專利名稱：一種采用溫度誘導(dǎo)生產(chǎn)重組人表皮生長因子的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物工程領(lǐng)域；更具體地，本發(fā)明涉及通過采用基因工程方法生產(chǎn)重組人表皮生長因子(rhEGF)。
背景技術(shù)：
人表皮生長因子(Humanepidermal growth factor,簡稱 hEGF),是一種由 53 個氨基酸組成的不含糖基的單鏈多肽，分子內(nèi)有三對由6個半胱氨酸組成的二硫鍵，形成3個分子內(nèi)環(huán)型結(jié)構(gòu)，組成生物活性所必須的受體結(jié)合區(qū)域，其分子量為6，216道爾頓，等電點(diǎn)(PD 為 4. 6。hEGF是人體中一個重要的細(xì)胞因子，是類EGF大家族的一個成員，具有多種生物功能，它可促進(jìn)外胚層和中胚層細(xì)胞，如表皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞的增殖，并可維持·其生長；在生物體發(fā)育中，EGF可促進(jìn)新生兒齒、骨和各器官的生長；可促進(jìn)肝細(xì)胞再生；可促進(jìn)胃腸粘膜細(xì)胞生長和保護(hù)粘膜免受損傷等等。rhEGF在臨床上主要應(yīng)用于⑴促進(jìn)燒傷、各種外科創(chuàng)傷和手術(shù)傷口的愈合；⑵促進(jìn)外科潰瘍的愈合，尤其是糖尿病性潰瘍和老爛腳等愈合；(3)用于皮膚、角膜移植；(4)治療角膜損傷和潰瘍；(5)促進(jìn)胃、十二指腸潰瘍愈合。近年來，技術(shù)人員還將其用于鱗狀細(xì)胞癌、皮膚癌的治療，療效顯著。由于EGF分子內(nèi)含有三對二硫鍵，因此對酸、堿、熱等理化因素均較為穩(wěn)定，它是迄今發(fā)現(xiàn)的最穩(wěn)定的多肽?；A(chǔ)研究表明，EGF具有對皮膚表皮基底層細(xì)胞的激活作用，能在分子水平上對細(xì)胞進(jìn)行修復(fù)和調(diào)整，促進(jìn)皮膚細(xì)胞的新陳代謝，并調(diào)節(jié)細(xì)胞中色素的平衡，可以達(dá)到美白、抗皺、延緩衰老的作用。正是由于EGF具有上述特性和作用，因此近年來也被應(yīng)用于化妝品和美容行業(yè)。目前，大規(guī)模制備重組hEGF (rhEGF)多是采用基因工程的方法，所采用的表達(dá)系統(tǒng)主要有大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)、枯草芽孢桿菌表達(dá)系統(tǒng)和酵母表達(dá)系統(tǒng)等。本發(fā)明人在先前的研究中，主要將精力放在采用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)分泌表達(dá)rhEGF的研究上，并取得了很好的效果，比如，將含有大腸桿菌堿性磷酸酯酶啟動子和信號肽的質(zhì)粒pAE-8，轉(zhuǎn)化大腸桿菌宿主菌YK537，得到工程菌株EE-8。該工程菌株在低磷條件下誘導(dǎo)表達(dá)rhEGF，最高表達(dá)量為150mg/l (中國專利號CN00127953.X);又如，將化學(xué)合成全新設(shè)計的phoAspLlO基因及其與hEGF的串聯(lián)基因，構(gòu)建表達(dá)質(zhì)粒pBLlOEGF (該質(zhì)粒含有入噬菌體的啟動子)，進(jìn)而以大腸桿菌BL21 (DE3)作為宿主細(xì)胞構(gòu)建工程菌株BE-2，該菌株采用溫度誘導(dǎo)的方式，分泌表達(dá)rhEGF至384mg/l (中國專利號CN200510025289. 3)。然而，鑒于市場對于hEGF的需求量很大，本領(lǐng)域還有必要進(jìn)行更優(yōu)化的研究，以期進(jìn)一步提高重組hEGF的產(chǎn)量、簡化生產(chǎn)過程或降低生產(chǎn)成本。