專利名稱：轉(zhuǎn)葡糖苷酶及其制備和固定化方法
技術領域：
本發(fā)明屬于酶工程和發(fā)酵工程領域，涉及一種轉(zhuǎn)葡糖苷酶及其制備和固定化方法。具體是以從土壤中篩選的黑曲霉菌株Us/^r^/BM )BLB-16為出發(fā)菌株，經(jīng)誘變、篩選得到優(yōu)化菌株BLB-28，并經(jīng)發(fā)酵、除菌、濃縮制備轉(zhuǎn)葡糖苷酶液，還涉及該轉(zhuǎn)葡糖苷酶的固定化技術。
背景技術：
轉(zhuǎn)葡糖苷酶(Transglucosidase)，也稱為葡萄糖轉(zhuǎn)苷酶、α -葡萄糖苷酶、α-轉(zhuǎn)移葡萄糖苷酶、α-D-葡萄糖轉(zhuǎn)苷酶等，依據(jù)《酶的命名和國際分類編號》，屬于轉(zhuǎn)移酶類，具體為 EC 2. 4. 1. 24，CAS 為 9030-12-0。按照《食品添加劑使用衛(wèi)生標準》(GB2760)的分類標準，轉(zhuǎn)葡糖苷酶是一種酶制劑，屬于食品工業(yè)用加工助劑。轉(zhuǎn)葡萄苷酶主要作用是從底物的非還原端切開α -1，4糖苷鍵，釋放出α _D_葡萄糖，或?qū)⒂坞x出的葡萄糖殘基以α-1，6糖苷鍵轉(zhuǎn)移到另一個糖類底物上，從而得到低聚異
麥芽糖。低聚異麥芽糖是由2-10個單糖分子通過α _1，6糖苷鍵構(gòu)成的功能性低聚糖，主要成分為異麥芽糖、潘糖、異麥芽三糖及四糖以上的低聚糖。天然存在于蜂蜜等眾多食品中，由于人體消化道內(nèi)沒有分解低聚異麥芽糖的酶，因此，它在攝入人體后，具有不被人體消化吸收、促進腸道有益菌群增殖、潤腸通便、調(diào)節(jié)血脂、低甜度、低熱量等獨特功效，尤其是在促進腸道有益菌群的增值方面功效顯著。已被廣泛應用于乳制品、可可制品、糖果類、 焙烤食品、冷凍飲品、飲料、酒類、肉制品、果凍、油炸食品、膨化食品、嬰幼兒食品等。目前， 國內(nèi)年消費量在數(shù)十萬噸。但是，轉(zhuǎn)葡糖苷酶作為低聚異麥芽糖生產(chǎn)中最關鍵的酶制劑，在國內(nèi)卻一直沒有實現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)。目前，該酶制劑完全依賴進口，這不僅使得在低聚異麥芽糖的生產(chǎn)中，關鍵技術被國外相關企業(yè)控制，更使得低聚異麥芽糖生產(chǎn)中，酶制劑使用成本高居不下?，F(xiàn)在，在國內(nèi)，轉(zhuǎn)葡糖苷酶已經(jīng)引起很多科技工作者的關注，但是，一方面篩選的野生菌株其轉(zhuǎn)葡糖苷酶的表達量非常低，難以實現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)；另一方面，采用基因工程技術構(gòu)建的大腸桿菌代謝生產(chǎn)一般是胞內(nèi)酶，其提取工藝復雜，酶活回收率低，也不利用工業(yè)化生產(chǎn)。因此，有必要開發(fā)研制一種胞外轉(zhuǎn)葡糖苷酶，以適應低聚異麥芽糖生產(chǎn)的需要。本發(fā)明篩選獲得了一株可以發(fā)酵代謝生產(chǎn)胞外轉(zhuǎn)葡糖苷酶的黑曲霉，并通過誘變優(yōu)化篩選獲得了黑曲霉BLB-28，提高了其轉(zhuǎn)葡糖苷酶的表達量，并采用先進的除菌、純化、 濃縮技術，制備該酶制劑，并通過開發(fā)轉(zhuǎn)葡糖苷酶的固定化技術，實現(xiàn)該酶制劑的高效循環(huán)利用，不僅實現(xiàn)了該酶制劑的國產(chǎn)化，大大改善國內(nèi)轉(zhuǎn)葡糖苷酶受制于國際市場的局面，而且能夠大幅降低低聚異麥芽糖生產(chǎn)中酶的使用成本。