到的R. leguminosarum bv. trifolii接種水稻的田間試驗表明，根瘤菌可以顯著地提高水稻的產(chǎn)量和氮利用率(Nitrogen-use efficiency, NUE),并增加產(chǎn)量的30%或者更高，尤其是施肥量在推薦水平的三分之一的情況下增產(chǎn)更加明顯。然而，進(jìn)一步研究表明，產(chǎn)量的增加并不是因為生物固氮作用，而是歸功于根的結(jié)構(gòu)變化，通過根瘤菌分泌的植物生長素IAA和GA7刺激根的結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，加強了對氮和土壤中其他營養(yǎng)物地攝取，從而促進(jìn)作物的增長，增加作物產(chǎn)量及氮利用率。Biswa等用六種不同的根瘤菌接種水稻也得到上述相似的結(jié)果，可分別提高水稻產(chǎn)量的8% -22%和秸桿產(chǎn)量4% -19%, N、P、K的吸收增長10% -28%, Fe的吸收增長10% -64%。利用N15同位素研究同樣發(fā)現(xiàn)，氮吸收的增加并非是因為生物固氮，而是產(chǎn)生IAA及根的結(jié)構(gòu)變化。Singh等分離自無菌水稻根部、可與扁豆結(jié)瘤固氮的三株菌，其中兩株屬于Burkholderia cepacia,另一株為R. leguminosarumbv. phaseoli，在溫室條件下，可顯著促進(jìn)水稻產(chǎn)量和植物量。還有研究發(fā)現(xiàn)，接種根瘤菌對水稻植株的光合作用產(chǎn)生影響，并提高水稻產(chǎn)量。也有報道根瘤菌在水稻植株中具有固氮功能。在非洲，Chaintreuil等從敏感和萌(Aeschynomene sensitiva,一種豆科植物)生長的濕地中采集的野生稻根部分離到20株慢生根瘤菌菌株，在溫室條件下接種水稻，用乙烯還原法可以測得固氮酶活性，并可以提高水稻產(chǎn)量20%。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供能夠促進(jìn)植物生長，有效固氮的細(xì)菌。本發(fā)明所提供的細(xì)菌為祁陽根瘤菌(Rhizobium qiyangensis) ZYY136,該菌株已于2011年08月19日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCC，地址為北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號)，保藏編號為CGMCC No. 5171。本發(fā)明的另一個目的是提供一種菌劑，它的活性成分為所述的祁陽根瘤菌(Rhizobium qiyangensis)ZYY136CGMCC No. 5171。該菌劑除包含作為活性成分的祁陽根瘤菌(Rhizobium qiyangensis)ZYY136CGMCC No. 5171外，還可包括輔料，如草炭、動物的糞便、各類作物的秸桿、松殼、稻
草、花生皮等。該菌劑可用于促進(jìn)植物生長、用于固氮、用于產(chǎn)生固氮酶、用于產(chǎn)生吲哚乙酸(IAA)等。在本發(fā)明的實施例中所述植物具體為水稻。所述的祁陽根瘤菌(Rhizobiumqiyangensis)ZYY136CGMCC No. 5171 在制備下述I)-4)中任一的菌劑中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍I)用于促進(jìn)植物生長的菌劑；2)用于固氮的菌劑；3)產(chǎn)生固氮酶的菌劑；4)產(chǎn)生吲哚乙酸(IAA)的菌劑。在本發(fā)明的實施例中所述植物具體為水稻。所述的祁陽根瘤菌(Rhizobiumqiyangensis)ZYY136CGMCC No. 5171、或所述菌劑在促進(jìn)植物生長、生產(chǎn)固氮酶、及生產(chǎn)生物有機肥中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。在本發(fā)明的實施例中所述植物具體為水稻。本發(fā)明的再一個目的是提供一種生物有機肥，所述生物有機肥含有所述的祁陽根瘤菌(Rhizobium qiyangensis)ZYY136CGMCC No. 5171、或所述的菌劑。本發(fā)明的又一個目的是提供培養(yǎng)所述祁陽根瘤菌(Rhizobium qiyangensis)ZYY136CGMCC No. 5171的方法，該方法包括將祁陽根瘤菌(Rhizobium qiyangensis)ZYY136CGMCC No. 5171在用于培養(yǎng)根瘤菌的培養(yǎng)基中培養(yǎng)的步驟。