專(zhuān)利名稱：一種檢測(cè)單核細(xì)胞增生李斯特菌的熒光定量pcr試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域中細(xì)菌的分子生物學(xué)檢測(cè)試劑盒，特別是涉及檢測(cè)單核細(xì)胞增生李斯特菌的熒光定量PCR試劑盒及其應(yīng)用
背景技術(shù)：
單核細(xì)胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes,LM)是一種重要的人畜共患病致病菌，在4°C能生長(zhǎng)繁殖，能引起人和動(dòng)物腦膜炎、敗血癥及孕婦流產(chǎn)等，死亡率極高，可達(dá)30% 70%。在公共衛(wèi)生和食品衛(wèi)生安全中越來(lái)越受到重視，已成為國(guó)家食源性疾病檢測(cè)的菌種之一。長(zhǎng)期以來(lái)對(duì)LM的檢測(cè)方法主要是傳統(tǒng)的國(guó)標(biāo)培養(yǎng)法(GB4789. 30-2010)，采用以表型特征為特點(diǎn)的生化反應(yīng)和血清反應(yīng)對(duì)LM進(jìn)行鑒定，但鑒定能力有限，常因表型特征的變異給鑒定帶來(lái)困難。對(duì)于這樣依靠表型特征不能準(zhǔn)確鑒定的LM，采用分子生物學(xué)的檢測(cè)方法常能得到準(zhǔn)確的鑒定結(jié)果，尤其是抗污染能力強(qiáng)、特異性高、靈敏度好、容易重復(fù)的熒光定量PCR檢測(cè)方法。

發(fā)明內(nèi)容
為解決背景技術(shù)中的檢測(cè)單核細(xì)胞增生李斯特菌的問(wèn)題，本發(fā)明一方面提供了一種檢測(cè)單核細(xì)胞增生李斯特菌的熒光定量PCR試劑盒，試劑盒包括一對(duì)引物、一個(gè)探針以及陽(yáng)性定量模板，所述引物、探針的序列為上游引物Hl 5，-gattcccattatgaacgaag-3’ (SEQ ID No. I),下游引物H2 5，-tcagttccttacagatgag-3，(SEQ ID No. 2),突光探針Pl 5，-FAM-acagccagtactagttcatcgca-TAMRA-3’ (SEQ ID No. 3),其中FAM為5’端的熒光基團(tuán)，TAMRA為3’端的熒光淬滅基團(tuán)，所述陽(yáng)性定量模板是含有序列為catggcaccaccagcatctataggagcactcgccgccacat catcgaaaagaaacacgcggatg (SEQ ID No. 4)的 DNA 片段的 pMD18_T 重組質(zhì)粒。本發(fā)明提供的試劑盒可以進(jìn)一步包括熒光定量聚合酶和參比染料，如Takara公司的 Premix Ex Taq 聚合酶和 ROX Reference Dye II 染料。本發(fā)明還提供了該試劑盒在檢測(cè)臨床樣品里存在的單核細(xì)胞增生李斯特菌中的應(yīng)用。本發(fā)明提供的試劑盒的使用方法為(I)反應(yīng)體系(25 μ L)為模板DNA 2. O μ L、10 μ M 引物 I. O μ L、3 μ M探針 I. O μ L、 Premix Ex Taq (2 X)熒光定量聚合酶 12. 5 μ L、ROX Reference Dye II(50X)染料
0.5 μ L、無(wú)菌水 8 μ L0反應(yīng)程序?yàn)?5°C預(yù)變性30秒，隨后進(jìn)行40個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)程序?yàn)?5°C 5秒、 60 0C 20 秒。(2)定量標(biāo)準(zhǔn)曲線制備將定量陽(yáng)性模板按10倍稀釋法稀釋成101° IO4拷貝/ ml的7個(gè)濃度梯度，按照上述反應(yīng)體系和反應(yīng)程序進(jìn)行Real-time PCR,反應(yīng)結(jié)束后計(jì)算機(jī)自動(dòng)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線Y = 3乂+13、1 24€6其中乂表示起始模板拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)，￥表示0(0值。(3)樣品檢測(cè)從待測(cè)樣品中DNA，隨后按照步驟(I)反應(yīng)體系和反應(yīng)程序進(jìn)行擴(kuò)增即可。(4)結(jié)果判斷設(shè)置陰性對(duì)照和空白對(duì)照，待測(cè)樣品C(t)值小于35. O為陽(yáng)性，大于35. O時(shí)為陰性。