同時，本發(fā)明在進行酶制劑固定化技術的開發(fā)中，采用了樹脂吸附-海藻酸鈉包埋-戊二醛交聯(lián)法固定化技術，突破了轉(zhuǎn)葡糖苷酶固定化中的技術局限，即一是突破了僅采用樹脂加戊二醛交聯(lián)固定化技術中，由于固定化不夠牢固，而使得固定化酶易于脫落、泄露，增加了后續(xù)工藝精制、純化低聚異麥芽糖的難度等難題；二是突破了僅采用海藻酸鈉包埋加CaCl2硬化固定化技術中，由于硬度較低，難以在大型填充柱中使用，而直接添加至糖液中，則需過濾，增加了工藝的復雜性等難題。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個目的是提供一種黑曲霉菌株識7ΛΛ5 niger) BLB-28，它是以從土壤中篩選的黑曲霉(Aspergillus /7i>er)BLB-16為出發(fā)菌株，經(jīng)紫外線+LiCl復合誘變，并經(jīng)篩選獲得；該菌株已于2011年8月16日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)，地址為北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，中國科學院微生物研究所內(nèi)，保藏號CGMCC No 5143。本發(fā)明的另一個目的在于提供一種轉(zhuǎn)葡糖苷酶，它是應用黑曲霉菌株 {AspergillusBLB18發(fā)酵制得。該酶制劑為低聚異麥芽糖生產(chǎn)中的關鍵酶制劑。 其主要作用是在以淀粉為原料的生產(chǎn)過程中，在淀粉經(jīng)液化和糖化后，進行轉(zhuǎn)苷，即將底物的非還原端切開α-1，4糖苷鍵，釋放出α-D-葡萄糖，或?qū)⒂坞x出的葡萄糖殘基以α _1，6 糖苷鍵轉(zhuǎn)移到另一個糖類底物上，從而得到低聚異麥芽糖；采用本發(fā)明中的轉(zhuǎn)葡糖苷酶生產(chǎn)低聚糖，與采用進口酶制劑相比，酶制劑使用成本降低300-400元。本發(fā)明的再一個目的在于提供一種轉(zhuǎn)葡糖苷酶的制備方法，包括轉(zhuǎn)葡糖苷酶液和固定化轉(zhuǎn)葡糖苷酶的制備方法，即以本發(fā)明人優(yōu)化所得的黑曲霉(Aspergillus niger) BLB-28為發(fā)酵菌株，經(jīng)種子培養(yǎng)、發(fā)酵、超濾除菌、納濾濃縮制備轉(zhuǎn)葡糖苷酶液；
上述制備方法中所說的種子培養(yǎng)的培養(yǎng)基組成為葡萄糖300-500g/L、酵母膏16g/L、 瓊脂粉 18g/L、磷酸二氫鉀 1. 2 g/L、硫酸鎂 0. 45g/L、尿素 lg/L，pH5. 5-6. 0。所說的發(fā)酵的培養(yǎng)基組成為葡萄糖300_500g/L、酵母膏18g/L、瓊脂粉15g/L、磷酸二氫鉀 1. 5 g/L、硫酸鎂 0. 5g/L、尿素 2g/L，pH5. 5-6. 0。所說的超濾除菌采用陶瓷復合膜過濾除菌除菌及純化。所說的納濾濃縮采用有機復合納濾膜濃縮及純化。將上述方法所制得的轉(zhuǎn)葡糖苷酶液，經(jīng)樹脂吸附-海藻酸鈉包埋-戊二醛交聯(lián)法固定化，即制得固定化轉(zhuǎn)葡糖苷酶。采用此項技術制備的固定化轉(zhuǎn)葡糖苷酶，不僅穩(wěn)定性高，而且酶制劑不易泄露，利于低聚異麥芽糖產(chǎn)品純化，提高產(chǎn)品品質(zhì)，降低產(chǎn)品成本。采用固定化酶生產(chǎn)低聚糖，與比采用本發(fā)明中制備的轉(zhuǎn)葡糖苷酶液相比，降低酶制劑使用成本100-150元。本發(fā)明技術方案所述轉(zhuǎn)葡糖苷酶液和固定化轉(zhuǎn)葡糖苷酶的制備方法包括以下具體步驟
