專利名稱：檢測THRA基因三種mRNA亞型的引物及所用試劑盒的制作方法
檢測THRA基因三種mRNA亞型的引物及所用試劑盒技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明涉及生物實驗技術(shù)和醫(yī)學(xué)診斷技術(shù)領(lǐng)域，特別是涉及THRA基因檢測領(lǐng)域的用于檢測THRA基因三種mRNA亞型的引物及所用試劑盒。
背景技術(shù)：
THRA 基因(thyr ·oid hormone receptor α )即甲狀腺激素受:體 α,于 I988 年由 Debuire B.克隆成功。THRA基因由457個腺嘌呤、635個胞嘧啶、637個鳥嘌呤、83個胸腺嘧啶組成，位于人類染色體17qll. 2位置。THRA基因編碼的蛋白是甲狀腺激素受體，它是甲狀腺激素的幾個受體之一，能夠調(diào)節(jié)甲狀腺激素的生物活性。近年來研究發(fā)現(xiàn)，THRA基因與多種疾病相關(guān)聯(lián)。2011年研究發(fā)現(xiàn)，THRA基因與乳腺癌相關(guān)。甲狀腺受體基因的突變和基因表達(dá)的改變會導(dǎo)致癌癥的發(fā)生，Guigon等研究發(fā)現(xiàn)，新型的非基因組甲狀腺激素受體基因的突變導(dǎo)致甲狀腺癌變。2011年，Goumidi L等人研究了 THRA基因多態(tài)性與之間的關(guān)聯(lián)，它編碼T3核受體TRa I。SNP標(biāo)記rs939348 TT基因型對阿爾茨海默氏病(AD)存在高風(fēng)險。甲狀腺激素對聽力的發(fā)展有著至關(guān)重要的作用。2001年，Rusch等人研究發(fā)現(xiàn)， 發(fā)病早期甲狀腺功能減退引起耳聾，說明甲狀腺激素對聽力的發(fā)展至關(guān)重要。同年，Lily 等人發(fā)現(xiàn)，甲狀腺激素受體基因的突變抑制了耳聾和甲狀腺發(fā)育不全。1998年，Williams 研究發(fā)現(xiàn)等THRA基因在視網(wǎng)膜發(fā)育過程中表達(dá)，影響視網(wǎng)膜細(xì)胞的生長和增殖。1997年， Sourvinos G等人檢測I 42個成對乳腺癌外周血DNA樣本，發(fā)現(xiàn)24個腫瘤(57%)表現(xiàn)出遺傳變異，而標(biāo)記基因THRAl是抑癌基因的一個有力候選基因。因此，對THRA基因的分析和篩查有助于多種疾病的診斷和檢查。
PCR (polymerase chain reaction,聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))因其靈敏度高,特異性強， 檢測簡便、快速，已成為一種成熟技術(shù)成為分子生物學(xué)研究的關(guān)鍵技術(shù)。該技術(shù)廣泛應(yīng)用于生物科學(xué)的各領(lǐng)域?qū)嶒炛小Ｔ赑CR實驗中，要擴增模板DNA，首先要設(shè)計引物，引物是決定 PCR擴增片段長度、位置和結(jié)果的關(guān)鍵，引物與模板的結(jié)合及引物鏈的延伸都遵循堿基配對原則的。PCR擴增完成之后，再對PCR產(chǎn)物進行進一步的分析。
THRA的外顯子有三種形式，以往針對THRA基因的檢查需要分別對三種外顯子進行獨立的實驗過程。容易交叉重復(fù)干擾，實驗過程相對復(fù)雜。
PCR過程由高溫變性、低溫復(fù)性和一定溫度下延伸三個步驟循環(huán)構(gòu)成。所以在PCR 實驗中，對溫度的控制非常重要。
在常規(guī)的PCR實驗中，通常是將DNA樣本、引物等試劑根據(jù)要求放置于普通384孔或96孔塑料基板內(nèi)，在基板的表層附上一層透明的塑料膜，以封閉溶液體系。在PCR實驗平臺的往復(fù)溫度變化后，通過普通光源或激光透過塑料膜進行分析。
