專利名稱：生長素輸出載體pin1家族基因在玉米、高粱育種中的應用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬農(nóng)作物的生物工程育種領(lǐng)域，具體說，涉及一種通過構(gòu)建融合基因及轉(zhuǎn)基因改變玉米和高粱性狀的方案及應用，尤其涉及一種生長素輸出載體pmi家族基因在玉米、高粱育種中的應用。
背景技術(shù)：
植物基因工程的發(fā)展依賴于具有不同功能基因的應用。生長素在植物幼嫩部分或分裂旺盛的組織中合成，通過其特有的運輸方式到達作用部位，生長素在植物生長發(fā)育中起重要作用，通過調(diào)節(jié)生長素合成、轉(zhuǎn)運、代謝及相關(guān)的信號轉(zhuǎn)導基因的表達有可能對植物生長發(fā)育產(chǎn)生重要影響，這些與生長素作用有關(guān)的基因有一些可能是植物基因工程操作的理想靶標。生長素在植物組織內(nèi)的差異分布影響多個發(fā)育過程，不同環(huán)境信號和內(nèi)源信號能夠通過生長素的局部合成和細胞間轉(zhuǎn)運影響生長素在體內(nèi)的濃度梯度。IAA是多數(shù)植物中生長素的主要形式。在不少系統(tǒng)中低濃度生長素促進細胞伸長與分裂，而高濃度生長素則抑制細胞的分裂與伸長。1989年^chs在觀察到生長素對維管組織形成的誘導效應后提出了生長素信號流造管假說。該學說認為隨著生長素水平的提高會逐漸使生長素的運輸能力也得到提高并最終導致維管束分化。突變體monopteros和Iopl的生長素轉(zhuǎn)運能力發(fā)生改變，形成不正常的維管束，葉脈發(fā)育異常。Koizumi等Q000)通過對7個改變了維管束模式的突變體vanl-van7進行研究，進一步明確了生長素在維管束分化中具有重要作用。生長素具有明顯的促進不定根和側(cè)根發(fā)生及生長作用，參與根毛發(fā)育、初生根生長、側(cè)根原基形成和根的向重力性反應。生長素和細胞分裂素的相互作用調(diào)控胚根形成和側(cè)根發(fā)生的決定。生長素信號促進了細胞分裂素抑制蛋白的表達，而細胞分裂素誘導了生長素信號抑制蛋白。生長素在細胞間活躍轉(zhuǎn)運創(chuàng)建局部最大濃度，從而調(diào)控許多發(fā)育事件的起始和進程。 轉(zhuǎn)運方向由生長素輸出載體PIN蛋白控制。植物向性主要是生長運動，即由于細胞數(shù)目的增加或每個細胞體積的增大、或兩種機制同時發(fā)生作用而造成的植株部分的伸長、彎曲等變形。依外界因素不同，向性運動主要包括向光性、向重力性、向觸性、向化性和向水性，目前已證明生長素與植物向光性和向地性運動密切相關(guān)。Cholodny (1927年)和Went (19 年)各自發(fā)現(xiàn)在單側(cè)藍光的作用下燕麥胚芽鞘中的IAA向背光側(cè)移動?；谶@一實驗，Went和Thimarm等(1937)提出光能夠刺激生長素從植物胚芽鞘頂端向背光側(cè)側(cè)向運輸，使背光側(cè)的生長素濃度高于向光側(cè)， 繼而使得背光側(cè)的生長快于向光側(cè)，引起向光性彎曲。后來，Leopold等(197 用1 標記 IAA試驗證明，光能夠刺激IAA從玉米胚芽鞘的向光側(cè)向背光側(cè)運輸。向重力性是植物在重力影響下保持一定方向生長的特性。Rashottc等Q000)發(fā)現(xiàn)根的向重性彎曲也要求生長素沿根尖的向基運輸，在抑制劑濃度不顯著影響根生長的情況下阻斷生長素的向基運輸降低了根的向下彎曲的能力。分子檢測表明，受重力刺激后植物生長素響應基因在根尖兩側(cè)差異表達，與彎曲外側(cè)相比，彎曲內(nèi)側(cè)的該類基因的表達高。生長素可能是通過多重的生物學效應來調(diào)節(jié)植物向重力性彎曲，如相關(guān)基因表達差異、細胞的極化、細胞壁的酸化、細胞骨架結(jié)構(gòu)改變等。在植物根尖生長點中，生長素的極性運輸和局部合成促成了在靜止中心(即干細胞組織中心)部位形成所謂“生長素積累高峰”，對于靜止中心的建立和維持起至關(guān)重要的作用。在生長素信號通路中控制根尖干細胞活躍狀態(tài)的關(guān)鍵分子元件是PLT蛋白(干細胞轉(zhuǎn)錄因子)。生長素作用的反饋調(diào)節(jié)對于植物體的生長素運輸和差異分布有重要意義。而生長素差異分布是相應的發(fā)育過程啟動所必需的。如側(cè)根器官發(fā)生顯示了生長素最大濃度與發(fā)育編程調(diào)整和器官起始在時空上具有對應關(guān)系，遺傳或藥物干擾生長素的差異分布和響應過程阻礙了生長素梯度存在時出現(xiàn)的發(fā)育事件。另外，生長素差異分布似乎足以啟動發(fā)育過程。生長素微量應用到莖尖分生組織的精巧試驗表明局部增加生長素濃度足以啟動和完成葉或花的發(fā)育(Reinhardt et al.，2003)。生長素在給定細胞積累能修飾它的發(fā)育程序，即生長素積累的時間和位置決定了發(fā)育程序改編的時間和位置。在中柱鞘細胞中隨機刺激引起細胞生長素合成的增加，提高了局部生長素濃度，引起這些感受態(tài)細胞起始側(cè)根形成(Dubrovsky et al. ,2008) 組織內(nèi)的生長素濃度梯度包括生長素在細胞內(nèi)和細胞間的不均勻分布。細胞的生長素濃度可在合成、鈍化、活化、分解和細胞間的極性轉(zhuǎn)運多個層面上調(diào)節(jié)。并且這些不同層面的調(diào)節(jié)在不同物種、不同發(fā)育時期均起重要作用。植物中存在兩種不同的生長素運輸途徑韌皮部運輸和皮層中載體介導的極性運輸。在韌皮部運輸系統(tǒng)中，生長素的運輸與其它營養(yǎng)物質(zhì)的運輸沒有根本區(qū)別；而極性運輸則是生長素所特有的一類從細胞到細胞的主動運輸，依賴于膜定位的載體和能量消耗，運輸速度也比維管系統(tǒng)運輸速度較慢，一般為5-20mm/h。極性運輸使生長素在植株體內(nèi)形成以器官頂端為中心的濃度梯度，并維持不同組織中的生長素濃度差，實現(xiàn)植物發(fā)育的調(diào)控。 且生長素信號和生長素極性轉(zhuǎn)運之間存在著正反饋調(diào)節(jié)。介導生長素極性運輸?shù)牡鞍子?AUXl/LAX家族、PIN-formed家族、ABCB家族蛋白等。生長素進入細胞可通過被動擴散和質(zhì)膜上極性分布的生長素輸入載體(auxin influx carrier)介導這2種方式完成。由輸入載體(AUX1/LAX家族)介導的生長素流入細胞可以使生長素逆濃度梯度運輸，也可以防止生長素被動擴散入鄰近細胞中，從而保證了不同細胞和組織中生長素濃度與分布適宜。生長素輸出載體(auxin efflux carrier) 是一種復合物，由調(diào)節(jié)亞基-NPA結(jié)合蛋白和催化亞基-PIN(Pin-f0rmed)蛋白兩成分組成。 生長素在植物組織中的極性運輸很大程度上歸功于高度調(diào)控、極性定位的輸出載體PIN蛋白。擬南芥中PIN蛋白家族有8個成員，PIN1、PIN2、PIN3、PIN4和PIN7的功能已有較多的研究，而有關(guān)PIN5、PIN6和PIN8的作用報道較少(Kramer，2004)。PIN蛋白家族是膜內(nèi)在蛋白，有2個疏水區(qū)，每個疏水區(qū)有5個跨膜螺旋。2個疏水區(qū)之間是親水環(huán)，在親水環(huán)的第二個可變區(qū)和羧基端疏水區(qū)之間有一個保守的內(nèi)在構(gòu)型IM0內(nèi)在構(gòu)型IM在網(wǎng)格蛋白依賴的內(nèi)吞作用中、跨膜蛋白與接頭蛋白相互作用中起重要作用。親水環(huán)中有兩組模體(motif) 對PINs翻譯后修飾有重要作用，每組模體都有一個保守的糖基化位點和兩個保守的磷酸化位點。親水環(huán)的這種結(jié)構(gòu)對調(diào)節(jié)PINs蛋白的功能及其正確定位有重要作用。生長素在植物組織中的極性運輸很大程度上歸功于高度調(diào)控、極性定位的輸出載體PIN蛋白。雖然PINl、PIN2、PIN3、PIN4和PIN7都具有生長素輸出載體的功能，但它們在植物多種生理過程中也有不同的作用。Pinl突變體中，生長素在花序軸的向基式運輸減弱，并使維管發(fā)育缺陷，形成著名的“PIN-like”表型(Galweiler et al 1998 ；Luschnig et all998)。Pim蛋白含有622個氨基酸，推測具有12個跨膜區(qū)域，與原核生物和真核生物的運輸載體相類似。在活性細胞中PIN蛋白的極性定位是決定生長素流方向的主要因素。免疫定位技術(shù)顯示，PINl主要位于薄壁細胞，也在根中柱外周細胞和葉原基中圍繞初生葉脈分布，在從莖尖的向基部的運輸和在根尖的向頂式運輸中起關(guān)鍵作用。