(一)菌種篩選
黑曲霉(Aspergillus niger) BLB-16分離自禹城市開發(fā)區(qū)農(nóng)田土壤，分離培養(yǎng)基為普
通營養(yǎng)培養(yǎng)基。黑曲霉(Aspergillus niger) BLB-16的分離方法為在無菌室中，以無菌水配置 10%的土壤水溶液，并按10°、IO1UO2UO3,104、105、IO6的稀釋倍數(shù)稀釋，稀釋完畢后，分別去 200U1于平板分離培養(yǎng)基之上，用涂布棒涂布均勻，培養(yǎng)至平板上長出成熟菌落，鑒定并純化出黑曲霉菌落，將但菌落接種斜面，培養(yǎng)。以斜面培養(yǎng)菌落接種搖瓶培養(yǎng)基，初篩，測定酶活力。根據(jù)搖瓶培養(yǎng)酶活力篩選出BLB-16菌株。酶活性檢測方法以無色的對硝基苯酚-α -D-吡喃葡萄糖苷(pNPG)作反應底物， 經(jīng)α-葡萄糖苷酶水解α-1，4-葡萄糖苷鍵后釋放出對硝基苯酚(pNP)，通過檢測405nm下的PNP產(chǎn)生量作為α-1，4-葡萄糖苷酶活性大小的判定標準。(注底物 pNPG (上海西寶),全稱 4-nitrophenyl-2-D-galactopyranoside ；在上述檢測方法中，每分鐘催化產(chǎn)生lymol pNP的酶量為一個活力單位(U)。)
分離培養(yǎng)基為土豆200g去皮，切塊煮沸30min，然后用紗布過濾，再加葡萄糖 20g及瓊脂20g，溶化后補水至1000ml, pH自然。斜面培養(yǎng)基為土豆200g去皮，切塊煮沸并保持30min，然后用紗布過濾，再加葡萄糖22g及瓊脂20g，待其融化后，補水至1000ml，pH自然。搖瓶培養(yǎng)基為麥芽糖粉300-500g/L，酵母膏15g/L，蛋白胨15g/L，磷酸氫二鉀 lg/L，磷酸二氫鉀 0. 5g/L，尿素 5g/L，PH5. 5-6. 0。(二)酶制劑生產(chǎn)工藝流程 1)步驟1--菌種的誘變
由從土壤中篩選的黑曲霉BLB-16為出發(fā)菌種，經(jīng)紫外線+NaN3復合誘變，并經(jīng)篩選獲得黑曲霉 BLB-28 (CGMCC No 5143)。具體誘變過程為接種環(huán)挑取適量黑曲霉BLB-16斜面孢子于無菌的含1. 5% NaN3 溶液的三角瓶中，磁力震蕩攪拌均勻，培養(yǎng)18-30h，孢子萌發(fā)。將孢子懸液倒入含無菌大頭針的無菌平皿，保持平皿蓋打開，在事先預熱過的15W的紫外燈下20cm處照射0s、20s、40s、 60s、80s、100s、120s，不同照射劑量的菌液稀釋至10—1，黑暗處放置1_濁。用生理鹽水分別稀釋至10_3，用移液槍吸取稀釋好的菌液100 μ L，涂布麥芽瓊脂培養(yǎng)基篩選平板，每個稀釋度涂布3個平板。將涂好的平皿用黑布包好，置生化培養(yǎng)箱培養(yǎng)4-5d，統(tǒng)計致死率。菌種篩選以誘變前的黑曲霉出發(fā)菌株BLB-16為對照，對誘變后的菌株進行發(fā)酵培養(yǎng)產(chǎn)酶及轉(zhuǎn)葡糖苷酶活性檢測。酶活性檢測同菌種篩選時酶活檢測方法一致。篩選出高轉(zhuǎn)葡糖苷酶生產(chǎn)菌株，即黑曲霉U^er^iV^As / i沢r) BLB-28。2)步驟2—菌種活化