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種采用溫度誘導(dǎo)生產(chǎn)重組人表皮生長因子的方法；以及用于高效表達(dá)重組人表皮生長因子的構(gòu)建物。在本發(fā)明的第一方面，提供一種用于重組表達(dá)人表皮生長因子(hEGF)的構(gòu)建物，其從5’至3’端依次包括以下操作性連接的元件噬菌體1\啟動子，OmpA信號肽基因，人表皮生長因子基因。在一個優(yōu)選例中，所述的噬菌體啟動子來源于pBLGlu2 ;和/或所述的OmpA信號肽基因和人表皮生長因子基因的序列如SEQ ID NO :1所示。在另一優(yōu)選例中，所述的構(gòu)建物是表達(dá)載體。在另一優(yōu)選例中，所述的噬菌體1\啟動子和OmpA信號肽基因之間具有限制性內(nèi)切酶EcoRI酶切位點(diǎn)。在另一優(yōu)選例中，所述的人表皮生長因子基因的下游具有限制性內(nèi)切酶HindIII酶切位點(diǎn)。在本發(fā)明的另一方面，提供一種基因工程菌，其包含前面任一所述的構(gòu)建物。在另一優(yōu)選例中，所述的基因工程菌是大腸桿菌。在另一優(yōu)選例中，所述的基因工程菌具有氨芐青霉素抗性。在本發(fā)明的另一方面，提供一種重組表達(dá)人表皮生長因子的方法，包括培養(yǎng)所述的基因工程菌，從而表達(dá)人表皮生長因子。在另一優(yōu)選例中，先在30°C ±2°C (較佳地30±1°C)繁殖基因工程菌至菌體OD660值超過30 ;之后升高培養(yǎng)溫度至38.0±0. 5°C (較佳地38.0±0. 2°C )，使基因工程菌中所含噬菌體啟動子啟動，誘導(dǎo)分泌表達(dá)人表皮生長因子。在另一優(yōu)選例中，誘導(dǎo)表達(dá)12±2小時；較佳地12±1小時。在另一優(yōu)選例中，發(fā)酵培養(yǎng)基配方為酵母抽提物20±5g/L，蛋白胨，20±5g/L，氯化鈉1±0. 2g/L，無水硫酸鎂1±0. 2g/L，氯化銨 2±0.4g/L，硫酸銨 2±0.4g/L，磷酸二氫鈉· 3H20 O. 4125 ±O. lg/L，磷酸氫二鈉· 12H20 O. 675 ±O. 2g/L，氯化鈣 O. 02 ±O. 005g/L，1%維生素 ΒΙΟ. 2±0· 05ml/L,葡萄糖10±2g/L ;或補(bǔ)料培養(yǎng)基配方為葡萄糖650±50g/L,水解酪蛋白100±10g/L。在另一優(yōu)選例中，在發(fā)酵前，進(jìn)行種子培養(yǎng)，種子培養(yǎng)的條件是30°C ±2°C (較佳地30±1°C )培養(yǎng)12±2小時(較佳地12±1小時)。在另一優(yōu)選例中，培養(yǎng)7±1小時后開始補(bǔ)料，第I小時補(bǔ)料50ml，第2小時補(bǔ)料70ml，第3小時補(bǔ)料100ml，第4小時補(bǔ)料150ml，第5小時補(bǔ)料220ml ;之后開始誘導(dǎo)表達(dá)，同時恒速補(bǔ)料，補(bǔ)料速度240ml/小時。在另一優(yōu)選例中，誘導(dǎo)表達(dá)12±2小時(較佳地12±1小時)后發(fā)酵結(jié)束。在另一優(yōu)選例中，發(fā)酵結(jié)束后，還包括從發(fā)酵液中分離人表皮生長因子。本發(fā)明的其它方面由于本文的公開內(nèi)容，對本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言是顯而易見的。


圖I、OmpA信號肽基因和人表皮生長因子(hEGF)基因串聯(lián)基因。圖2、分泌表達(dá)質(zhì)粒pBLOmpAEGF構(gòu)建示意圖。
圖3、陽性克隆核酸電泳圖。其中，第I欄為DNA Marker，分子量由下至上分別為100bp、250bp、500bp、750bp、IOOObp和2000bp ;第2欄為陰性對照；第3欄為陽性對照；第4欄為空白；第5欄為陽性克隆。圖4、工程菌株BL0E-3發(fā)酵曲線圖。X軸為發(fā)酵時間，Y軸是菌濃度OD66tl和EGF表達(dá)量(mg/L) ο