Muday等Q003)認為，小泡循環(huán)機制控制了生長素運輸?shù)臉O性，GNOM ARF-GEF介導了內(nèi)體再循環(huán)、生長素運輸和生長素依賴性生長。PIN蛋白的磷酸化狀態(tài)對其定位有重要作用。PINOID(PID)編碼一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，催化PIN蛋白的磷酸化(Huang et al，2010 ；Sukumar et al, 2009)。PID組成型過表達產(chǎn)生根向重力性和主根根尖中根分生組織器官缺失的缺陷，這些表型缺陷與PIN2、PIN4定位錯誤引起的根冠生長素最大含量下降有關(guān)。磷酸肌醇依賴蛋白激酶 l(phosphoinositide dependent proteinkinase 1，PDK1)磷酸化激活 PID，PDK1 的磷酸化作用對PINs正確定位非常重要(Zegzouti et al，2006)。蛋白質(zhì)磷酸酶2A (protein phosphatase 2k, PP2A)也可調(diào)節(jié)PINs的極性定位，PP2A與PINs共同定位在質(zhì)膜上，通過作用于PINs的磷酸化位點與PID的拮抗調(diào)控PINs的定位(Michniewicz et al，2006)。多種藥物抗性糖蛋白(multidrug Resistance P. glycoproteins，MDR/PGPs)也在生長素的運輸中起作用。從吲哚-3-乙酸競爭性抑制劑NPA高親和力結(jié)合復合體中純化得到了 PGP1、PGP2、PGP4、PGP10和PGP19，這些蛋白可能在生長素的流出復合體中起作用，并在PINs的活性調(diào)節(jié)中發(fā)揮功能(Noh et al,2001 ；Murphy et al，2002)。玉米中的 br2(branchytic2)和高梁中的dw3 (dwarf3)是AtPGPl的同源基因，突變后降低下胚軸和花序中的生長素極性運輸，植株發(fā)生部分矮化(Multani et al，2003)。在atpgpl和atpgpl9 雙突變中，矮化更加明顯(Geisler et al，2003)。AtPGP4與AtPGPl在氨基酸水平上相似性為60%，在初生根和側(cè)根發(fā)育中表達，在根的發(fā)育中起作用(Santelia et al,2005 ； Terasaka et al，2005)。其功能缺失降低了生長素向基運輸，改變了向胞內(nèi)的流入，促進根毛形成，降低了 NPA生長抑制作用。PIN和PGP蛋白共定位并彼此互作，但二者之間確切的功能關(guān)系尚不清楚，目前的證據(jù)表明PGP在穩(wěn)定生長素的流出復合體和直接介導生長素流出兩個方面起作用。擬南芥中PIN蛋白家族有8個成員。Wang等(2009)和Miyashita等(2010)分別對水稻中可能的PIN基因的序列進行了全基因組的篩查和拼接，得到了 12個可能的生長素流出載體，按照親緣關(guān)系，屬于AtPim家族的有4個(OsPmia、OsPINlb, OsPINlc, OsPINld)，屬于 AtPIN5 家族的有 3 個(0sPIN5a、0sPIN5b、0sPIN5c)，屬于 AtPIN2 和 AtPIN8 家族的各1個(0sPIN2和0sPIN8)，沒有得到與AtPIN3、AtPIM、AtPIN6、AtPIN7同源的基因。另外三個PIN基因?qū)儆趩为氝M化支，分別為0sPIN9、0sPIN10a、0sPmi0b。RT_PCR、GUS 染色和原位雜交分析均表明，OsPim與AtPim家族的關(guān)系更近，其在維管組織和根原基表達(Xu et al，2005)，在不定根和分蘗發(fā)生中起著重要的作用。OsPINla和OsPimb在所檢測的器官中組成型表達，而OsPINlc在葉和幼嫩花序中低豐度表達。0sPIN2在莖、葉和幼嫩花序中表達量低于根和莖基部的。OsPI^b在幼嫩花序中表達量高于0sPIN5a。0sPIN9 在根和莖基部表達量較高。OsPmiOa在除根外所有組織中都高豐度表達而OsPmiOb僅在葉中表達量較高。玉米中存在13個可能的生長素流出載體。Carraro等Q006)克隆得出ZmPINla, ZmPINlb基因的DNA和cDNA序列并研究了玉米PINl家族基因在B73和barren inflorescence2(bif2)突變體的雌雄穗發(fā)育過程中的表達情況。依據(jù)序列相似性，ZmPINla 是水稻OsPmic的同源基因，OsPINla在玉米中的同源基因是ZmPINlb和ZmPINlc，OsPINlb 和OsPINld與玉米的ZmPINld相對應。半定量RT-PCR檢測表明，在B73中ZmPINlb和ZmPINla在根、葉片和雄穗中的表達豐度沒有明顯差別，但在幼嫩雌穗(V8期)中檢測不到ZmPINla的表達，而在雌穗發(fā)育過程中ZmPINla表達量升高(V12期)。在bif2突變體的根和種子萌發(fā)的小苗中，這兩個基因表達豐度與野生型相比沒有明顯差別，但在葉片和雌雄穗中表達豐度高于B73的。原位雜交分析表明，ZmPim主要在玉米莖尖生長點的維管組織中表達，信號主要出現(xiàn)在分裂旺盛區(qū)，在側(cè)原基中主要出現(xiàn)在幼葉的頂端。在分化的雄穗中，在形成側(cè)生分生組織的維管束處表達。在雄穗的分支中，最初檢測到的信號位于分支的中部，之后在小穗分生區(qū)呈對稱型分布。在發(fā)育的雌穗中，在苞片原基的頂端、維管組織和花序分生組織的中央細胞中都檢測到ZmPim的信號，但在外層細胞中沒有表達。隨著雌穗的發(fā)育，信號擴散到整個小穗的頂端，之后在小穗和形成的兩個小花序軸中表達。2010年i^restan等研究了玉米Pim家族基因在B73和defective endosperm_B18 (de*_B18)籽粒發(fā)育過程中的表達模式。de*_B18 突變體是早期分離得到的一個胚乳缺陷型突變體，該突變體胚乳中游離和結(jié)合態(tài)的IAA水平低于野生型植株的。檢測ZmPim家族基因的表達，發(fā)現(xiàn)在雙受精之后它們都隨著籽粒的發(fā)育進程而表達量升高，但各個成員的表達模式有所不同。ZmPINlc在發(fā)育早期(3d)的表達豐度是受精前的7倍，而ZmPINla則在發(fā)育的較后時期表達量增加。盡管有這些工作， 有關(guān)玉米生長素流入/出載體的分析目前還都局限于單個突變體或單個家族的研究，缺乏特定基因型中多個家族基因的表達分析和與根系發(fā)育的關(guān)系。bif2是M^teen課題組在 2001年鑒定出的花序分支突變體，該突變體表現(xiàn)為雄穗分支和小穗數(shù)目減少、雌穗數(shù)和籽粒數(shù)減少、腋生分生組織原基起始異常。2007年，他們通過轉(zhuǎn)座子標簽法克隆到bif2基因，發(fā)現(xiàn)其編碼基因為擬南芥PINOID的同源基因。2009年，通過體外試驗證明了 BARREN INFL0RESCENCE2 (BIF2)是通過磷酸化ZmPINla來調(diào)節(jié)ZmPINla的亞細胞定位起作用的。這與擬南芥中PINOID對PIN蛋白的作用一樣，說明這一調(diào)節(jié)機制在單雙子葉植物中是保守的 (Skirpan et al，2005)。我們的工作表明ZmPINla與水稻OsPmic的相似性最高。免疫定位技術(shù)顯示，PINl蛋白主要位于薄壁細胞，也在根中柱外周細胞和葉原基中圍繞初生葉脈分布，在生長素的莖尖向基部運輸和根尖向頂運輸中起到關(guān)鍵作用。影響Pim蛋白分布和極性定位導致植株生長發(fā)育異常。鑒于生長素在植物器官發(fā)生中的作用，而植物的抗逆境特性大部分與根系形態(tài)和生理特性直接相關(guān)，通過生長素濃度和極性分布的改良有望實現(xiàn)1)提高作物對肥料的利用率，節(jié)省生產(chǎn)成本并減少環(huán)境污染；2)提高根系對水分的利用率，增加干旱地區(qū)作物產(chǎn)量；3)提高作物抵抗鹽漬化的能力，增加鹽漬耕地中作物產(chǎn)量；幻創(chuàng)造高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)抗倒伏品種。本發(fā)明提供一種利用生長素輸出載體Pmi家族基因改良玉米、高粱性狀的應用方案及實例。

發(fā)明內(nèi)容