本發(fā)明的又一個目的是提供所述菌劑的制備方法，該方法包括如下步驟將所述的祁陽根瘤菌(Rhizobium qiyangensis)ZYY136CGMCC No. 5171作為活性成分,得到所述菌劑。本發(fā)明經(jīng)分泌植物生長素性能及固氮酶活性促生功能測定及大試管和盆栽實驗發(fā)現(xiàn)，祁陽根瘤菌(Rhizobium qiyangensis)ZYY136CGMCC No. 5171對水稻有較強促生作用，體現(xiàn)在以下幾方面每毫升0D600值為I的祁陽根瘤菌(Rhizobium qiyangensis)ZYY136CGMCC No. 5171 發(fā)酵液分泌 IAA 量達(dá) 98. 65 y g ;祁陽根瘤菌(Rhizobiumqiyangensis) ZYY136CGMCC No. 5171 的固氣酶活性為 12. 18nmol mg 1 h 1 ;祁陽根瘤菌(Rhizobium qiyangensis)ZYY136CGMCC No. 5171菌株浸種處理，水稻植株地上部鮮重質(zhì)量相對未接種的陰性對照組增加133. 36% ;干重質(zhì)量相對未接種的陰性對照組增加150% ;植株高度相對未接種的陰性對照組增加30.27%。這表明祁陽根瘤菌(Rhizobiumqiyangensis) ZYY136CGMCC No. 5171能夠分泌植物生長素IAA，又具有較高固氮酶活性，可在其生長過程中為植物體輸送必要的氮素營養(yǎng)，盆栽結(jié)果更加直觀的顯示其對水稻具有較強的促生作用，有利于其在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上的應(yīng)用。


圖I為滅菌土盆栽的水稻幼苗。其中CK表示以無菌水代替祁陽根瘤菌(Rhizobiumqiyangensis)ZYY136CGMCC No. 5171 菌液的陰性對照。保藏說明 菌種名稱祁陽根瘤菌拉丁名(Rhizobiumqiyangensis)菌株編號ZYY136保藏機構(gòu)中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏機構(gòu)簡稱CGMCC地址北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號保藏日期2011年08月19日保藏中心登記入冊編號CGMCC No. 517具體實施例方式本研究采用多相分類方法確定水稻根內(nèi)生細(xì)菌ZYY136菌株的分類地位，對其分泌生長素和固氮酶活性進(jìn)行研究，并利用盆栽試驗等檢測其促生功能。下面結(jié)合具體實施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。 下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。R2A固體培養(yǎng)基的配方0. 5g酵母浸粉,0. 5g胰蛋白胨,0. 5g酪蛋白氨基酸,0. 5g葡萄糖，0.5g可溶性淀粉，0.3g丙酮酸鈉，0.3g K2HPO4jO. 05g MgSO4 7H20，瓊脂20g，去離子水定容至IOOOmL, pH為7. 2 ±0. 2。R2A液體培養(yǎng)基的配方0. 5g酵母浸粉,0. 5g胰蛋白胨,0. 5g酪蛋白氨基酸,0. 5g葡萄糖，0. 5g可溶性淀粉，0. 3g丙酮酸鈉，0. 3g K2HPO4jO. 05g MgSO4 *7H20,0. 2g L-色氨酸，去離子水定容至IOOOmL, pH為7. 2±0. 2。改良YMA固氮培養(yǎng)基的配方10g甘露醇，Ig酵母膏，0. 5g K2HPO4,0. 2gMgS04 7H20，0. Ig NaCl，0. 05g (NH4) 2804，0. 00121g Na2MoO4 2H20，5g 蔗糖，20g 瓊脂，去離子水定容至lOOOmL，pH為6. 8-7. 0。實施例I、內(nèi)生細(xì)菌ZYY136的分離與鑒定一、內(nèi)生細(xì)菌ZYY136的分離取采自中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院祁陽紅壤實驗站(中國湖南省祁陽縣官山坪村)的長期稻-稻-紫云英輪作(高菊生，徐明崗，秦道珠.長期稻-稻-紫云英輪作對水稻生長發(fā)育及產(chǎn)量的影響.湖南農(nóng)業(yè)科學(xué).2008，(6) :25-27.)的健康水稻根部，水稻根表面采用乙醇-次氯酸鈉聯(lián)合滅菌(孫磊，宋未.