具體實施例方式本發(fā)明人長期致力于改進(jìn)人表皮生長因子(hEGF)的表達(dá)技術(shù)，經(jīng)過深入的研究，揭示了一種新的重組表達(dá)方法，將1\啟動子、OmpA信號肽、hEGF基因串聯(lián)構(gòu)建分泌表達(dá)質(zhì) 粒，將所述分泌表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化原核生產(chǎn)菌株，利用該生產(chǎn)菌株進(jìn)行hEGF生產(chǎn)。該方法表達(dá)效率高、表達(dá)周期短，表達(dá)量超過了 450mg/L。術(shù)語如本文所用，所述的“表達(dá)構(gòu)建體(或稱DNA構(gòu)建體)”指一種已經(jīng)通過人為干預(yù)修飾，使其含有按照自然界中不存在的序列所組合和排列的DNA片段的單鏈或者雙鏈DNA分子。如本文所用，“元件”是指對于蛋白的表達(dá)有用的一系列功能性的核酸，本發(fā)明中，所述的“元件”被系統(tǒng)地構(gòu)建以形成一種表達(dá)構(gòu)建物(構(gòu)建體)。所述的“元件”的序列可以是本發(fā)明中所提供的那些，也包括它們的變體，只要這些變體基本上保留了所述“元件”的功能，其通過插入或刪除一些堿基(如l_30bp,更佳地l_20bp,更佳地I-IObp,更佳地l-5bp),或進(jìn)行隨機(jī)或定點(diǎn)突變等來獲得。如本文所用，所述的“操作性連接”或“可操作性相連”是指兩個或多個核酸區(qū)域或核酸序列的功能性的空間排列。例如啟動子區(qū)被置于相對于目的基因核酸序列的特定位置，使得核酸序列的轉(zhuǎn)錄受到該啟動子區(qū)域的引導(dǎo)，從而，啟動子區(qū)域被“可操作地連接”到該核酸序列上。如本文所用，所述的“啟動子”或“啟動子區(qū)域”，代表本領(lǐng)域所共知的含義，表示一個基因的一部分，其含有可供RNA聚合酶結(jié)合的DNA序列和轉(zhuǎn)錄的起始點(diǎn)。如本文所用，所述的“含有”，“具有”或“包括”包括了“包含”、“主要由……構(gòu)成”、“基本上由……構(gòu)成”、和“由……構(gòu)成”;“主要由……構(gòu)成”、“基本上由……構(gòu)成”和“由……構(gòu)成”屬于“含有”、“具有”或“包括”的下位概念。表達(dá)構(gòu)建物本發(fā)明提供了一種用于重組表達(dá)hEGF的構(gòu)建物，所述構(gòu)建物從5’ 一 3’依次包括以下可操作性相連的元件噬菌體1\啟動子，OmpA信號肽基因，人表皮生長因子基因。所述的噬菌體啟動子為一種溫敏強(qiáng)啟動子，其可在一定的誘導(dǎo)溫度，如42°C下啟動下游基因的表達(dá)。本發(fā)明人意外發(fā)現(xiàn)，同時應(yīng)用噬菌體1\啟動子進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)以及應(yīng)用OmpA信號肽來分泌表達(dá)，可實現(xiàn)高產(chǎn)hEGF的目的。根據(jù)所公開的信息，進(jìn)行了適當(dāng)?shù)淖兓胰匀槐Ａ羝湓泄δ艿纳鲜鲈淖儺愺w也包括在本發(fā)明中。例如，在嚴(yán)格條件下與本發(fā)明限定的序列雜交且具有相同功能的序列變異體。如本文所用，術(shù)語“嚴(yán)格條件”是指(I)在較低離子強(qiáng)度和較高溫度下的雜交和洗脫，如O. 2XSSC，0. 1% SDS，60°C ;或(2)雜交時加有變性劑，如50% (v/v)甲酰胺，O. 1%小牛血清/0. l%Ficoll，42°C等；或(3)僅在兩條序列之間的同源性至少在50%，優(yōu)選55%以上、60%以上、65%以上、70%以上、75%以上、80%以上、85%以上或90%以上，更優(yōu)選是95%以上時才發(fā)生雜交。例如，所述序列也可為這些所限定序列的互補(bǔ)序列。本發(fā)明的各元件所指向的基因的核苷酸全長序列或其片段通?？