針對目前的研究現(xiàn)狀，本發(fā)明的目的是提供一個通過轉(zhuǎn)Pim家族成員基因產(chǎn)生生長素濃度梯度發(fā)生變化從而引起根系構(gòu)型和株高等性狀發(fā)生改變的工程玉米和高粱。本發(fā)明所述的Pim家族成員基因包括從不同高等植物中克隆的與玉米中 ZmPINla, ZmPINlb, ZmPINlc和ZmPINld編碼的多肽序列相近或相同的蛋白基因，也包括人工合成或由不同多聚脫氧核苷酸序列片段重組而成的核苷酸序列，即功能相近和相同的編碼蛋白的基因。本發(fā)明中，用于構(gòu)建融合基因的Pim的編碼序列可為cDNA序列，也可以為基因組序列，也可是根據(jù)部分編碼序列人工合成的脫氧多核苷酸鏈，以及它們派生的RNAi結(jié)構(gòu)。其中，構(gòu)建融合基因所用的啟動子可為根特異性啟動子，也可為葉、果穗、雄穗特異性啟動子，以及非特異性啟動子。本發(fā)明所說的融合基因由啟動子序列和目標基因編碼序列、植物基因的3'尾巴區(qū)構(gòu)成。融合基因能在植物細胞中有效表達。在本發(fā)明中，將從玉米中克隆的ZmPmia、ZmPINlb和ZmPINlc的全長序列分別重組到中間質(zhì)粒中與不同的啟動子連接構(gòu)建融合基因，然后將融合基因插入到植物表達載體中，采用轉(zhuǎn)基因技術(shù)將重組基因?qū)胫参锛毎?，獲得轉(zhuǎn)基因植株。其中，所述的ZmPmia、ZmPINlb和ZmPINlc的全長序列來自普通栽培玉米和玉蜀黍?qū)俚挠衩捉壏N或亞種，也可是人工合成的序列一致和相近DNA片段。在本發(fā)明中，通過轉(zhuǎn)基因表達的檢測和對轉(zhuǎn)基因植株的性狀進行分析，從中篩選出目標性狀明顯改變的轉(zhuǎn)基因植株及其后代，創(chuàng)造在植物育種中有應用前景的新材料。本發(fā)明克隆出Pim家族成員基因可單一或聯(lián)合重組到植物表達載體中，再將后者轉(zhuǎn)入玉米、高粱骨干自交系，獲得農(nóng)藝性狀發(fā)生改變的玉米。本發(fā)明產(chǎn)生的轉(zhuǎn)ZmPINla玉米和ZmPINlb/c玉米可單獨利用，也可將它們彼此雜交后獲得兼有轉(zhuǎn)基因ZmPINla和ZmPINlb/c玉米進行利用。Pim基因家族基因的鑒別和克隆通過全基因組的篩查和拼接，在擬南芥中鑒定出ι個Pim基因，即AtPim ；結(jié)合利用AtPim基因序列進行相似性比較，在水稻中鑒定出4個Pim基因，即ospmia、 OsPINlb、OsPINlc、OsPINld，其中 REHl(Arabidopsis ethylene insensitive root 1)即為OsPmia在不定根和分蘗發(fā)生中起著重要的作用，OsPINla和OsPmib在所檢測的器官中呈組成型表達，而OsPINlc在葉和幼嫩花序中低豐度表達。以水稻的Pim基因的⑶S序列為探針篩查玉米非冗余序列數(shù)據(jù)庫，得到ZmPmia、ZmPINlb的全長cDNA，序列比對發(fā)現(xiàn)它們分別與水稻的0sPmib、0sPmiC有較高相似性。編碼產(chǎn)物長度分別為601和618個氨基酸，分子量為65. 19kDa和67. 33kDa，等電點為8. 90和9. 91。用AtPINl的CDS序列篩查玉米EST序列數(shù)據(jù)庫，發(fā)現(xiàn)DV539656. 1序列與AtPim相似性較高，序列比對發(fā)現(xiàn)DV539656. 1 缺少完整5’端。以DV539656. 1為種子序列篩查玉米EST序列數(shù)據(jù)庫得到重疊群，用拼接軟件kqsMan拼接后得到兩個contig，其中一個為ZrnPimb，另一個與ZmPINlb有較高相似性，含有完整的0RF，編碼583氨基酸的肽鏈，與水稻的OsPINlc有較高的相似性，命名為 ZmPINlc。后者編碼蛋白的分子量為63. 2kDa，等電點7. 76。用水稻OsPINld的CDS序列篩查玉米高通量測序數(shù)據(jù)庫發(fā)現(xiàn)，玉米4號染色體CH201-433F16中有與OsPINld相似性較高的片段，將此序列用內(nèi)含子外顯子預測軟件GENSCAN預測，得到與OsPINld相似性較高的 ZmPmid，后者編碼580個氨基酸的肽鏈，分子量為61. 05kDa，等電點9. 18。
氨基酸序列比對發(fā)現(xiàn)，玉米中的4個Pim-Iike蛋白與擬南芥和水稻中的對應蛋白有相似的氨基酸序列，具有保守的跨膜氨基酸轉(zhuǎn)運和跨膜生長素轉(zhuǎn)運結(jié)構(gòu)域。ZmPINlb 編碼產(chǎn)物為618個氨基酸，且它與ZmPINla和ZmPINlc的差別主要在于在第548位氨基酸之后的一段序列，比ZmPINla多出18個氨基酸，比ZmPINlc多出37個氨基酸。ZmPINlb和 ZmPINlc對應于玉米基因組上同一段序列，推測它們來自同一 mRNA前體可變剪接的產(chǎn)物。 玉米 ZmPINlb 和 ZmPINlc 與 OsPINla 相似性高，玉米 ZmPINld 與 OsPINlb 和 OsPINld 親緣關(guān)系相近，而玉米ZmPINla是OsPmic的同源基因。蛋白的二、三級結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)玉米生長素流出載體與擬南芥、水稻的生長素流出載體有相似的跨膜蛋白結(jié)構(gòu)和外顯子排列方式。ZmPINlb和ZmPINla在玉米根、葉片和雄穗中的表達豐度沒有明顯差別，但在幼嫩雌穗 (V8期)中檢測不到ZmPINla的表達，而在雌穗發(fā)育過程中ZmPINla表達量升高(V12期)。 ZmPINl主要在玉米莖尖生長點的維管組織中表達，信號主要出現(xiàn)在分裂旺盛區(qū)，在側(cè)原基中主要出現(xiàn)在幼葉的頂端。在分化的雄穗中，在形成側(cè)生分生組織的維管束處表達。在發(fā)育的雌穗中，在苞片原基的頂端、維管組織和花序分生組織的中央細胞中都檢測到ZmPim 的信號，但在外層細胞中沒有表達。隨著雌穗的發(fā)育，信號擴散到整個小穗的頂端，之后在小穗和形成的兩個小花序軸中表達。檢測ZmPim家族基因的表達，發(fā)現(xiàn)在雙受精之后它們都隨著籽粒的發(fā)育進程而表達量升高，但各個成員的表達模式有所不同。ZmPINlc發(fā)育早期 (3d)的表達豐度是受精前的7倍，而ZmPINla則在發(fā)育的較后時期表達量增加。除上述基因外，已鑒別出的生長素流出載體PINl-Iike基因在NCBI中還有 ChPINl, ACH91863.1 ；CsPINl, BAC41319.1 ；GhPINl, AAN71616.1 ；H1PIN1, ABS17596.1 ； LaPINl，CAJ84441.1 ；McPINl，AAQ14257.1 ；MtPINl，AAM55300.1 ；PsPINl，AA038045.1 ； PtPINl, XP_002317874. 1 ；SbPINl, XP_002436761. 1 ；S1PIN1, ADR30406. 1 ；TsPINla, AAS19858. 1 ；ZvPINl, AH47607. 1。將這些基因轉(zhuǎn)入玉米和高粱獲得根系性狀等發(fā)生變化的轉(zhuǎn)基因材料并用于育種已屬于本專利內(nèi)容。PINl基因植物表達載體的構(gòu)建以玉米ZmPim基因為例簡述Pim基因植物表達載體的構(gòu)建過程。根據(jù)生物信息學預測得到的核苷酸序列設(shè)計PCR引物，經(jīng)PCR擴增得到了玉米基因組中4個PINl-Iike 生長素流出載體基因。采用常規(guī)的分子克隆技術(shù)克隆出玉米ZmPmia、ZmPINlb和ZmPINlc 的cDNA全序列。ZmPINla位于玉米B73染色體9上，cDNA長1806bp (DQ836239. 1)，編碼 601個氨基酸的肽鏈(ABH09242)。ZmPINlb和ZmPINlc位于玉米B73染色體4上的同一位置，cDNA分別長1788bp (DQ836240)和1968bp (EU570251)，分別編碼595個氨基酸的肽鏈 (ABH09243)和597個氨基酸的肽鏈(ACB55418)。首先將Pim基因以正義形式、或反義形式、或RNAi結(jié)構(gòu)形式與選用的啟動子和轉(zhuǎn)錄終止區(qū)片段相連，構(gòu)建出融合基因，然后重組到植物表達載體中?？筛鶕?jù)受體植物和所需基因的表達強度及可調(diào)控程度，融合基因中可加入分別適合于單、雙子葉植物或其它植物的增強子或抑制子或?qū)μ攸c信號發(fā)生反應的序列(順式作用元件)。融合基因的;T端可選用不同基因的3'尾巴區(qū)，也可插入增強子序列。在融合基因中，也可在編碼區(qū)插入不同內(nèi)含子。含有目標基因的植物表達載體可在大腸桿菌和農(nóng)桿菌中增殖或/和保存。用含有融合基因的植物表達載體轉(zhuǎn)化玉米和高粱根據(jù)受體材料的特點選用不同的轉(zhuǎn)基因方法獲得轉(zhuǎn)基因植物。