將低溫保藏的黑曲霉菌株(Aspergillus niger) BLB-28,經(jīng)一級種子培養(yǎng)進行活化， 二級種子培養(yǎng)進行擴大培養(yǎng)。培養(yǎng)條件為PH5. 5-6. 0，培養(yǎng)溫度為25-40°C，培養(yǎng)時間 18-24h0其中一級種子培養(yǎng)、二級種子培養(yǎng)基為葡萄糖300_500g/L、酵母膏16 g/L、瓊脂粉 18g/L、磷酸二氫鉀 1. 2 g/L、硫酸鎂 0. 45g/L、尿素 lg/L，pH5. 5-6. 0
3)步驟3-發(fā)酵
將經(jīng)過擴大培養(yǎng)的種子接種于發(fā)酵培養(yǎng)基，進行發(fā)酵培養(yǎng)。其中，接種量為5-12% (V/ V)，發(fā)酵條件為pH5. 5-6. 0，培養(yǎng)溫度為25-40°C，溶氧為觀_30%，發(fā)酵時間96_120h。發(fā)酵培養(yǎng)基組成為葡萄糖300-500g/L、酵母膏18 g/L、瓊脂粉15g/L、磷酸二氫鉀 1. 5 g/L、硫酸鎂 0. 5g/L、尿素 2g/L，pH5. 5-6. 0。發(fā)酵液酶活檢測方法與菌種篩選是酶活檢測方法相同。
4)步驟4—超濾除菌
采用陶瓷膜超濾，除去發(fā)酵菌體，制備轉(zhuǎn)葡糖苷酶液。超濾除菌的條件為壓力 1. 5-2. 5MPa，溫度4-25°C;陶瓷膜截留分子量為150-200 kDa，超濾除菌及其大分子物質(zhì)，初步純化轉(zhuǎn)葡糖苷酶。5)步驟5—納濾濃縮
采用有機復合納濾膜進行濃縮。操作條件為壓力2. 0-3. OMPa，溫度4-25°C;有機復合納濾膜截留分子量200-2000Da，濃縮的同時，去除無機鹽及其小分子物質(zhì)，制備轉(zhuǎn)葡糖苷酶液。濃縮后酶活檢測方法與菌種篩選時酶活檢測方法相同。6)步驟6—酶的固定化
樹脂吸附-海藻酸鈉包埋-戊二醛交聯(lián)法固定化，制備固定化酶。固定化條件為室溫下，在轉(zhuǎn)葡糖苷酶液中加入一定量的D301 (R)型樹脂，振蕩吸附8-1 后濾出；再用3%海藻酸鈉包埋后，浸泡于0. lmol/L CaCl2溶液中硬化4h，濾出，最后將其浸泡于1. 5-2. 0%的戊二醛溶液1.證，濾出，即得到固定化酶。7 )步驟7—固定化酶活性及穩(wěn)定性檢測
將固定化酶裝柱，配制PH5. 0-6. 0的麥芽糖液，按一定的流速過柱，流速0. 6-1. 8倍柱體積/h，溫度50-60°C，不間斷進行實驗，定期取樣檢測低聚異麥芽糖產(chǎn)品組分。固定化酶活性，以低聚異麥芽糖產(chǎn)品組分達到市場銷售的低聚異麥芽糖(IM050) 的指標為標準，反應固定化酶的活性。固定化酶穩(wěn)定性以固定化酶在有活性的期間內(nèi)生產(chǎn)合格的IM050的總量作為考察標準。本發(fā)明優(yōu)化所得菌種發(fā)酵酶活6-8U/ml，野生菌的發(fā)酵酶活僅為0. 08-0. 12U/ml, 發(fā)酵酶活大大提高。本發(fā)明所采用固定化技術為樹脂吸附-海藻酸鈉包埋-戊二醛交聯(lián)法固定化技術，酶活轉(zhuǎn)化率達到85%以上，該技術突破了傳統(tǒng)轉(zhuǎn)葡糖苷酶固定化中的局限一方面采用樹脂為載體，固定化轉(zhuǎn)葡糖苷酶，保證了固定化成品的硬度，可以在大型填充柱中使用，簡化了生產(chǎn)工藝；另一方面，在樹脂固定化后以海藻酸鈉包埋，置于CaCl2溶液中硬化，最后采用戊二醛交聯(lián)，增強了固定化酶的穩(wěn)定性，避免了酶制劑的泄露，從而轉(zhuǎn)葡糖苷酶可以重復利用，大大提高了酶的利用率，降低了產(chǎn)品生產(chǎn)成本。