梢杂肞CR擴(kuò)增法、重組法或人工合成的方法獲得。對于PCR擴(kuò)增法，可根據(jù)本發(fā)明所公開的有關(guān)核苷酸序列，尤其是開放閱讀框序列來設(shè)計引物，并用市售的cDNA庫或按本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī)方法所制備的cDNA庫作為模板，擴(kuò)增而得有關(guān)序列。作為本發(fā)明的優(yōu)選方式，所述的OmpA信號肽基因和人表皮生長因子基因的序列如SEQ ID NO :1所示，這是經(jīng)過本發(fā)明人密碼子優(yōu)化的序列，以獲得更高的表達(dá)效率。構(gòu)建物中各元件之間還可包括限制性的酶切位點(diǎn)，這樣有利于各元件的有機(jī)連接。作為本發(fā)明的優(yōu)選方式，啟動子1\和OmpA信號肽基因之間存在限制性內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)EcoRI ;在重組人表皮生長因子的下游存在限制性內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)Hindlll。通常，所述的構(gòu)建物位于表達(dá)載體上。因此，本發(fā)明還包括一種載體，它含有所述的構(gòu)建物。所述的表達(dá)載體通常還含有復(fù)制起點(diǎn)和/或標(biāo)記基因等。本領(lǐng)域的技術(shù)人員熟知的方法能用于構(gòu)建本發(fā)明所需的表達(dá)載體。這些方法包括體外重組DNA技術(shù)、DNA合成技術(shù)、體內(nèi)重組技術(shù)等。所述的DNA序列可有效連接到表達(dá)載體中的適當(dāng)啟動子上，以指導(dǎo)mRNA合成。表達(dá)載體還包括翻譯起始用的核糖體結(jié)合位點(diǎn)和轉(zhuǎn)錄終止子。此外，表達(dá)載體優(yōu)選地包含一個或多個選擇性標(biāo)記基因，以提供用于選擇轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞的表型性狀。作為本發(fā)明的一種具體實施例，構(gòu)建了一種分泌表達(dá)質(zhì)粒pBLOmpAEGF,該質(zhì)粒被用于直接分泌表達(dá)hEGF。包含上述的適當(dāng)多核苷酸序列以及適當(dāng)啟動子或者控制序列的載體，可以用于轉(zhuǎn)化適當(dāng)?shù)乃拗鳌Ｔ诒景l(fā)明的方法中，所述的宿主是大腸桿菌。本發(fā)明還提供了包含上述構(gòu)建物的基因工程菌。用重組DNA轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞可用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的常規(guī)技術(shù)進(jìn)行，例如磷酸鈣共沉淀法，常規(guī)機(jī)械方法如顯微注射、電穿孔、脂質(zhì)體包裝等。作為一種優(yōu)選的方式，可用預(yù)冷氯化鈣處理宿主細(xì)胞再升溫至42°C作短時處理的方法進(jìn)行。作為本發(fā)明的一種具體實施例，提供了一種將分泌表達(dá)質(zhì)粒pBLOmpAEGF轉(zhuǎn)化的大腸桿菌BL21 (DE3)宿主細(xì)胞，獲得高產(chǎn)的細(xì)胞，本發(fā)明人將之命名為基因工程菌BL0E-3。該BL0E-3菌株被用于發(fā)酵培養(yǎng)和誘導(dǎo)分泌表達(dá)hEGF。較佳地，其還具有氨芐青霉素抗性。表達(dá)方法一種重組表達(dá)人表皮生長因子的方法，包括培養(yǎng)含有所述構(gòu)建物的基因工程菌，從而表達(dá)人表皮生長因子。提高h(yuǎn)EGF產(chǎn)量的關(guān)鍵在于找到合適的元件來支持其表達(dá)，本發(fā)明人反復(fù)試驗后選擇了噬菌體啟動子和OmpA信號肽基因來調(diào)控hEGF的表達(dá)，通過合適的溫度誘導(dǎo)以及分泌表達(dá)，不僅大大提高了 hEGF的產(chǎn)量，也簡化了生產(chǎn)的過程，無需進(jìn)行細(xì)胞破碎等程序。只有生產(chǎn)者多了，后續(xù)hEGF的產(chǎn)量才會更高。為了獲得大量生產(chǎn)hEGF的菌體，首先進(jìn)行培養(yǎng)菌體使之大量繁殖的過程，該過程采取較低的溫度，這樣不會立即誘導(dǎo)噬菌體