常用的轉(zhuǎn)化方法有3類1)直接轉(zhuǎn)化法，即提取重組質(zhì)粒DNA，采用基因槍轟擊法、 聚乙二醇誘導法、電融合法、硅碳纖維法等將質(zhì)粒DNA或融合基因?qū)爰毎?)農(nóng)桿菌介導的遺傳化方法?；梅N系轉(zhuǎn)化法，包括花粉管通道法、子房注射法等。此外，還有將不同類方法組合使用的轉(zhuǎn)化程序，如將基因槍轟擊法和農(nóng)桿菌感染相結(jié)合使用以提高轉(zhuǎn)化效率。以下以玉米自交系為材料、采用農(nóng)桿菌介導法轉(zhuǎn)化玉米無菌苗莖尖為例闡述該過程。玉米(Zea mays L.)優(yōu)良自交系的種子，用70 %乙醇浸泡3分鐘，再用1%。氯化高汞浸泡8-10分鐘，然后用無菌水洗滌3-5遍。滅菌期間不斷搖晃種子，以保證表面滅菌徹底。滅菌后種子放在無菌罐頭瓶內(nèi)萌發(fā)，瓶內(nèi)放入少量無菌水(30-40毫升/250毫升罐頭瓶)，封口后放在黑暗條件下2-3天。待種子萌動長出胚根及胚芽后，將其放在玉米萌發(fā)培養(yǎng)基上于黑暗條件下萌發(fā)。待胚芽伸長至3-5厘米時，用解剖刀剝?nèi)ヅ哐壳始?1-2片幼葉，暴露出芽尖，再用解剖刀從中部縱向切傷芽尖。切傷芽尖的無菌苗用于農(nóng)桿菌感染。將帶有目的質(zhì)粒的根癌農(nóng)桿菌LBA4404在附加抗生素的YEP培養(yǎng)基中下震蕩培養(yǎng)，震蕩速率為170rpm，使細菌處于對數(shù)生長期。然后在3000rpm下離心5分鐘，棄上清夜。再將菌體用添加ΙΟΟμπιοΙ/l乙酰丁香酮(acet0Syring0ne，AQ的懸浮培養(yǎng)基重懸。 然后將菌液倒在直徑15厘米的培養(yǎng)皿中，傾斜培養(yǎng)皿，使已被切傷的無菌苗頂端浸泡在菌液中，抽真空(0. 05MPa)感染10 15分鐘。浸染后的芽尖用無菌濾紙吸干，將根部插入玉米萌發(fā)培養(yǎng)基上黑暗中培養(yǎng)3天。 培養(yǎng)溫度為22 M°C。將共培養(yǎng)后的無菌苗移栽到上層蛭石下層土壤的花盆中，并用松散濕潤的蛭石覆蓋植株頂部。然后讓植株在自然光照下生長，日溫22 28V，夜溫15 21 °C。移栽到蛭石中的轉(zhuǎn)化植株長到3葉期，均勻噴灑合適濃度的除草劑水溶液進行篩選。噴灑以植株葉片掉液滴為宜。噴灑后對照植株10天以后見效，15天后死亡率在95% 左右，轉(zhuǎn)化植株在噴灑除草劑水溶液后，一些個體變化同對照植株相似，另一些個體則持續(xù)生長，變化不明顯。待存活植株長到5-6葉時移栽到田間，套袋自交或姊妹交結(jié)籽。轉(zhuǎn)化植株的篩選和初步檢查轉(zhuǎn)化植株產(chǎn)生的種子播在塑料盤中，出苗(Tl植株)后3 4葉期用對非轉(zhuǎn)化植株致死的除草劑水溶液噴灑，觀察統(tǒng)計抗性和敏感性個體比例；采用PCR技術(shù)檢測存活植株是否攜帶外源基因，并統(tǒng)計外源基因在子代植株中的分離比例。移栽存活植株到大田， 套袋自交產(chǎn)生T2代種子。T2植株除套袋自交結(jié)籽外，采用PCR技術(shù)檢測外源基因并進行 Southern blotting驗證，采用RT-PCR技術(shù)檢查轉(zhuǎn)基因表達強度。對于入選的轉(zhuǎn)基因株系再次觀察統(tǒng)計小苗對除草劑的抗性和敏感性個體比例，選出轉(zhuǎn)基因純合系進行植株性狀的分析。轉(zhuǎn)基因植株的性狀檢測及利用利用蛭石培養(yǎng)觀察轉(zhuǎn)基因植株根系構(gòu)型和株型變化。將未轉(zhuǎn)基因?qū)φ罩晗岛筒煌D(zhuǎn)基因株系的種子播于大小一致、蛭石含量一致的無蓋大箱中。3葉期定苗，隔天澆灌 1/2MS營養(yǎng)液。待植株長至6葉期時，洗去蛭石，輕輕分離玉米根系，再用自來水洗凈后照相，利用根系掃描儀掃描分析，然后烘干并測定根系和地上部的生物量，計算根冠比。植株耐低磷特性檢測采用水培和沙培法。
在水培法檢測中，首先選取大小均勻的未轉(zhuǎn)基因?qū)φ罩晗岛筒煌D(zhuǎn)基因株系的種子，經(jīng)70%酒精、0. 1 %升汞依次滅菌3分鐘和8分鐘，用無菌水洗滌3次后放入人工氣候箱于下避光萌發(fā)。種子長出約1. 5cm幼根后轉(zhuǎn)入足磷營養(yǎng)液(Ca(NO3)2 ·4Η20 2mM,NH4NO3 1. 25mM, KCl 0. ImM, K2SO4 0. 65mM, KH2PO4 ImM, MgSO4 0. 65mM, H3BO3IO. 0 μ Μ, (NH4)6Mo7O24 0. 5 μ M，MnSO4 1· 0 μ Μ，CuSO4 · 5Η20 0. 1 μ Μ, ZnSO4 · 7Η20 1· 0 μ Μ，F(xiàn)e-EDTA 0. ImM, ρΗ = 6. 0士0. 1)中在25°C、70%相對濕度的溫室中培養(yǎng)至4葉期，然后將小苗轉(zhuǎn)入大小一致、營養(yǎng)液含量相等的藍色盒子里生長。營養(yǎng)液分別為足磷營養(yǎng)液和低磷營養(yǎng)液(KH2PO4濃度變?yōu)?. 0 μ M營養(yǎng)液)，每3天更換一次成分不變的營養(yǎng)液。當植株出現(xiàn)明顯的形態(tài)差異時，輕輕取出植株，測量株高和照相，收獲時切下根系，用PowerlooklOOO根系掃描儀及軟件對根系構(gòu)成組分進行測量和計算。植株莖葉和根系分別烘干、稱重，計算根冠比，比較不同供磷條件下根系形態(tài)和生物量的差異，確定植株的耐低磷特性。沙培實驗中，未轉(zhuǎn)基因?qū)φ罩晗岛筒煌D(zhuǎn)基因株系的種子播在沙盆中，在適宜光溫條件下生長。植株5 6葉期時分為2組，一組隔天澆灌足磷營養(yǎng)液，另一組隔天澆灌低磷營養(yǎng)液，觀察植株長勢和生長發(fā)育的差異，果穗成熟后收獲地上部和地下部生物量并進行比較分析，對果穗進行考種分析，選出受低磷脅迫影響較小單株產(chǎn)量較高的株系并進行相關(guān)性狀的進一步分析，選出耐低磷轉(zhuǎn)基因株系。轉(zhuǎn)基因植株耐旱性檢測有多種方法供選。為了減少工作量和獲得與大田試驗相近的結(jié)果，本發(fā)明推薦在植株苗期和拔節(jié)期進行自然干旱鑒定的方法。玉米苗期干旱脅迫處理試驗在人工氣候室中生長，光照14h/d，光強110001X，相對濕度50-60%，溫度32 °C (光(暗)。未轉(zhuǎn)基因?qū)φ罩晗岛筒煌D(zhuǎn)基因株系的種子播在土盤中，土層厚10厘米，3 4葉期時一次澆足水分，然后中止?jié)菜钡街仓陣乐匚?，再恢復澆水，觀察植株萎蔫所需時間和復水后的恢復時間及成活率。玉米拔節(jié)期干旱脅迫試驗在自然條件下進行，但脅迫處理期間避免植株淋雨。種于花盆的玉米植株在正常澆水條件下長至10葉期，然后控制每天澆水量(約400ml)，使土壤中相對含水量保持在15-17%左右，持續(xù)處理16天，然后恢復正常澆水。在控水澆灌期間，植株在白天8 18時間葉片萎蔫，夜晚葉片恢復伸展。恢復正常澆水一周后植株開始抽雄。再將花盆分開放置，以使植株自交結(jié)實。收獲成熟籽粒，進行產(chǎn)量和生物量測定。將植株控制澆水第1天(葉片在上午8時左右開始萎蔫)記為干旱脅迫處理第0天，分別在處理的第0、2、4、8、16天和恢復正常澆水后第7天取樣，測定各項生理指標。并對雌雄穗發(fā)育狀況，花粉活力，籽粒重等進行觀測。轉(zhuǎn)基因植株農(nóng)藝性狀的觀察和利用價值的評估在以上工作的基礎(chǔ)上，將入選的不同轉(zhuǎn)基因株系和未轉(zhuǎn)基因?qū)φ罩晗档姆N子在玉米適宜生長季節(jié)中播于大小一致、土壤含量相等的大花盆(D = 40cm)里，露天生長。3葉期定苗，每個株系設(shè)8次重復，隔2周施肥一次，澆足水分。植株抽雄后，在避風區(qū)內(nèi)按行距 0. Sm、株距0. 75m間隔排列，力求實現(xiàn)單株自然授粉，以了解單株生產(chǎn)力。抽雄后統(tǒng)計雄穗分支數(shù)及長度、花藥和吐絲顏色、吐絲時間。灌漿初期統(tǒng)計植株高度、葉片數(shù)、穗位高、雌穗個數(shù)。收獲期統(tǒng)計單株果穗數(shù)、計算生育期。果穗干燥后測定穗長、穗行數(shù)、行粒數(shù)、穗軸粗、 百粒重。綜合多方面的測試結(jié)果，選出優(yōu)異的轉(zhuǎn)基因植株套袋自交純合，并進行配合力測定，入選的自交系或具有發(fā)達的根系且耐低磷耐旱特性明顯優(yōu)于未轉(zhuǎn)基因自交系或具有特異性狀，如植株下部節(jié)間變短、株高變矮、葉片變窄，選擇配合力與供體自交系相同或有提高的轉(zhuǎn)基因自交系用于玉米單交種選育。