采用此固定化技術，與僅采用樹脂固定化并以戊二醛交聯(lián)的固定化方法相比，酶穩(wěn)定性更高，如以生產(chǎn)低聚異麥芽糖的批次來計，前者可生產(chǎn)8-10批次合格產(chǎn)品，而后者僅可生產(chǎn)2-3批次產(chǎn)品。采用此固定化技術，與僅采用海藻酸鈉包埋并以CaCl2硬化固定化技術相比，后者需要將固定化酶制劑直接添加至糖液中，反應結(jié)束后，需要過濾共去除固定化酶；而后者，則可以使糖液直接過柱，不需要過濾，簡化了生產(chǎn)工藝。本發(fā)明所制備的轉(zhuǎn)葡糖苷酶主要應用領域為食品、藥品、飼料等工業(yè)領域，應用于低聚異麥芽糖的生產(chǎn)。本發(fā)明一種轉(zhuǎn)葡糖苷酶的制備及其固定化技術，具有以下優(yōu)點
1)優(yōu)化后菌株的發(fā)酵酶活可達到6-8U，與野生黑曲霉0. 08-0. 12U相比，酶活得到了大幅提升，易于實現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化。
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2)采用陶瓷膜超濾除菌及納濾濃縮一體化技術，實現(xiàn)了除菌、濃縮、純化一步完成，降低酶在生產(chǎn)過程中的損耗，縮短了生產(chǎn)周期，提高了生產(chǎn)效率。3)采用樹脂吸附-海藻酸鈉包埋-戊二醛交聯(lián)法固定化，在國內(nèi)，首次實現(xiàn)了轉(zhuǎn)葡糖苷酶的固定化，提高了酶的利用率，有利于低聚異麥芽糖生產(chǎn)工藝簡化，并提高低聚異麥芽糖產(chǎn)品品質(zhì)。
具體實施例方式實施例1
配制pH5. 4，糖濃30%的麥芽糖液；取進口轉(zhuǎn)葡糖苷酶液(酶活約為57-58U/ml)，按 0. 85L/噸干物質(zhì)加入麥芽糖液中，置于58-60°C水浴鍋中，保溫30h ；取樣，置于沸水浴中 15-20min，滅酶，采用液相色譜檢測技術，分析產(chǎn)品低聚異麥芽糖組分。實施例2
將低溫保藏的黑曲霉菌株(Aspergillus niger ) BLB-28，在pH6. 0、32 °C條件下，培養(yǎng) 20h，進行一級種子培養(yǎng)活化，二級種子擴大培養(yǎng)；將經(jīng)過擴大培養(yǎng)的種子按接種量為10% (V/V)，接種于發(fā)酵培養(yǎng)基，在pH5. 5-6. 0，30-34°C的條件下進行發(fā)酵，發(fā)酵時間為110h，發(fā)酵結(jié)束后，采用截留分子量150-200 kDa陶瓷膜，在1. 5-2. 5MPa，10°C，超濾除去發(fā)酵菌體及其他大分子物質(zhì)；采用留分子量200-2000Da的納濾膜，在2. 0-3. OMPa, 10°C超濾濃縮，同時去除無機鹽及其小分子物質(zhì)，制得轉(zhuǎn)葡糖苷酶液，酶活為60-65U。配制pH5. 4，糖濃30%的麥芽糖液；取濃縮后的轉(zhuǎn)葡糖苷酶液，按0. 72L/噸干物質(zhì)加入麥芽糖液中，置于陽_581水浴鍋中，保溫30h ；取樣，置于沸水浴中15-20min，滅酶，采用液相色譜檢測技術，分析產(chǎn)品低聚異麥芽糖組分。實施例3