圖I是利用陽(yáng)性質(zhì)粒制作標(biāo)準(zhǔn)曲線時(shí)，不同稀釋度的質(zhì)粒熒光定量PCR擴(kuò)增曲線， 從左至右各條曲線代表10' ΙΟ9、108、IO7, ΙΟ6、105、IO4個(gè)/ml拷貝數(shù)質(zhì)粒擴(kuò)增曲線。圖2是熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線結(jié)果，標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程Y = -3. 4101ogX+45. 10，相關(guān)系數(shù)R2 = O. 999，擴(kuò)增效率Eff = 96. 5%0圖3是靈敏度檢測(cè)結(jié)果，不同質(zhì)粒稀釋度的結(jié)果，從左至右各條曲線代表104、103、 IO2UO1U 個(gè)/μ I 質(zhì)粒。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例I :本發(fā)明所述的試劑盒的制備檢測(cè)單核細(xì)胞增生李斯特菌的熒光定量PCR試劑盒的組成包括上游引物Hl 5，-gattcccattatgaacgaag-3’ (SEQ ID No. I),下游引物H2 5，-tcagttccttacagatgag-3，(SEQ ID No. 2),突光探針Pl 5，-FAM-acagccagtactagttcatcgca-TAMRA-3’ (SEQ ID No. 3)陽(yáng)性定量模板含有序列為catggcaccaccagcatctataggagcactcgccgccacatcatc gaaaagaaacacgcggatg (SEQ ID No. 4)的 DNA 片段的 pMD18_T 重組質(zhì)粒。試劑盒還可以進(jìn)一步包括熒光定量聚合酶和參比染料。其中，引物、探針是在Genbank中查找多種單核細(xì)胞增生李斯特菌的hly基因并分析其保守區(qū)段的基礎(chǔ)上，使用Bacon Designer 5. O軟件設(shè)計(jì)的，并按照本領(lǐng)域常規(guī)的方法合成。陽(yáng)性定量模板采用本領(lǐng)域常規(guī)的方法制備提取單核細(xì)胞增生李斯特菌(ATCC 54001購(gòu)自ATCODNA ;使用序列為SEQ ID No. 1、2的引物擴(kuò)增出序列為SEQ ID No. 4的片段；并通過(guò)連接、轉(zhuǎn)化將該片段插入PMD18-T載體；最后進(jìn)行鑒定。本申請(qǐng)實(shí)施例中實(shí)際使用的熒光定量聚合酶Premix Ex Taq 和參比染料 ROXReference Dye II 均購(gòu)自 Takara 公司。實(shí)施例2使用試劑盒檢測(cè)單核細(xì)胞增生李斯特菌I.待測(cè)樣品的處理從待測(cè)樣品提取DNA。本申請(qǐng)實(shí)施例中實(shí)際使用的DNA提取試劑盒購(gòu)自Takara公司。2.熒光定量PCR過(guò)程反應(yīng)體系(25μ L)為模板 DNA 2. O μ L、10 μ M 引物 I. O μ L、3 μ M 探針 I. O μ L、 Premix Ex Taq (2 X)熒光定量聚合酶 12. 5 μ L、ROX Reference Dye II(50X)染料
0.5 μ L、無(wú)菌水 8 μ L0
反應(yīng)程序?yàn)?5°C預(yù)變性30秒，隨后進(jìn)行40個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)程序?yàn)?5°C 5秒、 60 0C 20 秒。本申請(qǐng)實(shí)施例中實(shí)際使用Roche公司的480型熒光定量PCR儀記錄結(jié)果。3.標(biāo)準(zhǔn)曲線制備將定量陽(yáng)性模板線性化后10倍倍比稀釋?zhuān)来螐?01°稀釋到IO4拷貝/ml。各取2μ I按照上面的步驟進(jìn)行熒光定量PCR，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果見(jiàn)