具體實施例方式實施例1 轉(zhuǎn)I^rsp: ZmPINla基因創(chuàng)造玉米耐旱耐低磷自交系及應用融合基因及植物表達載體的構(gòu)建為了實現(xiàn)轉(zhuǎn)基因ZmPINla在玉米根部特異性表達，需要將其與根特異表達的啟動子連接，構(gòu)建融合基因。大麥磷轉(zhuǎn)運體1基因在根中特異性表達且受低磷脅迫誘導(Schiinmann 等，2004)，采用 PCR 方法將其啟動子部分(GenBank accession number AFM3197中ATG密碼子5，上游的84;3bp，非全長)從大麥基因組中擴增出，命名為I^rsp。 經(jīng)測序驗正后將該啟動子重組到中間載體中。然后利用Hind III和)(bal I酶切位點將該啟動子定向重組到帶有草甘膦抗性基因EPSP為植物選擇標記的植物表達載體中，得到質(zhì) SpCAMBIA-Prsp: :MCS-Tnos-P35S: :EPSP (pRPE)。該載體含有由 P35S 啟動的 EPSP 基因，含有啟動的目的基因插盒。構(gòu)建好的植物表達載體pRPE用于ZmPINla基因植物表達載體的構(gòu)建，即將ZmPINla分別以正義和反義形式插入到多克隆位點MCS，得到所需質(zhì)粒。后者經(jīng)酶切鑒定或測序鑒定后，采用液氮速凍法導入農(nóng)桿菌LBA4404或其它菌株中，后者用于農(nóng)桿菌介導的玉米遺傳轉(zhuǎn)化。玉米轉(zhuǎn)化受體系統(tǒng)的建立以我國農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上所用的骨干自交系為材料，如DH4866、齊319等。取干凈的自交種子滅菌后培養(yǎng)，取莖尖離體誘導產(chǎn)生叢生芽塊，以叢生芽塊為受體進行遺傳轉(zhuǎn)化。所用培養(yǎng)基有種子萌發(fā)培養(yǎng)基:KN031 9 00mg/l, NH4N03 1650mg/l, CaCl2 · 2 H2O 440mg/ 1，MgSO4 · 7H20 370mg/l, KH2PO4 · H2O 170mg/l, FeSO4 · 7H20 27. 8mg/l, ZnSO4 · 7H20 10mg/l, MnSO4 · 4H20 22. 3mg/l, H3BO3 10mg/l, KI 0. 83mg/l, Na2MoO4 · 2H20 0. 5mg/l, CuSO4 · 5H200. 025mg/l，CoCl2 · 6H20 0. 025mg/l，鹽酸硫胺素 10. Omg/1，鹽酸吡哆醇 1. Omg/ 1，煙酸1. Omg/1，甘氨酸2. Omg/1，肌醇100. Omg/1，生物素0. 05mg/l，酪蛋白水解物500mg/ 1，蔗糖3(^/1，瓊脂粉78/1，？!15.8 6.0。用于種子萌發(fā)。液體培養(yǎng)基則去掉瓊脂粉。A培養(yǎng)基種子萌發(fā)培養(yǎng)基附加6-BA4. 5 9. 0 μ mol/1和2，4-D1. 0 3. 0 μ mol/ 1，用于誘導離體培養(yǎng)芽尖產(chǎn)生叢生芽組織塊和叢生芽組織塊繼代培養(yǎng)。B培養(yǎng)基種子萌發(fā)培養(yǎng)基附加6-BA4. 5 μ mol/1和IBA (吲哚丁酸)1. 8 μ mol/1, 用于叢生芽組織塊分化小苗。成苗培養(yǎng)基種子萌發(fā)培養(yǎng)基附加6-BA2. 25 μ mol/1和IBA3. 6 μ mol/1，用于叢生小芽發(fā)育成小苗。生根培養(yǎng)基種子萌發(fā)培養(yǎng)基附加IBA2. 8 3. 6 μ mol/Ι，用于無根小苗生根?；九囵B(yǎng)基及植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)熱壓滅菌；抗生素和除草劑等活性成分過濾滅菌，在培養(yǎng)基滅菌后加入。操作過程為種子滅菌和萌發(fā)玉米種子用70%乙醇浸泡10分鐘，再用0. 氯化汞浸泡10 15分鐘，然后用無菌水洗滌3 5遍。滅菌后種子放在無菌三角瓶內(nèi)萌發(fā)，瓶內(nèi)放入少量 (30 40毫升/250毫升三角瓶)無菌水，封口后放在黑暗條件03 30°C )下1 2天。 萌動(露白)后種子放在基本培養(yǎng)基上于黑暗條件下繼續(xù)萌發(fā)。莖尖培養(yǎng)和叢生芽組織塊誘導、繼代、分化萌發(fā)種子的胚芽伸長止3 5厘米時，剝離胚芽鞘及幼葉，切取長約5毫米左右的上胚軸及莖尖，接種到A培養(yǎng)基上于黑暗下
27°C)培養(yǎng)，并及時切去伸長的胚軸和剝?nèi)ビ兹~。培養(yǎng)6 10天后，莖尖開始不規(guī)則膨大生長，在膨大的分生組織上出現(xiàn)數(shù)個瘤狀或指狀突起。20天后，在瘤狀或指狀突起的表面開始形成不定芽及胚狀體。一般每4周繼代培養(yǎng)一次。在繼代培養(yǎng)中，若叢生芽組織塊叢生小芽偏多，2，4-D濃度取3. 0 μ mol/1 ；若叢生芽組織塊愈傷組織化較重，雖有大量的分生細胞團，但表面很少出現(xiàn)不定芽，可將2，4-D濃度降為Ι.ΟμπιοΙ/l，繼續(xù)培養(yǎng)則重新產(chǎn)生大量瘤狀或指狀突起。A培養(yǎng)基上的叢生芽組織塊，少數(shù)有不定根的產(chǎn)生。與幼葉存在一樣，不定根也影響組織塊的膨大生長及胚狀體和叢生小芽的產(chǎn)生，需要及早去掉。叢生芽組織塊在轉(zhuǎn)移到B培養(yǎng)基上2 3天后，色澤逐漸變黃，質(zhì)地較柔韌，5 6天后表面出現(xiàn)微小突起。掃描電鏡下觀察可見各期胚狀體及不定芽。胚狀體及不定芽迅速發(fā)育，在組織塊表面形成叢生小芽。將帶有雙元載體(Mini-Ti質(zhì)粒為 pCAMBIA-Prsp :ZmPINla-Tnos-P35S: :EPSP, pCAMBIA-Prsp::ZmPINlb-Tnos-P35S::EPSP 或 pCAMBIA-Prsp::ZmPINlc-Tnos_P35S::EP SP)的根瘤農(nóng)桿菌(如AGLO和LBA4404)在附加抗生素的LB培養(yǎng)基(每升培養(yǎng)基含胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl 10g, pH7.0，熱壓滅菌)中下震蕩培養(yǎng)，震蕩速率為 IlOrpm(轉(zhuǎn)/分)，使細菌處于對數(shù)生長期。然后在3000rpm下離心10分鐘，棄上清液。菌體用1/2濃度的液體種子萌發(fā)培養(yǎng)基(即種子萌發(fā)培養(yǎng)基成分減半，去掉瓊脂粉)洗滌，再離心收集。再將菌體用添加乙酰丁香酮(aCetOSyringOne，AS)100ymOl/l的1/2濃度的液體叢生芽誘導培養(yǎng)基懸浮，稀釋5-20倍用于轉(zhuǎn)化。取繼代培養(yǎng)13-20天的叢生芽組織塊為轉(zhuǎn)基因受體。用農(nóng)桿菌介導法進行轉(zhuǎn)化， 轉(zhuǎn)化材料在暗中進行恢復培養(yǎng)。農(nóng)桿菌感染的叢生小芽或叢生芽組織塊在加有頭孢霉素 (Cefotaxime) 250mg/l或羧芐青霉素(Carb) 500mg/l的培養(yǎng)基上于黑暗中培養(yǎng)7 12天， 抑制細菌生長?；謴团囵B(yǎng)后或抑菌培養(yǎng)后的叢生小芽或叢生芽組織塊在加有選擇劑草甘膦 (濃度因自交系不同而異)的培養(yǎng)基上連續(xù)篩選3 4代，獲得轉(zhuǎn)基因細胞及小芽。在篩選培養(yǎng)中絕大數(shù)叢生芽組織塊逐漸死亡。將存活的組織塊轉(zhuǎn)移到無選擇劑的去掉2，4-D的A 培養(yǎng)基上恢復培養(yǎng)后產(chǎn)生小芽。將小芽放在成苗培養(yǎng)基上生長，光強2000-30001χ，光照14_15小時/天。小苗長到3-4片葉時轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基中生根。培養(yǎng)15天左右，約40%的小苗產(chǎn)生新根。對于未生根苗，切傷其基部，轉(zhuǎn)移到新的生根培養(yǎng)基上培養(yǎng)，10天后大多數(shù)植株產(chǎn)生根系。生根苗洗去培養(yǎng)基后，移栽到以蛭石為栽培介質(zhì)的花盆中生長。植株在自然光照下生長，日溫22 280C，夜溫15 21°C，隔天澆灌1/2濃度的種子萌發(fā)培養(yǎng)基的無機鹽成分。生長2周左右， 移植苗產(chǎn)生發(fā)達根系，然后定植于田間。轉(zhuǎn)基因植株的抗性檢測和選擇利用取移栽成活植株的葉片進行分子生物學檢測確定轉(zhuǎn)基因植株。而后將轉(zhuǎn)基因植株(TO)套袋自交結(jié)實。將來自不同TO植株的Tl種子播在溫室或具有防護設(shè)施的田間，出苗后取葉片進行PCR檢測。檢測方法為采用CTAB法微量提取葉片DNA，依據(jù)EPSP序列設(shè)計特異引物。PCR反應體系為10XPCR反應緩沖液2. 