啟動子啟動下游基因表達(dá)，有利于高效地繁殖菌株。而在獲得了足夠多的生產(chǎn)者(菌體)之后，再適當(dāng)?shù)厣甙l(fā)酵液的溫度，從而使得菌體內(nèi)的噬菌體K啟動子被誘導(dǎo)，啟動下游基因的表達(dá)，并由OmpA信號肽引導(dǎo)進(jìn)行分泌表達(dá)。在摸索最佳培養(yǎng)條件時，本發(fā)明人還發(fā)現(xiàn)，若將誘導(dǎo)溫度直接升至42°C，由于1\啟動子屬于強(qiáng)啟動子，它的強(qiáng)勢啟動會使帶OmpA信號肽的hEGF在短時間內(nèi)大量表達(dá)，導(dǎo)致很多帶OmpA信號肽的hEGF因信號肽酶來不及切除OmpA信號肽并將rhEGF轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞膜外而堆積在周質(zhì)中，只有那些被加工好的，與天然EGF構(gòu)象完全一致的hEGF被分泌至培養(yǎng)基中。因此，調(diào)節(jié)這一表達(dá)、加工、轉(zhuǎn)運(yùn)過程達(dá)到平衡成了關(guān)鍵。本發(fā)明人通過細(xì)致科學(xué)的實驗，找到了 BL0E-3的較佳誘導(dǎo)溫度和誘導(dǎo)時間，在38. 0±0. 5°C誘導(dǎo)表達(dá)人表皮生長因子，誘導(dǎo)表達(dá)12±2小時。在這樣的誘導(dǎo)溫度下hEGF的表達(dá)、加工、轉(zhuǎn)運(yùn)過程達(dá)到較好的平衡，被分泌至培養(yǎng)基中rhEGF表達(dá)量也很高，超過了 450mg/L。在誘導(dǎo)表達(dá)前，還包括了培養(yǎng)菌株使之大量繁殖的過程，該過程與接種的種子菌質(zhì)量也相關(guān)。因此，本發(fā)明人在進(jìn)行發(fā)酵接種前，進(jìn)行種子培養(yǎng)，較佳地，種子培養(yǎng)的條件是300C ±2°C培養(yǎng) 12±2 小時。
作為本發(fā)明的優(yōu)選方式，針對培養(yǎng)的需要，本發(fā)明人還優(yōu)化了培養(yǎng)過程的培養(yǎng)基，發(fā)酵培養(yǎng)基配方為酵母抽提物20±5g/L，蛋白胨20±5g/L，氯化鈉1±0. 2g/L，無水硫酸鎂 1±0· 2g/L，氯化銨 2±0· 4g/L，硫酸銨 2±0· 4g/L，磷酸二氫鈉· 3H20 O. 4125±O. lg/L,磷酸氫二鈉· 1乳0 O. 675 ±O. 2g/L，氯化鈣 O. 02 ±O. 005g/L，I % 維生素 ΒΙΟ. 2±0· 05ml/L，葡萄糖10±2g/L。補(bǔ)料培養(yǎng)基配方為葡萄糖650±50g/L，水解酪蛋白100±10g/L。上述的培養(yǎng)基配方，它含有足夠的營養(yǎng)成份，配方合理，足以滿足工程菌株的營養(yǎng)所需和生產(chǎn)所需，菌體生長和繁殖速率高，培養(yǎng)周期短即可達(dá)到高的菌體濃度和hEGF濃度。培養(yǎng)基因工程菌的其它條件，如通氣量、溶氧、攪拌速度等，可采用本領(lǐng)域已知的條件。在發(fā)酵培養(yǎng)結(jié)束后，還可包括步驟從發(fā)酵液中分離hEGF。從培養(yǎng)產(chǎn)物中分離或純化hEGF可采用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的技術(shù)。