圖I和圖 2。熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)系數(shù)R2 = O. 999，擴(kuò)增效率Eff = 96. 5 %，回歸方程Y =-3. 4101ogX+45. 10。從圖2可以看出，用陽(yáng)性質(zhì)粒所作的標(biāo)準(zhǔn)曲線的C(t)值與初始濃度有較好的線性關(guān)系。4.特異性驗(yàn)證用建立的熒光定量RT-PCR方法對(duì)單核細(xì)胞增生李斯特菌(ATCC 54001購(gòu)自 ATCC)、格氏李斯特菌(ATCC 700545購(gòu)自ATCC)、綿羊李斯特菌(ATCC 19119購(gòu)自ATCC)、腸炎沙門(mén)氏菌(本實(shí)驗(yàn)室保存)、大腸埃希氏菌(本實(shí)驗(yàn)室保存)、空白對(duì)照進(jìn)行檢測(cè)。單核細(xì)胞增生李斯特菌C(t)值為15. 28，而其他四種菌的樣品檢測(cè)結(jié)果均為陰性，表明建立的熒光定量RT-PCR方法不會(huì)受到這些類(lèi)似菌株的干擾(特異性驗(yàn)證結(jié)果未顯示)。5.靈敏度測(cè)試陽(yáng)性質(zhì)粒從I. OX IO5拷貝/ μ LlO倍倍比稀釋?zhuān)瑹晒舛縋CR檢測(cè)。顯示于圖3的結(jié)果表明本發(fā)明提供的試劑盒靈敏度可達(dá)I拷貝/y L。上述實(shí)施例的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，本發(fā)明提供的檢測(cè)單核細(xì)胞增生李斯特菌的熒光定量PCR試劑盒特異性強(qiáng)、靈敏度高、組成簡(jiǎn)單、操作方便，可以實(shí)現(xiàn)對(duì)單核細(xì)胞增生李斯特菌的快速檢測(cè)。
權(quán)利要求
1.一種檢測(cè)單核細(xì)胞增生李斯特菌的熒光定量PCR試劑盒，包括一對(duì)引物、一個(gè)探針以及陽(yáng)性定量模板，所述引物、探針的序列為上游引物 Hl 5，-gattcccattatgaacgaag-3’ (SEQ ID No. I),下游引物 H2 5，-tcagttccttacagatgag-3，(SEQ ID No. 2),突光探針 Pl 5，-FAM-acagccagtactagttcatcgca-TAMRA-3’ (SEQ ID No. 3),其中FAM為5’端的熒光基團(tuán)，TAMRA為3’端的熒光淬滅基團(tuán)，所述陽(yáng)性定量模板是含有序列為 catggcaccaccagcatctataggagcactcgccgccacatcatcgaaaagaaacacgcggatg (SEQ ID No. 4)的DNA片段的pMD18-T重組質(zhì)粒。
2.權(quán)利要求I所述的試劑盒，其進(jìn)一步包括熒光定量聚合酶和參比染料。
3.權(quán)利要求2所述的試劑盒在檢測(cè)臨床樣品里存在的單核細(xì)胞增生李斯特菌中的應(yīng)
全文摘要
本發(fā)明提供了一種檢測(cè)單核細(xì)胞增生李斯特菌的熒光定量PCR試劑盒，試劑盒包括一對(duì)引物、一個(gè)探針以及陽(yáng)性定量模板，引物、探針的序列分別為SEQ ID No.1、2、3，陽(yáng)性定量模板是含有序列為SEQ ID No.4的DNA片段的pMD18-T重組質(zhì)粒；試劑盒可以進(jìn)一步包括熒光定量聚合酶和參比染料；還提供了該試劑盒在檢測(cè)臨床樣品里存在的單核細(xì)胞增生李斯特菌中的應(yīng)用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，本發(fā)明提供的檢測(cè)單核細(xì)胞增生李斯特菌的熒光定量PCR試劑盒特異性強(qiáng)、靈敏度高、組成簡(jiǎn)單、操作方便，可以實(shí)現(xiàn)對(duì)單核細(xì)胞增生李斯特菌的快速檢測(cè)。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK102586413SQ20111027656
公開(kāi)日2012年7月18日 申請(qǐng)日期2011年9月9日 優(yōu)先權(quán)日2011年9月9日
發(fā)明者呂愛(ài)杰, 朱麗萍, 顏世敢 申請(qǐng)人:山東輕工業(yè)學(xué)院