5 μ 1，Mg2+(25mM) 1. 5 μ 1，引物 1(12. 5 μ Μ) 1 μ 1，引物 11(12. 5 μ Μ) 1 μ 1，dNTP(10mM each) 0. 5 μ 1，Taq DNA 聚合酶(5U/ μ 1)0. 125 μ 1，DNA模板1 μ 1，無菌雙蒸水17. 375 μ 1，共計25 μ 1。PCR反應程序為預變性 95°C 7分鐘；變性95°C 1分鐘，退火56°C 1分鐘，延伸72°C 1分鐘，循環(huán)35次；過度延伸7 分鐘。瓊脂糖電泳分離擴增產(chǎn)物，挑選PCR陽性個體。在此基礎(chǔ)上，從每一獨立轉(zhuǎn)化體的后代中選擇3株植株進行RT-PCR或Real-time RT-PCR檢測，確定目標基因的表達強度。即采用Trizol試劑提取玉米葉片總RNA，使用隨機六引物進行反轉(zhuǎn)錄，反應體系及步驟為RNA 500ng ；Random hexaprimer 0. 5 μ L ；Oligo dT primer 0· 5 μ L,5氺reverse transcriptase Buffer 2μ L, Reverse transcriptase Mix 0. 5 μ L ；Sterile ddH20 _卜足至 10 μ L，37°C反轉(zhuǎn)錄30min，85°C Seconds。將反轉(zhuǎn)錄所得cDNA稀釋10倍為模板進行PCR擴增。在25 μ 1 反應體系中含有 IOmM Tris-Cl, 50mM KCl, 1. 5mM MgCl2, 200 μ M dNTP each，0· 8 μ M 引物， 0. 625U Taq DNA polymerase，1 μ 1模板，無菌去離子水補足25 μ 1。反應程序為95°C預變性 5min ；95°C 變性 lmin，58°C 退火 lmin，72°C 延伸 30s，循環(huán) 40 次；72°C 延伸 7min。擴增產(chǎn)物電泳分析。若采用Real-time RT-PCR分析，反應體系為SYBR I^emix Ex Taq ΤΜ(2Χ)5μ L ；PCR Forward Primer (10 μ Μ)0. 2 μ L ；PCR Reverse Primer (10 μ Μ)0. 2 μ L ； cDNA 模板 Χμ L ;Sterile ddH20 Υμ L0 PCR 反應條件為95°C預變性 2min ;95°C變性 30s， 60°C退火30s，72°C延伸30s，循環(huán)40次；72°C延伸5min。退火溫度根據(jù)不同的引物有所不同，根據(jù)計算值進行確定。使用MJ Real-Time PCR儀進行Real-Time PCR，采用Opticon MonitorTM Software對實驗結(jié)果進行分析。每點個設(shè)三個生物學重復。Tl代篩選出的轉(zhuǎn)基因植株繼續(xù)套袋自交，對其子代繼續(xù)進行分子生物學鑒定和根系性狀檢測。通過2 3代自交純合和選擇，獲得轉(zhuǎn)基因純合玉米自交系。在植株三葉期噴灑1. 25%濃度草甘膦溶液進行除草劑抗性篩選，7 9d后統(tǒng)計抗、感植株比例。由于高濃度草甘膦引起玉米葉片發(fā)黃死亡，可根據(jù)發(fā)黃死亡程度分為I、 II、III、IV級，其中I級抗性最強。將抗性為I級或II級的Tl和T2代植株移栽到大田套袋自交，收獲子代種子，同時進行PCR檢測。經(jīng)除草劑篩選和PCR檢測。根據(jù)除草劑抗性和 PCR檢測結(jié)果，從T3代挑選出轉(zhuǎn)基因純合系(Tl和/或T2代呈現(xiàn)孟德爾分離比例，T3植株除草劑抗性無分離)用于植株性狀觀察和生理學測定。穩(wěn)定的轉(zhuǎn)基因株系RT-PCR篩選將T3代PCR陽性株系的種子萌發(fā)4d，取幼葉(包括芽鞘)和幼根進行Real-time RT-PCR檢測。在未轉(zhuǎn)基因?qū)φ罩仓曛?，根中ZmPINla表達量約是幼葉的1.2倍。在轉(zhuǎn)正義 ZmPINla的株系中，根中ZmPINla的表達量有不同程度的提高，部分株系根中的ZmPINla表達量是對照植株(WT)的2倍左右。在轉(zhuǎn)反義基因株系中，ZmPINla的表達量在多數(shù)株系的根中有不同程度的下降。另外ZmPINla在幼葉中的表達也受到轉(zhuǎn)基因的影響，也有顯著提高。通過轉(zhuǎn)基因植株Real-time RT-PCR檢測，篩選出目標基因表達強度與對照植株有顯著差異的轉(zhuǎn)基因純合株系，在后續(xù)工作中用于形態(tài)學分析和生物量分析。蛭石培養(yǎng)條件下V6期植株的生物量及形態(tài)分析將對照植株(WT)和不同轉(zhuǎn)基因株系的種子播于裝滿蛭石的無蓋大盒內(nèi)，自然光下生長，隔天澆灌營養(yǎng)液。轉(zhuǎn)正義ZmPINla基因植株的地上部明顯較矮，且主要由下部節(jié)間較短造成。植株長至6葉期時，用水洗去蛭石，將植株輕輕取出觀測。轉(zhuǎn)正義ZmPINla基因植株的根系比WT和轉(zhuǎn)反義基因植株的發(fā)達，表現(xiàn)為種子根長、側(cè)根數(shù)目增多，根體積增大。 生物量分析得出，6個轉(zhuǎn)正義ZmPINla基因株系具有一致的趨勢，根系干重顯著高于對照的，而莖葉干重比對照略輕；而4個轉(zhuǎn)反義ZmPINla基因的株系，莖葉比對照有不同程度增加，根干重與對照相近或較低。測定供磷水平對轉(zhuǎn)ZmPINla基因植株生物量及形態(tài)特征的影響T3代轉(zhuǎn)基因植株和對照植株在不同磷水平的營養(yǎng)液中生長到V6期，分別測量它們的根長、根數(shù)目、莖葉和根系生物量。在足磷營養(yǎng)液中轉(zhuǎn)正義ZmPINla株系玉米具有較發(fā)達的根系。雖然轉(zhuǎn)正義ZmPINla植株的冠根數(shù)、種子根數(shù)與對照植株相比無明顯差異，但側(cè)根數(shù)目是對照植株的121 173%。轉(zhuǎn)反義ZmPINla植株的側(cè)根數(shù)目是對照植株的82 106%，在4個株系中只有1個株系的側(cè)根數(shù)目顯著少于對照植株的。根長度測定表明，轉(zhuǎn)正義ZmPINla株系的側(cè)根長、總根長均顯著高于對照及反義株系，轉(zhuǎn)正義ZmPINla株系的初生根長和種子根長也高于對照植株的。就總體而言，轉(zhuǎn)反義ZmPINla株系的與對照相比差異較小，只有少數(shù)統(tǒng)計值與對照呈現(xiàn)差異顯著。用總根長除以總根數(shù)得到平均根長，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)正義ZmPINla基因的植株由于總根數(shù)大量增加而降低了平均根長，尤其是側(cè)根，但初生根和種子根的平均長度增加，這樣形成了具有較長種子根及初生根和較短而密集的側(cè)根的根系構(gòu)型。當植株在低磷營養(yǎng)液中生長時，ZmPINla基因過表達效果更加明顯，這可能與選用的啟動子特性(根特異表達的低磷脅迫誘導的啟動子)有關(guān)。低磷培養(yǎng)條件下各株系均表現(xiàn)出低磷條件下的適應性變化，對照株系表現(xiàn)為初生根長度增加，總根長下降，側(cè)根數(shù)目略有下降，但沒有達到統(tǒng)計學差異顯著。這與其它實驗的結(jié)果稍有差異，可能是處理的時間長短不同造成的。除對照植株外，其它株系均表現(xiàn)出側(cè)根數(shù)和總根數(shù)增加，初生根和冠根的長度增加，側(cè)根和總根長顯著下降。比較不同株系根系形態(tài)和統(tǒng)計值，得出轉(zhuǎn)正義ZmPINla基因植株的側(cè)根數(shù)和總根數(shù)與對照相比顯著增加，是對照植株的141 261%，但總根長為對照植株的98 132%，且根系各參數(shù)分析表明根長的增加主要是由初生根長度的增加引起的。測定ZmPINla過表達對玉米產(chǎn)量性狀的影響根據(jù)轉(zhuǎn)基因植株的表型及根系形態(tài)分析，轉(zhuǎn)入ZmPINla基因?qū)τ衩字仓晟L發(fā)育有較大影響，因此，有必要開展轉(zhuǎn)入ZmPINla基因?qū)τ衩桩a(chǎn)量性狀和抗逆性的影響。將對照株系(WT)和不同轉(zhuǎn)基因株系的種子播于大小一致、土壤含量一致的大花盆里，出苗后精心管理，等量施肥和澆水。在苗期，除生長較慢外，轉(zhuǎn)正義ZmPINla基因植株的地上部形態(tài)特征和對照植株相比無明顯差別。成株期轉(zhuǎn)正義ZmPINla基因植株的株高明顯較低，約為對照植株的73 91%，第一穗位高比對照降低了 20 35cm，且?guī)缀跛兄仓戤a(chǎn)生2-3個果穗，但下位果穗發(fā)育不良。