例如可采用Phenyl Sepharose 6 FastFlow (high sub)、Q Sepharose High Performance 陰離子交換、Superdex 30 prep grade凝膠過濾三步法純化；或采用調(diào)pH至hEGF等電點(diǎn)4. 6后，加硫酸銨至35%飽和度，所得沉淀離心收集并溶解后再用Sephadex G50 superfine純化等。下面結(jié)合具體實施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件如J.薩姆布魯克等編著，分子克隆實驗指南，科學(xué)出版社，2002中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說明，否則百分比和份數(shù)按重量計算。除非另行定義，文中所使用的所有專業(yè)與科學(xué)用語與本領(lǐng)域熟練人員所熟悉的意義相同。此外，任何與所記載內(nèi)容相似或均等的方法及材料皆可應(yīng)用于本發(fā)明中。文中所述的較佳實施方法與材料僅作示范之用。實施例中所用到的基因、引物的合成，DNA的抽提及回收，DNA測序等，均是上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司的產(chǎn)品或提供的服務(wù)；酶、dNTPs和DNA Marker則采用了TaKaRa公司的產(chǎn)品；EGF表達(dá)量測定采用的是R&D公司的Quantikine試劑盒。實施例I、設(shè)計并化學(xué)合成OmpA信號肽基因和人表皮生長因子(hEGF)基因串聯(lián)基因
如圖I所示設(shè)計OmpA信號肽基因和人表皮生長因子(hEGF)基因串聯(lián)基因。該基因包含序列表SEQ ID NO :I中所示的DNA序列。本發(fā)明人在設(shè)計上述串聯(lián)基因時，充分遵循了以下原則選用大腸桿菌偏愛的密碼子；AT、GC含量接近且分布均勻；片段內(nèi)避免二級結(jié)構(gòu)的產(chǎn)生。串聯(lián)基因通過化學(xué)合成的方法來制備。在上述串聯(lián)基因的5’端，設(shè)計了限制性內(nèi)切酶EcoRI酶切位點(diǎn)，而在串聯(lián)基因的3’端，設(shè)計了限制性內(nèi)切酶HindIII的酶切位點(diǎn)，便于構(gòu)建分泌表達(dá)質(zhì)粒。實施例2、分泌表達(dá)質(zhì)粒pBLOmpAEGF的構(gòu)建2. I起始載體pBLGlu2的EcoRI、HindIII雙酶切處理
pBLGlu2為已知的載體，見中國專利號CN200510025289. 3。配制如下反應(yīng)混合液Iug 質(zhì)粒 pBLGlu2 ；5 μ 110 XM 緩 中液；2μ I EcoRI 限制性內(nèi)切酶(15U/y I)；2μ I HindIII 限制性內(nèi)切酶(15U/y I)；滅菌雙蒸水補(bǔ)足50 μ I。將上述反應(yīng)混合液于37°C反應(yīng)6小時，所得的反應(yīng)混合液反應(yīng)液進(jìn)行1%瓊脂糖電泳，在紫外燈下切下大條帶，用UNIQ-IO柱式DNA膠回收試劑盒回收，用50 μ I洗脫液洗脫。2. 20mpA信號肽基因和hEGF基因串聯(lián)基因的酶切處理配制如下反應(yīng)混合液I μ g OmpA信號肽基因和hEGF基因串聯(lián)基因；5 μ 110 XM 緩 中液；2μ I EcoRI 限制性內(nèi)切酶(15U/y I)；2μ I HindIII 限制性內(nèi)切酶(15U/y I)；滅菌雙蒸水補(bǔ)足50 μ I。將上述反應(yīng)混合液于37°C反應(yīng)過夜，然后進(jìn)行1%瓊脂糖電泳，在紫外燈下切下240bp左右的條帶，用UNIQ-10柱式DNA膠回收試劑盒回收DNA片段，用50 μ I洗脫液洗脫。2. 3 連接配制如下反應(yīng)混合液5 μ I 2. I中經(jīng)處理后的載體大片段；5μ I 2. 