非培養(yǎng)方法和培養(yǎng)方法對水稻內(nèi)生細(xì)菌和根結(jié)合細(xì)菌的研究.首都師范大學(xué)博士學(xué)位論文.2006.)，按照參考文獻(xiàn)(朱鳳，陳夕軍，童蘊慧，等.水稻內(nèi)生菌的分離及其拮抗性與潛在致病性測定.中國生物防治，2007，23 (I)68-72.)所述梯度稀釋的方法，在R2A固體培養(yǎng)基上涂布分離，28°C培養(yǎng)48h，挑取平板上單菌落劃線純化，得到純化菌株，接斜面置于4°C冰箱內(nèi)保存。將其中一株分離純化所得的內(nèi)生細(xì)菌命名為ZYY136。二、內(nèi)生細(xì)菌ZYY136的鑒定從以下幾個方面鑒定步驟一分離并純化得到的內(nèi)生細(xì)菌ZYY136。I、形態(tài)學(xué)鑒定一方面，將處于對數(shù)生長期，且菌落大小穩(wěn)定，上述步驟一分離并純化得到的內(nèi)生細(xì)菌ZYY136進(jìn)行單菌落狀態(tài)描述，主要包括菌落的大小、顏色、透明度、濕潤度、菌落表面狀態(tài)(是否平坦、突起、褶皺、凹陷等)、菌落邊緣狀態(tài)(是否整齊、不規(guī)則、放射狀等)。另一方面，對處于對數(shù)生長期的所述內(nèi)生細(xì)菌ZYY136，經(jīng)涂片染色后采用光學(xué)顯微鏡觀察菌 體的形態(tài)。分離并純化得到的內(nèi)生細(xì)菌ZYY136的單菌落偏小，圓形，直徑lmm-2mm，呈乳白色，不透明，較濕潤，菌落表面凸起，菌落邊緣整齊。對處于對數(shù)生長期的所述內(nèi)生細(xì)菌ZYY136，經(jīng)涂片染色后采用光學(xué)顯微鏡觀察其菌體為革蘭氏染色陰性，細(xì)桿狀，無芽孢。2、16S rDNA序列同源性分析采用菌落PCR方法擴增步驟一所得的內(nèi)生細(xì)菌ZYY136的16S rDNA片段，相關(guān)試劑由全式金公司提供。具體操作步驟如下先在I. 5mL離心管中加入50 無菌水，用滅菌牙簽挑取少量菌體于水中制成菌懸液，開水煮沸l(wèi)Omin，迅速放入冰中5min, 4 °C 12000r/min離心5min,上清液作為PCR模板。用細(xì)菌16S rDNA通用引物27F(5’ -AGAGITTGATCCTGGCTCAG-3’ )和 1492R(5’ -GGTTACCTTGTTACGACTT-3 ’)對內(nèi)生細(xì)菌ZYY136的16S rDNA部分片段進(jìn)行擴增。反應(yīng)體系(50 y L) :10Xbuffer (5 y L)、dNTP(2. 5m mol/L)4u L,引物 27F(10m mol/L)2u L,引物 1492R(10m mol/L)2u L,Taq酶(5U/L) 0. 25 ii L、5 ii L上清液作為模板、ddH20補足至50 ii L。PCR反應(yīng)程序94 °C 5min ；94 °C lmin，52 °C lmin，72 °C lmin，30 個循環(huán)；72 °C IOmin0 將擴增片段克隆到載體PEASY-Tl (天根公司)，用藍(lán)白斑篩選的方法選取陽性克隆，委托北京寶瑞通公司以17和SP6作為測序引物雙向測序。相關(guān)序列通過Eztaxon server
2.I (http ://147. 47. 212. 35:8080/)進(jìn)行序列分析。通過16S rRNA基因片段進(jìn)行擴增并克隆測序，獲得長度為1442bp片段，其序列詳見序列表中序列I。將該基因序列在Eztaxon網(wǎng)站進(jìn)行相似性比對，結(jié)果表明菌株ZYY136的16s rDNA序列與Rhizobium alkalisoli的相似性最高為96. 174%,低于97% ,可初步確定該菌株為Rhizobium屬中的新種。3、C/N源利用的測定利用C/N源培養(yǎng)基測定其對唯一碳源和唯一氮源的利用。測定結(jié)果見表I。其碳源利用結(jié)果表明ZYY136可以較好的利用D-阿拉伯糖、果糖、D(+)_半乳糖、肌醇、乳糖、蘋果酸鈣、麥芽糖、松三糖、蜜二糖、丙酮酸鹽、鼠李糖、乙酸鈉、琥珀酸鈉、蔗糖、酒石酸鈉、海藻糖、木糖、L-甲硫氨酸為唯一碳源提供能量；對糊精、D-甘露醇、D-葡萄糖酸鈉、D-山梨糖醇、DL-天冬氨酸、L-蘇氨酸利用能力很弱；不能利用葡萄糖、菊糖、淀粉、甘氨酸。氮源利用結(jié)果表明ZYY136可以較好利用L-精氨酸、L-胱氨酸、D-谷氨酸、L-賴氨酸、L-苯丙氨酸、甘氨酸、L-甲硫氨酸為唯一氮源提供能量；對DL-丙氨酸、D-蘇氨酸、D-纈氨酸利用能力很弱、不能利用L-蘇氨酸。表I ZYY136菌株及近緣菌碳源、氮源利用比較