在PCR實驗中一般要求DNA樣本溫度隨著PCR的溫度同時變化，PCR反應(yīng)中，從高溫到低溫或從低溫到高溫的溫度變化靈敏性越高越好。在普通塑料基板上，由于塑料本身在溫度傳遞上有一定的延遲，而且也會吸收一定的熱能，導(dǎo)致溶液體系的溫度與理想溫度有一定誤差。另外在通過光源分析時，由于基板的變形及塑料膜本身透光率的問題，導(dǎo)致反應(yīng)結(jié)果出現(xiàn)一定的系統(tǒng)誤差。并且當(dāng)實驗的樣本量不是很大的情況下，在普通的384孔或 96孔板的基板上，一旦附上塑料膜，對區(qū)別已加樣的孔和沒加樣的孔需要仔細(xì)辨認(rèn)，加大了實驗者的工作量和工作強度。發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供可以在一次檢測實驗過程中對THRA基因三種亞型進行分別獨立擴增的引物及用于THRA基因三種亞型檢測的試劑盒，該引物大大地提高實驗效率，避免交叉重復(fù)干擾，減少工作量，縮短檢測實驗的時間過程；該試劑盒能增加溶液體系的溫度敏感性和光透率，實現(xiàn)溶液體系的溫度隨PCR儀器的溫度變化同步迅速變化。
為達(dá)到上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案是一種檢測THRA基因三種mRNA亞型的引物，包括共用引物和THRA-1、THRA-2、THRA_3共 4條引物。
其中，所述共用引物的序列是CTTCGAGCACTACGTCAACCA。
其中，所述THRA-1 引物的序列是 GCTACAGAATCGAACTCTGCACT。
其中，所述THRA-2 引物的序列是 GACCTGCGGACCCTTCAT。
其中，所述THRA-3 引物的序列是 CGATCATGCGGAGGTCAGT。
本發(fā)明還提供一種用于檢測THRA基因三種mRNA亞型的試劑盒，所述試劑盒包括包括基板和設(shè)于所述基板上面的表面覆膜，所述表面覆膜上設(shè)有有穴坑，所述穴坑內(nèi)設(shè)有反應(yīng)體系,所述反應(yīng)體系含有根據(jù)權(quán)利要求1至5任一所述的用于檢測THRA基因三種mRNA 亞型的引物。
優(yōu)選的，所述穴坑設(shè)有凸沿。
優(yōu)選的，所述凸沿與所述表面覆膜一體成型。
優(yōu)選的，所述基板采用親水性、耐腐蝕、高溫下不易變形的透明材料。
優(yōu)選的，所述基板采用硼硅酸鹽超薄玻璃材料。
優(yōu)選的，所述表面覆膜采用耐高溫、變形率小的材料。
優(yōu)選的，所述表面覆膜采用有機硅塑料為材料。
優(yōu)選的，所述表面覆膜與所述基板接觸的一面設(shè)有熱熔粘合劑。
優(yōu)選的，所述反應(yīng)體系上面設(shè)有用于封閉所述反應(yīng)體系的封閉層。
優(yōu)選的，所述封閉層為石蠟。
本發(fā)明的技術(shù)方案中，共用引物的堿基序列是CTTCGAGCACTACGTCAACCA。 THRA-1引物的堿基序列是GCTACAGAATCGAACTCTGCACT。 THRA-2引物的堿基序列是 GACCTGCGGACCCTTCAT ο THRA-3 引物的堿基序列是 CGATCATGCGGAGGTCAGT。
THRA基因有三種亞型，這三種亞型非常相似，其幾個外顯子分別有三種形式。
第一種為CTGCCTTGCGAAGACCAGATCATCCTCCTGAAGGGGTGCTGCATGGAGATCATGTCCCTGCGGGCGGCTGTCCGCTACGACCCTGAGAGCGACACCCTGACGCTGAGTGGGGAGATGGCTGTCAAGCGGGAGCAGCTCAAGAATGGCGGCCTGGGCGTAGTCTCCGACGCCATCTTTGAACTGGGCAAGTCACTCTCTGCCTTTAACCTGGATGACACGGAAGTGGCTCTGCTGCAGGCTGTGCTGCTAATGTCAACAGACCGCTCGGGCCTGCTGTGTGTGGACAAGATCGAGAAGAGTCAGGAGGCGTACCTGCTGGCGTTCGAGCACTACGTCAACCACCGCAAACACAACATTCCGCACTTCTGGCCCAAGCTGCTGATGAAGGAGAGAGAAGTGCAGAGTTCGATTCTGTACAAGGGGGCAGCGGCAGAAGGCCGGCCGGGCGGGTCACTGGGCGTCCACCCGGAAGGACAGCAGCTTCTCGGAATGCATGTTGTTCAGGGTCCGCAGGTCCGGCAGCTTGAGCAGCAGCTTGGTGAAGCGGGAAGTCTCCAAGGGCCGGTTCTTCAGCACCAGAGCCCGAAGAGCCCGCAGCAGCGTCTCCTGGAGCTGCTCCACCGAAGCGGAATTCTCCATGCCCGAGCGGTCTGTGGGGAAGACGACAGCAGTGAGGCGGACTCCCCGAGCTCCTCTGAGGAGGAACCGGAGGTCTGCGAGGACCTGGCAGGCAATGCAGCCTCTCCCTGAAGCCCCCCAGAAGGCCGATGGGGAAGGAGAAGGAGTGCCATACCTTCTCCCAGGCCTCTGCCCCAAGAGCAGGAGGTGCCTGAAAGCTGGGAGCGTGGGCTCAGCAGGGCTGGTCACCTCCCATCCCGTAAGACCACCTTCCCTTCCTCAGCAGGCCAAACATGGCCAGACTCCCTTGCTTTTTGCTGTGTAGTTCCCTCTGCCTGGGATGCCCTTCCCCCTTTCTCTGCCTGGCAACATCTTACTTGTCCTTTGAGGCCCCAACTCAAGTGTCACCTCCTTCCCCAGCTCCCCCAGGCAGAAATAGTTGTCTGTGCTTCCTTGGTTCATGCTTCTACTGTGACACTTATCTCACTGTTTTATAATTAGTCGGGCATGAGTCTGTTTCCCAAGCTAGACTGTGTCTGAATCATGTCTGTATCCCCAGTGCCCGGTGCAGGGCCTGGCATAGAGTAGGTACTCCATAAAAGGTGTGTTGAATTGAA第二種為CTGCCTTGCGAAGACCAGATCATCCTCCTGAAGGGGTGCTGCATGGAGATCATGTCCCTGCGGGCGGCTGTC CGCTACGACCCTGAGAGCGACACCCTGACGCTGAGTGGGGAGATGGCTGTCAAGCGGGAGCAGCTCAAGAATGGCGG CCTGGGCGTAGTCTCCGACGCCATCTTTGAACTGGGCAAGTCACTCTCTGCCTTTAACCTGGATGACACGGAAGTGG CTCTGCTGCAGGCTGTGCTGCTAATGTCAACAGACCGCTCGGGCCTGCTGTGTGTGGACAAGATCGAGAAGAGTCAG GAGGCGTACCTGCTGGCGTTCGAGCACTACGTCAACCACCGCAAACACAACATTCCGCACTTCTGGCCCAAGCTGCT GATGAAGGGTCCGCAGGTCCGGCAGCTTGAGCAGCAGCTTGGTGAAGCGGGAAGTCTCCAAGGGCCGGTTCTTCAGC ACCAGAGCCCGAAGAGCCCGCAGCAGCGTCTCCTGGAGCTGCTCCACCGAAGCGGAATTCTCCATGCCCGAGCGGTC TGTGGGGAAGACGACAGCAGTGAGGCGGACTCCCCGAGCTCCTCTGAGGAGGAACCGGAGGTCTGCGAGGACCTGGC AGGCAATGCAGCCTCTCCCTGAAGCCCCCCAGAAGGCCGATGGGGAAGGAGAAGGAGTGCCATACCTTCTCCCAGGC CTCTGCCCCAAGAGCAGGAGGTGCCTGAAAGCTGGGAGCGTGGGCTCAGCAGGGCTGGTCACCTCCCATCCCGTAAG