轉(zhuǎn)反義ZmPINla株系玉米的生長狀況與對照相比差異不明顯。不同株系的植株生育期基本相同。單株產(chǎn)量統(tǒng)計結(jié)果表明，轉(zhuǎn)正義ZmPINla 株系的穗行數(shù)和穗軸粗與對照及反義株系相比無顯著差別，但多數(shù)果穗長度長于對照植株的，百粒重是對照植株的130 190%。由于雌雄發(fā)育協(xié)調(diào)程度在很大程度上決定了單株產(chǎn)量，散粉-吐絲間隔期大于3天的植株均結(jié)籽很差，與對照相比，多數(shù)轉(zhuǎn)正義基因的植株雌雄發(fā)育較協(xié)調(diào)。從總體而言，根特異性過表達ZmPINla提高了玉米單株產(chǎn)量?？赡馨l(fā)達的根系提高了玉米對水分、養(yǎng)分的吸收，從而提高了單株產(chǎn)量，且穗位高和株高的降低有利于抗倒伏、密植及光合效率的提高，在玉米密植育種中有一定的應用價值。在對玉米抗旱性測定中，將生長至V5期的轉(zhuǎn)ZmPINla基因玉米和對照小苗進行干旱致死試驗。在停止?jié)菜?d時，各株系均出現(xiàn)了缺水導致的葉片萎蔫，但正義株系葉片萎蔫程度較輕、出現(xiàn)脅迫癥狀較晚。繼續(xù)干旱3d(即干旱處理5d)后，各株系的植株都出現(xiàn)了嚴重的干旱脅迫癥狀，如葉片萎蔫、下部葉片開始死亡、莖基部因嚴重失水而植株倒伏。 比較此時各株系植株的形態(tài)變化和活力，發(fā)現(xiàn)正義株系比對照和反義株系植株的葉片萎蔫較輕，且倒伏植株比例較少?；謴蜐菜?d后，轉(zhuǎn)基因正義植株能夠較快恢復正常生長，而在對照和反義株系中僅有少量植株存活。即轉(zhuǎn)正義ZmPINla基因植株與對照植株相比具有明顯提高的耐旱性。實施例2 轉(zhuǎn)I^rsp ZmPINlb基因創(chuàng)造玉米耐旱耐低磷自交系及應用融合基因及植物表達載體的構(gòu)建為了實現(xiàn)轉(zhuǎn)基因ZmPINlb基因在玉米根部特異性表達，需將ZmPINlb基因與根特異表達的啟動子I^rsp (大麥磷轉(zhuǎn)運體1基因啟動子)連接，構(gòu)建融合基因。將測序驗正的 ZmPINlb 基因重組到 pCAMBIA-Prsp: :MCS-Tnos-P35S: :bar (pRPB)中，用于農(nóng)桿菌介導的玉米遺傳轉(zhuǎn)化。該載體含有由P35S啟動的抗除草劑草丁膦性的bar基因和啟動的目的基因，ZmPINlb可以正義或反義形式插入到多克隆位點MCS中，得到所需質(zhì)粒。后者經(jīng)酶切鑒定或測序鑒定后，采用液氮速凍法導入農(nóng)桿菌LBA4404或其它菌株中用于玉米遺傳轉(zhuǎn)化。玉米無菌苗獲得玉米優(yōu)良自交系的種子，用70%乙醇浸泡8分鐘，再用0. 氯化汞浸泡8-12分鐘，然后用無菌水洗滌3-5遍。滅菌期間不斷晃動種子，以保證表面滅菌徹底。滅菌后種子放在無菌三角瓶內(nèi)萌發(fā)，瓶內(nèi)放入少量無菌水于黑暗條件)下1-2天。待種子萌動(露白)后，將其放在改良MS培養(yǎng)基上于黑暗條件下萌發(fā)。待胚芽伸長止3-4厘米時， 剝離胚芽鞘及2-3片幼葉，露出莖尖頂端生長錐。農(nóng)桿菌培養(yǎng)及活化將帶有雙元載體(Mini-Ti質(zhì)粒 pCAMBIA-Prsp :ZmPINlb-Tnos-P35S: :bar)的根瘤農(nóng)桿菌(AGL1或LBA4404)在附加抗生素的LB培養(yǎng)基中下震蕩培養(yǎng)，震蕩速率為 llOr/min，使細菌處于對數(shù)生長期。然后在3000r/min下離心10分鐘，棄上清液。菌體用 1/2MS液體培養(yǎng)基洗滌，離心收集。再將菌體用添加ΙΟΟμπιοΙ/l乙酰丁香酮的1/2MS液體培養(yǎng)基懸浮，稀釋5-20倍用于轉(zhuǎn)化。玉米無菌苗轉(zhuǎn)化(1)將菌液倒在4. 5厘米直徑的培養(yǎng)皿中，傾斜培養(yǎng)皿，使露出莖尖生長錐的無菌苗浸泡在菌液中，在0. 5 X IO5Pa大氣壓下處理8-12分鐘。(2)浸染后的芽尖用無菌濾紙吸干，萌發(fā)種子放在改良MS培養(yǎng)基上于黑暗中培養(yǎng) 2-3天，培養(yǎng)溫度為2214°C。然后將無菌苗放在散射光下培養(yǎng)2天。(3)將照光培養(yǎng)后的無菌苗移栽到鋪有上層蛭石下層壤土的花盆中，并用蛭石覆蓋植株頂部。然后讓植株在自然光照下生長，日溫2218°C，夜溫15-21°C，隔天澆灌1/2改良MS培養(yǎng)基無機鹽。
轉(zhuǎn)化植株篩選與定植轉(zhuǎn)化植株長出3片葉后，噴灑除草劑Finale· (Hoechst Schering AgrEvo GmbH，含有除草劑glufosinate ammonium)水溶液，濃度為9. 6ml 10. 8ml Finale /L，以植株掉液滴為宜。未轉(zhuǎn)化對照植株在噴灑后4天后停止生長，9天后開始死亡。轉(zhuǎn)化植株在噴灑后，一些個體變化同對照植株相似，另一些個體持續(xù)生長，變化不明顯。待存活植株長到5葉時， 將其定植到田間，套袋自交結(jié)籽。轉(zhuǎn)基因植株子代分析Tl代植株長到3葉期用10. 8ml Finale /L水溶液處理，觀察統(tǒng)計抗性和敏感性個體比例；采用PCR技術(shù)檢測外源基因，并統(tǒng)計外源基因在子代植株中的分離比例。存活植株移栽到大田，套袋自交。T2代植株除套袋自交結(jié)籽外，采用PCR技術(shù)檢測外源基因進行 Southern blotting驗證，并采用RT-PCR技術(shù)檢查轉(zhuǎn)基因表達強度。對于入選的轉(zhuǎn)基因株系觀察根系構(gòu)型，測定3-7葉期小苗生長速率及根冠比，測定單株產(chǎn)量和生物量，并以未轉(zhuǎn)基因植株為對照。選出優(yōu)良的轉(zhuǎn)基因株系后在大田栽培條件下進行玉米產(chǎn)量性狀的觀測和比較。轉(zhuǎn)基因玉米植株的根系形態(tài)觀察、營養(yǎng)吸收特性和耐旱耐低磷特性及生產(chǎn)力測定的詳細步驟見發(fā)明內(nèi)容。在轉(zhuǎn)ZmPINlb基因的株系中，轉(zhuǎn)正義基因株系的目標基因表達量均有不同程度的提高，但在反義株系中表達量下降幅度小，最低表達量約為對照植株的60%。ZmPINlb在幼葉中的表達量高于根中。轉(zhuǎn)ZmPINlb基因植株與WT植株在地上部形態(tài)和生長速率等方面無明顯差別，過表達ZmPINlb基因植株的根系比WT和轉(zhuǎn)反義基因植株的發(fā)達。轉(zhuǎn)ZmPINlb 基因植株生物量分析的結(jié)果表明，在6個轉(zhuǎn)正義基因株系中有4個株系的莖葉干重略高于對照株的，只有1個株系的莖葉干重低于對照的；而根系干重表現(xiàn)出有較大差異，多數(shù)轉(zhuǎn)正義基因植株的根干重顯著高于對照植株的。在4個轉(zhuǎn)反義ZmPINlb基因的株系中，2個株系的莖葉及根干重與對照植株相近，2個株系的莖葉干重顯著低于對照植株的，即轉(zhuǎn)反義 ZmPINlb基因的植株表現(xiàn)出生長與野生型相近或較慢。供磷水平對轉(zhuǎn)ZmPINlb基因植株生物量及形態(tài)特征的影響T3代轉(zhuǎn)ZmPINlb基因植株和對照植株(WT)在不同供磷水平的營養(yǎng)液中培養(yǎng)至V6 期，分別測量轉(zhuǎn)基因和對照植株的根長度、根數(shù)目，測定莖葉和根系的生物量。當植株在低磷營養(yǎng)液中生長時，對照植株的根數(shù)目下降，為足磷條件下的88%，這與低磷脅迫能減少玉米側(cè)根數(shù)目的觀察結(jié)果相一致。比較各株系對低磷脅迫的反應，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)正義或反義基因的植株都表現(xiàn)出對低磷脅迫的敏感性降低，側(cè)根數(shù)、總根數(shù)和足磷培養(yǎng)液中生長的植株相差不大或相對較高。這一現(xiàn)象在植株生物量的變化中也存在。即向玉米骨干自交系引入玉米 Prnib基因時，影響了玉米在低磷脅迫條件下根系的適應性變化。將對照株系和來自不同獨立轉(zhuǎn)化體的轉(zhuǎn)基因純合株系的種子播于大小一致、蛭石含量一致的無蓋大箱中。3葉期定苗，隔天澆灌去掉磷酸鹽的1/2MS營養(yǎng)液或1/2MS營養(yǎng)液。待植株長至6葉期時，洗去蛭石，輕輕分離玉米根系，再用自來水洗凈后照相，烘干并測定根系和地上部的生物量，計算根冠比，根系發(fā)達的株系并檢測它們的耐低磷特性。耐旱性測定見發(fā)明內(nèi)容和實例1。入選的株系具有發(fā)達的根系且耐低磷耐旱特性明顯優(yōu)于未轉(zhuǎn)基因自交系，可用于配制玉米雜交種。實施例3 轉(zhuǎn)I^rsp: ZmPINla或I^rsp: ZmPINlc基因創(chuàng)造高粱抗倒伏耐低磷材料