權(quán)利要求
1.祁陽根瘤菌(Rhizobiumqiyangensis) ZYY136,它在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心的保藏編號為CGMCC No. 5171。
2.一種菌劑，它的活性成分為權(quán)利要求I所述的祁陽根瘤菌(Rhizobiumqiyangensis)ZYY136CGMCC No. 5171。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的菌劑，其特征在于所述菌劑為下述I)-4)中任一的菌劑 1)用于促進(jìn)植物生長的菌劑； 2)用于固氮的菌劑； 3)產(chǎn)生固氮酶的菌劑； 4)產(chǎn)生吲哚乙酸的菌劑。
4.權(quán)利要求I 所述的祁陽根瘤菌(Rhizobium qiyangensis)ZYY136CGMCC No. 5171 在制備下述I)-4)中任一的菌劑中的應(yīng)用 1)用于促進(jìn)植物生長的菌劑； 2)用于固氮的菌劑； 3)產(chǎn)生固氮酶的菌劑； 4)產(chǎn)生吲哚乙酸的菌劑。
5.權(quán)利要求I 所述的祁陽根瘤菌(Rhizobium qiyangensis)ZYY136CGMCCNo. 5171、或權(quán)利要求2或3所述菌劑在促進(jìn)植物生長中的應(yīng)用；或 權(quán)利要求I所述的祁陽根瘤菌(Rhizobium qiyangensis)ZYY136CGMCC No. 5171、或權(quán)利要求2或3所述菌劑在生產(chǎn)固氮酶中應(yīng)用；或 權(quán)利要求I所述的祁陽根瘤菌(Rhizobium qiyangensis)ZYY136CGMCC No. 5171、或權(quán)利要求2或3所述菌劑在生產(chǎn)生物有機肥中應(yīng)用。
6.根據(jù)權(quán)利要求3所述菌劑，或權(quán)利要求4或5所述應(yīng)用，其特征在于所述植物為水稻。
7.含有權(quán)利要求I所述的祁陽根瘤菌(Rhizobiumqiyangensis) ZYY136CGMCCNo. 5171、或權(quán)利要求2或3所述菌劑的生物有機肥。
8.培養(yǎng)權(quán)利要求I 所述的祁陽根瘤菌(Rhizobium qiyangensis) ZYY136CGMCCNo. 5171的方法，包括將祁陽根瘤菌(Rhizobium qiyangensis)ZYY136CGMCC No. 5171在用于培養(yǎng)根瘤菌的培養(yǎng)基中培養(yǎng)的步驟。
9.權(quán)利要求2或3所述菌劑的制備方法，包括如下步驟將權(quán)利要求I所述的祁陽根瘤菌(Rhizobium qiyangensis)ZYY136CGMCC No. 5171作為活性成分,得到所述菌劑。
全文摘要
本發(fā)明公開了具有促進(jìn)植物生長功能的根瘤菌及其用途。該根瘤菌是祁陽根瘤菌(Rhizobium qiyangensis)ZYY136，在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心的保藏號為CGMCC No.5171。本發(fā)明所提供的祁陽根瘤菌(Rhizobium qiyangensis)ZYY136 CGMCC No.5171分泌IAA的能力可達(dá)到98.65μg每毫升OD600值為1的祁陽根瘤菌(Rhizobium qiyangensis)ZYY136 CGMCC No.5171發(fā)酵液；固氮酶活性為12.18nmol·mg-1·h-1；浸種處理后水稻植株其地上部鮮重質(zhì)量相對未接種的陰性對照組增加133.36％；干重質(zhì)量相對未接種陰性對照組增加150％；植株高度相對未接種陰性對照組增加30.27％。這表明祁陽根瘤菌(Rhizobium qiyangensis)ZYY136 CGMCC No.5171菌株對水稻具有較強的促生作用，有利于其在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上的應(yīng)用。
文檔編號C12N1/20GK102643761SQ20111030139
公開日2012年8月22日 申請日期2011年10月8日 優(yōu)先權(quán)日2011年10月8日
發(fā)明者姜瑞波, 張曉霞, 曹衛(wèi)東, 曹艷花, 馬曉彤, 高菊生 申請人:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)資源與農(nóng)業(yè)區(qū)劃研究所