將低溫保藏的黑曲霉菌株(Aspergillus niger ) BLB-28，在pH5. 6、31°C條件下，培養(yǎng) 20h，進行一級種子培養(yǎng)活化，二級種子擴大培養(yǎng)；將經(jīng)過擴大培養(yǎng)的種子按接種量為8% (V/V)，接種于發(fā)酵培養(yǎng)基，在pH5. 5-6.0，30-35°C的條件下進行發(fā)酵，發(fā)酵時間為IOOh ；發(fā)酵結(jié)束后，采用截留分子量150-200 kDa陶瓷膜，在1. 5-2. 5MPa，20°C，超濾除去發(fā)酵菌體及其他大分子物質(zhì)；采用留分子量200-2000Da的納濾膜，在2. 0-3. OMPa，20°C超濾濃縮，同時去除無機鹽及其小分子物質(zhì)，制得轉(zhuǎn)葡糖苷酶液，并將酶液濃縮10倍。樹脂吸附-海藻酸鈉包埋-戊二醛交聯(lián)法固定化。室溫下，在IL轉(zhuǎn)葡糖苷酶液中加入UkgD301 (R)型樹脂，振蕩吸附他后濾出；再用3%海藻酸鈉1.5L包埋，浸泡于 0. lmol/L CaCl2溶液5L中硬化4h，濾出，最后將其于1. 5%的戊二醛溶液3L中浸泡1. 5h， 濾出，即得到固定化酶。將固定化酶裝柱，配制pH5. 4，糖濃30%的麥芽糖液，于52°C下，以流速1倍柱體積 /h，不間斷進行實驗，定期取樣檢測低聚異麥芽糖產(chǎn)品組分，并統(tǒng)計合格IM050液總產(chǎn)量。實施例4
將低溫保藏的黑曲霉菌株(Aspergillus niger ) BLB-28，在pH5. 8、33 °C條件下，培養(yǎng) 22h，進行一級種子培養(yǎng)活化，二級種子擴大培養(yǎng)；將經(jīng)過擴大培養(yǎng)的種子按接種量為10% (V/V)，接種于發(fā)酵培養(yǎng)基，在pH5. 5-6.0，28-32°C的條件下進行發(fā)酵，發(fā)酵時間為IlOh ；發(fā)酵結(jié)束后，采用截留分子量150-200 kDa陶瓷膜，在1. 5-2. 5MPa，15°C，超濾除去發(fā)酵菌體及其他大分子物質(zhì)；采用留分子量200-2000Da的納濾膜，在2. 0-3. OMPa, 15°C超濾濃縮，同時去除無機鹽及其小分子物質(zhì)，制得轉(zhuǎn)葡糖苷酶液，并將酶液濃縮10倍。樹脂吸附-海藻酸鈉包埋-戊二醛交聯(lián)法固定化。室溫下，在IL轉(zhuǎn)葡糖苷酶液中加入1. 2kgD301 (R)型樹脂，振蕩吸附IOh后濾出；再用3%海藻酸鈉1. 5L包埋，浸泡于 0. lmol/L CaCl2溶液5L中硬化4h，濾出，最后將其于21的戊二醛溶液3L浸泡1. 5h，濾出， 即得到固定化酶。將固定化酶裝柱，配制pH5. 8，糖濃30%的麥芽糖液，于55°C下，以流速1. 5倍柱體積Λ，不間斷進行實驗，定期取樣檢測低聚異麥芽糖產(chǎn)品組分，并統(tǒng)計合格IM050液總產(chǎn)量。實施例5
將低溫保藏的黑曲霉菌株(Aspergillus niger ) BLB-28，在pH6. 0、33 °C條件下，培養(yǎng) 20h，進行一級種子培養(yǎng)活化，二級種子擴大培養(yǎng)；將經(jīng)過擴大培養(yǎng)的種子按接種量為1 (V/V)，接種于發(fā)酵培養(yǎng)基，在pH5. 5-6.0，32-36°C的條件下進行發(fā)酵，發(fā)酵時間為120h ；發(fā)酵結(jié)束后，采用截留分子量150-200 kDa陶瓷膜，在1. 5-2. 5MPa，10°C，超濾除去發(fā)酵菌體及其他大分子物質(zhì)；采用留分子量200-2000Da的納濾膜，在2. 0-3. OMPa, 10°C超濾濃縮，同時去除無機鹽及其小分子物質(zhì)，制得轉(zhuǎn)葡糖苷酶液，并將酶液濃縮10倍。