ACCACCTTCCCTTCCTCAGCAGGCCAAACATGGCCAGACTCCCTTGCTTTTTGCTGTGTAGTTCCCTCTGCCTGGGA TGCCCTTCCCCCTTTCTCTGCCTGGCAACATCTTACTTGTCCTTTGAGGCCCCAACTCAAGTGTCACCTCCTTCCCC AGCTCCCCCAGGCAGAAATAGTTGTCTGTGCTTCCTTGGTTCATGCTTCTACTGTGACACTTATCTCACTGTTTTAT AATTAGTCGGGCATGAGTCTGTTTCCCAAGCTAGACTGTGTCTGAATCATGTCTGTATCCCCAGTGCCCGGTGCAGG GCCTGGCATAGAGTAGGTACTCCATAAAAGGTGTGTTGAATTGAA 第二種為CTGCCTTGCGAAGACCAGATCATCCTCCTGAAGGGGTGCTGCATGGAGATCATGTCCCTGCGGGCGGCTGTCCGCTACGACCCTGAGAGCGACACCCTGACGCTGAGTGGGGAGATGGCTGTCAAGCGGGAGCAGCTCAAGAATGGCGGCCTGGGCGTAGTCTCCGACGCCATCTTTGAACTGGGCAAGTCACTCTCTGCCTTTAACCTGGATGACACGGAAGTGGCTCTGCTGCAGGCTGTGCTGCTAATGTCAACAGACCGCTCGGGCCTGCTGTGTGTGGACAAGATCGAGAAGAGTCAGGAGGCGTACCTGCTGGCGTTCGAGCACTACGTCAACCACCGCAAACACAACATTCCGCACTTCTGGCCCAAGCTGCTGATGAAGGTGACTGACCTCCGCATGATCGGGGCCTGCCACGCCAGCCGCTTCCTCCACATGAAAGTCGAGTGCCCCACCGAACTCTTCCCCCCACTCTTCCTCGAGGTCTTTGAGGATCAGGAAGTCTAAAGCCTCAGGCGGCCAGAGGGTGTGCGGAGCTGGTGGGGAGGAGCCTGGAGAGAAGGGGCAGAGCTGGGGGCTGAGGGAGACCCCCCCACACCCCTTCTCTCCTTCCTCTCGTCCTTGGATAGATTCAGCTCCCACACACACACCCGCACTGCCCAGGTCCCTCCTCAGACCTCCAGCCCTGGGACAGGGCAAACAACTGAACTTGCTATGGAAAGGACAGTGTGGGAGGCTGGGGGAGCTGTGTCCTGCAGTTCCCAGGACCCCATCCTCTCAGAAGGTAGGGGAAGGGCGGGAGGATTGAGAAGGGACAAGCCACCTTGACCGTAGGGGAAGGAGGAATGTGGGCTGGGGGAAGATGCCCTCAACTCACCCCCTACACACACATGAGAGAGAGCCCCCACCCAGTTCCTTGGCCTAGGTCTCCCCTCCAGGCTGAGGGCCTCTCTACTTCCCCAGATGCCTGGGTGCAAAGAACGGCTTGGCTTGGCTCCTCCTCTGGAGGTTAAAATTTATAGTCATTCTAACTGCACTTTGGAAACCAAGCAAGGGGAGAAGACAAATGAAGAAAAACTAGACAGAGA這三種外顯子都有相同的部分
權(quán)利要求