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融合基因及植物表達載體的構(gòu)建將測序驗正的ZmPINla 和 ZmPINlc 分別重組到 pCAMBIA_Prsp :MCS-Tnos_P35S: :bar(pRPB)中。該載體含有由P35S啟動的除草劑草丁膦抗性基因bar和I^rsp啟動的目的基因插盒。在構(gòu)建好的植物表達載體中ZmPINla或ZmPINlc可分別以正義形式插入到多克隆位點MCS，得到所需質(zhì)粒。后者經(jīng)酶切鑒定或測序鑒定后，采用液氮速凍法導入農(nóng)桿菌 LBA4404或其它菌株中，用于農(nóng)桿菌介導的高粱遺傳轉(zhuǎn)化。高粱無菌苗獲得高粱優(yōu)良基因型種子用70%乙醇浸泡2分鐘，再用0. 氯化汞浸泡8-12分鐘， 然后用無菌水洗滌3-5遍。滅菌期間不斷晃動種子，以保證表面滅菌徹底。滅菌后種子放在無菌三角瓶內(nèi)萌發(fā)，瓶內(nèi)放入少量無菌水于黑暗條件)下1-2天。待種子萌動 (露白)后，將其放在改良MS培養(yǎng)基上于黑暗條件下萌發(fā)。待胚芽伸長止3-4厘米時，剝離胚芽鞘及2-3片幼葉，露出莖尖頂端生長錐。農(nóng)桿菌培養(yǎng)及活化將帶有雙元載體(Mini-Ti質(zhì)粒 pCAMBIA-Prsp :ZmPINla-Tnos-P35S: :bar 或 pC AMBIA-Prsp :ZmPINlc-Tnos-P35S: :bar)的根瘤農(nóng)桿菌(EHA105 或 LBA4404)在附加抗生素的LB培養(yǎng)基中下震蕩培養(yǎng)，震蕩速率為llOr/min，使細菌處于對數(shù)生長期。然后在 3000r/min下離心10分鐘，棄上清液。菌體用1/2MS液體培養(yǎng)基洗滌，離心收集。再將菌體用添加ΙΟΟμπιοΙ/l乙酰丁香酮的1/2MS液體培養(yǎng)基懸浮，稀釋5_20倍用于轉(zhuǎn)化。高粱無菌苗轉(zhuǎn)化(1)將菌液倒在4. 5厘米直徑的培養(yǎng)皿中，傾斜培養(yǎng)皿，使露出莖尖生長錐的無菌苗浸泡在菌液中，在0. 5 X IO5Pa大氣壓下處理8-12分鐘。(2)浸染后的芽尖用無菌濾紙吸干，萌發(fā)種子放在改良MS培養(yǎng)基上于黑暗中培養(yǎng) 2-3天，培養(yǎng)溫度為2214°C。然后將無菌苗放在散射光下培養(yǎng)2天。(3)將照光培養(yǎng)后的無菌苗移栽到鋪有上層蛭石下層壤土的花盆中，并用蛭石覆蓋植株頂部。然后讓植株在自然光照下生長，日溫2218°C，夜溫15-21°C，隔天澆灌1/2改良MS培養(yǎng)基無機鹽。轉(zhuǎn)化植株篩選與定植轉(zhuǎn)化植株長出3片葉后，噴灑除草劑Finale (Hoechst Schering AgrEvo GmbH，含有除草劑glufosinate ammonium)水溶液，濃度為9. 6ml_10. 8ml Finale /L，以植株掉液滴為宜。未轉(zhuǎn)化對照植株在噴灑后4天后停止生長，9天后開始死亡。轉(zhuǎn)化植株在噴灑后，一些個體變化同對照植株相似，另一些個體持續(xù)生長，變化不明顯。待存活植株長到5葉時，將其定植到田間，套袋自交結(jié)籽。轉(zhuǎn)基因植株子代分析Tl代植株長到3葉期用10. 8ml Finale /L水溶液處理，觀察統(tǒng)計抗性和敏感性個體比例；采用PCR技術(shù)檢測外源基因，并統(tǒng)計外源基因在子代植株中的分離比例。存活植株移栽到大田，套袋自交。T2代植株除套袋自交結(jié)籽外，采用PCR技術(shù)檢測外源基因并進行 Southern blotting驗證，采用RT-PCR技術(shù)檢查轉(zhuǎn)基因表達強度。對于入選的轉(zhuǎn)基因株系觀察根系構(gòu)型，測定3-7葉期小苗生長速率及根冠比，測定單株產(chǎn)量和生物量，并以未轉(zhuǎn)基因植株為對照。選出優(yōu)良的轉(zhuǎn)基因株系后在大田栽培條件下進行產(chǎn)量性狀的觀測和比較。轉(zhuǎn)基因高粱植株的根系形態(tài)觀察、營養(yǎng)吸收特性和耐旱耐低磷特性及生產(chǎn)力測定的詳細步驟類同于玉米。
權(quán)利要求
1.生長素輸出載體Pmi家族基因在玉米、高粱育種中的應用，其特征是克隆出Pim 家族基因，通過與不同啟動子融合構(gòu)建融合基因，采用轉(zhuǎn)基因技術(shù)將融合基因?qū)胗衩住?高粱，產(chǎn)生生長素濃度梯度發(fā)生變化而導致植株性狀發(fā)生改變的工程植株及其后代，用于玉米、高粱的遺傳改良；其中所述Pmi家族基因克隆于不同的高等植物，并且同一物種的 PINl家族基因可為1個或數(shù)個；所述Pim家族基因是完整或部分CDNA基因形式、完整或部分基因組基因形式、或它們的RNAi結(jié)構(gòu)。
2.如權(quán)利要求ι所述生長素輸出載體Pim家族基因在玉米、高粱育種中的應用，其特征是克隆出Pmi家族基因通過與不同啟動子連接形成融合基因，不同Pmi基因可單獨或聯(lián)合重組到植物表達載體中，利用啟動子控制轉(zhuǎn)基因的表達強度和特異性。
3.如權(quán)利要求2所述生長素輸出載體Pim家族基因在玉米、高粱育種中的應用，其特征是所述融合基因用于玉米、高粱轉(zhuǎn)基因，不同Pmi基因可單獨或聯(lián)合轉(zhuǎn)入受體植物，產(chǎn)生生長素濃度梯度發(fā)生該變的轉(zhuǎn)基因植株。
4.如權(quán)利要求ι所述生長素輸出載體Pim家族基因在玉米、高粱育種中的應用，其特征是所述Pmi家族成員基因包括從不同高等植物中克隆的與玉米中ZmPmia、ZmPINlb, ZmPINlc和ZmPINld編碼的多肽序列相近或相同的蛋白基因，也包括人工合成或由不同多聚脫氧核苷酸序列片段重組而成的核苷酸序列，即功能相近和相同的編碼蛋白的基因。
5.如權(quán)利要求ι所述生長素輸出載體Pim家族基因在玉米、高粱育種中的應用，其特征是所述轉(zhuǎn)基因植株及其后代通過篩選和測定，選出遺傳穩(wěn)定且目標性狀顯明改變的株系用于玉米、高粱的遺傳改良。
6.如權(quán)利要求1或5所述生長素輸出載體Pim家族基因在玉米、高粱育種中的應用， 其特征是全長或部分序列的Pim家族基因重組到中間質(zhì)粒中與所需的啟動子融合構(gòu)建融合基因，再將融合基因重組到植物表達載體中，其中選用的啟動子有根特異性的、莖特異性的、果穗特異性的或誘導型的。
7.如權(quán)利要求ι所述生長素輸出載體Pim家族基因在玉米、高粱育種中的應用，其特征是通過檢測轉(zhuǎn)基因表達和對轉(zhuǎn)基因株系進行性狀鑒定，篩選出目標性狀明顯改變的轉(zhuǎn)基因植株，創(chuàng)造出在育種中具有應用前景的新種質(zhì)。
8.如權(quán)利要求ι所述生長素輸出載體Pim家族基因在玉米、高粱育種中的應用，其特征是從普通栽培玉米和玉米近緣種或亞種中克隆出ZmPmia、ZmPINlb和ZmPINlc基因，將它們分別與根特異表達的啟動子I^rsp融合，重組到不同的植物表達載體中，轉(zhuǎn)入玉米優(yōu)良自交系，獲得根系發(fā)達、株高降低、耐低磷特性和耐旱性大幅度提高的轉(zhuǎn)基因株系并用于玉米育種。
9.如權(quán)利要求ι所述生長素輸出載體Pim家族基因在玉米、高粱育種中的應用，其特征是從普通栽培玉米和玉米近緣種或亞種中克隆出ZmPINla和ZmPINlb基因，將它們分別與根特異表達的啟動子I^rsp融合，重組到不同的植物表達載體中，轉(zhuǎn)入高粱優(yōu)良品種中， 獲得根系發(fā)達、株高降低、耐低磷特性顯著提高的轉(zhuǎn)基因株系并用于高粱育種。
全文摘要
本發(fā)明公開一種生長素輸出載體PIN1家族基因在玉米、高粱育種中的應用，是從不同高等植物中克隆出PIN1家族基因的不同成員，通過分別與不同啟動子連接構(gòu)建融合基因，采用轉(zhuǎn)基因技術(shù)將重組基因?qū)胗衩?、高粱細胞，獲得轉(zhuǎn)基因植株及其后代，篩選生長素濃度梯度發(fā)生變化導致植株性狀發(fā)生改變的工程植株，創(chuàng)造出在玉米、高粱育種中具有應用前景的新種質(zhì)。
文檔編號C12N15/84GK102296084SQ20111026064
公開日2011年12月28日 申請日期2011年9月5日 優(yōu)先權(quán)日2011年9月5日
發(fā)明者張舉仁, 張新蕊, 李朝霞 申請人:山東大學