樹脂吸附-海藻酸鈉包埋-戊二醛交聯(lián)法固定化。室溫下，在IL轉(zhuǎn)葡糖苷酶液中加入1. 2kgD301 (R)型樹脂，振蕩吸附1 后濾出；再用3%海藻酸鈉1. 5L包埋，浸泡于 0. lmol/L CaCl2溶液5L中硬化4h，濾出，最后將其于2. 0%的戊二醛溶液3L浸泡1. 5h，濾出，即得到固定化酶。將固定化酶裝柱，配制pH6. 0，糖濃30%的麥芽糖液，于60°C下，以流速1. 8倍柱體積Λ，不間斷進行實驗，定期取樣檢測低聚異麥芽糖產(chǎn)品組分，并統(tǒng)計合格IM050液總產(chǎn)量。實施例6
取IL轉(zhuǎn)葡糖苷酶液(酶活力61U/ml)，加入IOOOg D301 (R)型樹脂，室溫震蕩吸附9h ； 以80目過濾篩，濾去上清；將固定后的樹脂以3%的海藻酸鈉1. 5L包埋，于室溫下，將其置于0. lmol/L CaCl2的溶液5L中硬化，時間4h;以80目過濾篩過濾；然后將硬化后的固定化酶置于1. 5%的戊二醛溶液3L中浸泡，進行交聯(lián)，1. 5h后，濾除，得固定化酶1800g。固定化酶經(jīng)酶活測定，測定方法與篩選菌種時酶活測定方法相同。經(jīng)測定得，每 50g固定化酶，其酶活為1475U，經(jīng)計算酶活固定化轉(zhuǎn)化率為87%。將固定化酶裝柱，配制pH6. 0，糖濃30%的麥芽糖液，于60°C以流速1. 5倍柱體積/ h，不間斷進行實驗，定期取樣檢測低聚異麥芽糖產(chǎn)品組分，并統(tǒng)計合格500液總產(chǎn)量；最終生產(chǎn)低聚異麥芽糖液(IM050產(chǎn)量以干物質(zhì)濃度為75%產(chǎn)品計)17900L。
權(quán)利要求
1.一種黑曲霉菌株Us/^r^/BM fliger)BLB-28，其特征在于以從土壤中篩選的黑曲霉(Aspergillus )BLB_16為出發(fā)菌株，經(jīng)紫外線+LiCl復合誘變，并經(jīng)篩選獲得；該菌株已于2011年8月16日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號 CGMCC No 5143。
2.一種轉(zhuǎn)葡糖苷酶，其特征在于應用黑曲霉菌株(A^ergiBM /^ger )BLB-28，發(fā)酵制得。
3.如權(quán)利要求2所述轉(zhuǎn)葡糖苷酶的制備方法，其特征在于以黑曲霉(Aspergillus niger)BLB18為發(fā)酵菌株，經(jīng)種子培養(yǎng)、發(fā)酵、超濾除菌、納濾濃縮，制備轉(zhuǎn)葡糖苷酶液。
4.如權(quán)利要求3所述轉(zhuǎn)葡糖苷酶的制備方法，其特征在于所說的種子培養(yǎng)的培養(yǎng)基組成為葡萄糖300-500g/L、酵母膏16 g/L、瓊脂粉18g/L、磷酸二氫鉀1.2 g/L、硫酸鎂 0. 45g/L、尿素 lg/L，ρΗ5· 5-6. 0。
5.如權(quán)利要求3所述轉(zhuǎn)葡糖苷酶的制備方法，其特征在于所說的發(fā)酵的培養(yǎng)基組成為葡萄糖300-500g/L、酵母膏18 g/L、瓊脂粉15g/L、磷酸二氫鉀1. 5 g/L、硫酸鎂0. 5g/ L、尿素 2g/L，pH5. 5-6. 0。
6.如權(quán)利要求3所述轉(zhuǎn)葡糖苷酶的制備方法，其特征在于所說的超濾除菌采用陶瓷復合膜過濾除菌及純化。
7.如權(quán)利要求3所述轉(zhuǎn)葡糖苷酶的制備方法，其特征在于所說的納濾濃縮采用有機復合納濾膜濃縮及純化。