1.一種檢測THRA基因三種mRNA亞型的引物，其特征在于，包括共用引物和THRA-1、THRA-2、THRA-3 共 4 條引物。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測THRA基因三種mRNA亞型的引物，其特征在于，所述共用引物的序列是 CTTCGAGCACTACGTCAACCA。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測THRA基因三種mRNA亞型的引物，其特征在于，所述THRA-1 引物的序列是 GCTACAGAATCGAACTCTGCACT。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測THRA基因三種mRNA亞型的引物，其特征在于，所述THRA-2 引物的序列是 GACCTGCGGACCCTTCAT。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測THRA基因三種mRNA亞型的引物，其特征在于，所述THRA-3 引物的序列是 CGATCATGCGGAGGTCAGT。
6.一種用于檢測THRA基因三種mRNA亞型的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括包括基板和設(shè)于所述基板上面的表面覆膜，所述表面覆膜上設(shè)有有穴坑，所述穴坑內(nèi)設(shè)有反應(yīng)體系，所述反應(yīng)體系含有根據(jù)權(quán)利要求1至5任一所述的用于檢測THRA基因三種mRNA亞型的引物。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的用于檢測THRA基因三種mRNA亞型的試劑盒，其特征在于，所述穴坑設(shè)有凸沿。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的用于檢測THRA基因三種mRNA亞型的試劑盒，其特征在于，所述凸沿與所述表面覆膜一體成型。
9.根據(jù)權(quán)利要求6到8任一所述的用于檢測THRA基因三種mRNA亞型的試劑盒，其特征在于，所述基板采用親水性、耐腐蝕、高溫下不易變形的透明材料。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的用于檢測THRA基因三種mRNA亞型的試劑盒，其特征在于，所述基板采用硼硅酸鹽超薄玻璃材料。
11.根據(jù)權(quán)利要求6到8任一所述的用于檢測THRA基因三種mRNA亞型的試劑盒，其特征在于，所述表面覆膜采用耐高溫、變形率小的材料。
12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的用于檢測THRA基因三種mRNA亞型的試劑盒，其特征在于，所述表面覆膜采用有機硅塑料為材料。
13.根據(jù)權(quán)利要求6到8任一所述的用于檢測THRA基因三種mRNA亞型的試劑盒，其特征在于，所述表面覆膜與所述基板接觸的一面設(shè)有熱熔粘合劑。
14.根據(jù)權(quán)利要求6到8任一所述的用于檢測THRA基因三種mRNA亞型的試劑盒，其特征在于，所述反應(yīng)體系上面設(shè)有用于封閉所述反應(yīng)體系的封閉層。
15.根據(jù)權(quán)利要求9所述的用于檢測THRA基因三種mRNA亞型的試劑盒，其特征在于，所述封閉層為石蠟。
全文摘要
本發(fā)明公開了檢測THRA基因三種mRNA亞型的引物及用于檢測檢測THRA基因三種mRNA亞型的試劑盒。包括THRA共用引物和THRA-1、THRA-2、THRA-3共4條引物，通過PCR擴增和凝膠電泳，能夠?qū)崿F(xiàn)在一次檢測實驗過程中對THRA基因的三種亞型mRNA基因進行分別獨立擴增，提高了實驗效率，避免交叉重復(fù)干擾，減少工作量，縮短檢測實驗的時間過程，也降低了實驗成本。還包括一種試劑盒，有基板和表面覆膜，能增加溶液體系的溫度敏感性和光透率，實現(xiàn)溶液體系的溫度隨PCR儀器的溫度變化同步迅速變化。
文檔編號C12Q1/68GK103014140SQ20111028591
公開日2013年4月3日 申請日期2011年9月23日 優(yōu)先權(quán)日2011年9月23日
發(fā)明者邵敏華, 黃迅威, 沈玲宇 申請人:上海熙洛生物技術(shù)有限公司