8.如權(quán)利要求2所述轉(zhuǎn)葡糖苷酶的固定化方法，其特征在于將轉(zhuǎn)葡糖苷酶液經(jīng)樹脂吸附-海藻酸鈉包埋-戊二醛交聯(lián)法固定化，制備固定化轉(zhuǎn)葡糖苷酶。
9.如權(quán)利要求3或8所述轉(zhuǎn)葡糖苷酶的制備方法，其特征在于包括以下具體步驟1)步驟1-菌種的誘變篩選；由從土壤中篩選的黑曲霉(Aspergillus niger) BLB-16，經(jīng)紫外線+LiCl復合誘變， 并經(jīng)篩選獲得黑曲霉菌株Usper識7ΛΛ5 niger) BLB-28 ；2)步驟2—菌種活化；將低溫保藏的黑曲霉菌株(Aspergillus niger) BLB-28,經(jīng)一級種子培養(yǎng)進行活化， 二級種子培養(yǎng)進行擴大培養(yǎng)；培養(yǎng)條件為PH5. 5-6.0，培養(yǎng)溫度為25-40°C，培養(yǎng)時間 18-24h ；3)步驟3—發(fā)酵；將經(jīng)過擴大培養(yǎng)的種子接種于發(fā)酵培養(yǎng)基，進行發(fā)酵培養(yǎng)；其中，接種量為5-12% (V/ V)，發(fā)酵條件為pH5. 5-6. 0，培養(yǎng)溫度為25-40°C，溶氧為28_30%，發(fā)酵時間96_120h ；4)步驟4一超濾除菌；采用陶瓷膜超濾，除去發(fā)酵菌體，制備轉(zhuǎn)葡糖苷酶液；操作條件0. 5-1. OMPa, 4-250C ；陶瓷膜截留分子量為150-200 kDa ；5)步驟5—納濾濃縮；采用有機復合納濾膜進行濃縮，操作條件為壓力0. 5-2. OMPa，溫度4_25°C，制備轉(zhuǎn)葡糖苷酶液；有機復合納濾膜截留分子量200-2000Da ；6)步驟6—酶的固定化；樹脂吸附-海藻酸鈉包埋-戊二醛交聯(lián)法固定化，制備固定化酶；固定化條件為室溫下，在轉(zhuǎn)葡糖苷酶液中加入一定量的D301 (R)型樹脂，振蕩吸附8-1 后濾出；再用3%海藻酸鈉包埋，浸泡于0. lmol/L CaCl2溶液中硬化4h，濾出，最后將其浸泡于1. 5-2%的戊二醛溶液1. 5h，濾出，即得到固定化酶；7)步驟7—固定化酶活性及穩(wěn)定性檢測；將固定化酶裝柱，配制PH5. 0-6. 0的麥芽糖液，按一定的流速過柱，流速0. 6-1. 8倍柱體積Λ，不間斷進行實驗，定期取樣檢測低聚異麥芽糖產(chǎn)品組分；葡糖苷酶應用于食品、藥品、飼料工業(yè)領域，用于低聚異麥芽糖的生產(chǎn)。
全文摘要
轉(zhuǎn)葡糖苷酶及其制備和固定化技術，屬于酶工程和發(fā)酵工程領域。具體涉及以下工藝流程1)以從土壤中篩選的黑曲霉(Aspergillus niger)BLB-16為出發(fā)菌株，經(jīng)誘變優(yōu)化、篩選，得優(yōu)化菌株(BLB-28)，進行發(fā)酵；2)發(fā)酵液經(jīng)超濾除菌制得轉(zhuǎn)葡糖苷酶液；3)轉(zhuǎn)葡糖苷酶液經(jīng)納濾濃縮；4)樹脂吸附-海藻酸鈉包埋-戊二醛交聯(lián)法固定化，制備固定化酶。本發(fā)明所制備的轉(zhuǎn)葡糖苷酶適用于食品、醫(yī)藥、飼料等工業(yè)領域應用，用于低聚異麥芽糖的生產(chǎn)。
文檔編號C12N1/14GK102296032SQ201110254748
公開日2011年12月28日 申請日期2011年8月31日 優(yōu)先權(quán)日2011年8月31日
發(fā)明者劉宗利, 李方華, 王乃強, 王彩梅, 袁衛(wèi)濤 申請人:保齡寶生物股份有限公司