2 中經(jīng) EcoRI、HindIII 雙酶切的基因；2 μ 110 X T4DNA連接酶緩沖液；I μ I T4DNA 連接酶(350U/ μ I)；滅菌雙蒸水補(bǔ)足20 μ I。將上述反應(yīng)混合液于16°C反應(yīng)過夜。2. 4感受態(tài)細(xì)胞的制備將10μ1 Τ0Ρ10甘油菌接種至3ml LB培養(yǎng)基中，37°C 200rpm培養(yǎng)過夜，取100 μ I菌液再接入3ml LB培養(yǎng)基中，370C 200rpm培養(yǎng)至A_0. 3 O. 4，然后4，OOOrpm離心10分鐘，棄上清，菌體以預(yù)冷的鈣溶液(O. lmol/1 CaCl2)洗滌，4，OOOrpm離心10分鐘，菌體重懸于200 μ I的鈣溶液中備用。2. 5 轉(zhuǎn)化取2. 3中的連接產(chǎn)物，加入2. 4中制備的感受態(tài)細(xì)胞中，冰浴30分鐘，然后于42°C熱休克90秒，隨后加入800 μ I LB培養(yǎng)基，于37°C，IOOrpm,振搖30分鐘，取100 μ I涂布含100 μ g/ml氨芐青霉素的LB平板(瓊脂含量為1.5%)，37°C倒置培養(yǎng)過夜。2. 6獲得陽性克隆合成啟動子基因、OmpA信號肽基因和hEGF基因串聯(lián)基因的上游引物和下游引物，用于PCR反應(yīng)篩選陽性克隆，引物序列如下上游引物(19bp)·
5，AGC ACA TCA GCA GGA CGC A 3’ (SEQ ID NO 2)；下游引物(22bp)5’ CCC AAG CTT ATT AAC GCA GTT C 3’ (SEQ ID NO :3)。用無菌牙簽挑取2. 5中長出的若干菌落于3ml LB(其中氨芐青霉素的濃度為100 μ g/ml)中，在37°C，200rpm培養(yǎng)過夜，以菌落培養(yǎng)液作為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)。每個菌落培養(yǎng)液試樣按以下組合和反應(yīng)條件進(jìn)行PCR反應(yīng)。配制如下反應(yīng)混合液O. 25 μ I Ex Taq (5U/ μ I)；5 μ IlOXEx Taq 緩沖液；4 μ I dNTP Mixture ；1μ I上游引物;1μ I下游引物；1μ I菌落培養(yǎng)液；滅菌雙蒸水補(bǔ)足50 μ I。反應(yīng)條件先94°C 2分鐘，再94°C 30秒，55°C 30秒，72°C 40秒，共30個循環(huán)，然后72 C延伸5分鐘，最后降溫至4 C。PCR反應(yīng)的陰性對照用I μ I滅菌雙蒸水代替菌落培養(yǎng)液,陽性對照用2. 2中溶解的I μ I OmpA信號肽基因和hEGF基因串聯(lián)基因代替菌落培養(yǎng)液。取PCR反應(yīng)液20 μ I進(jìn)行I. 5%瓊脂糖電泳，在紫外燈下，菌落培養(yǎng)液試樣的PCR反應(yīng)產(chǎn)物于370bp左右處出現(xiàn)條帶的即為陽性克隆，見圖3。2. 7質(zhì)粒的小量抽提取陽性克隆的培養(yǎng)液10μ I接種至3ml LB培養(yǎng)基(其中氨芐青霉素的濃度為100 μ g/ml)中，37°C 200rpm培養(yǎng)過夜，用UNIQ-IO柱式質(zhì)粒小量抽提試劑盒，抽提陽性克隆的質(zhì)粒。2.8DNA序列測定以2.6中的上游引物作為測序引物，對陽性克隆進(jìn)行DNA序列測定。測序結(jié)果表明，在分泌表達(dá)質(zhì)粒pBLOmpAEGF中，啟動子基因、OmpA信號肽基因和hEGF基因的串聯(lián)基因DNA序列與設(shè)計完全一致。通過上述步驟，本發(fā)明人完成了表達(dá)質(zhì)粒pBLOmpAEGF的構(gòu)建工作。構(gòu)建重組質(zhì)粒的過程以及獲得的重組質(zhì)粒見圖2。
實施例3、工程菌株BL0E-3的發(fā)酵培養(yǎng)從實施例2獲得的分泌表達(dá)質(zhì)粒pBLOmpAEGF，按照實施例2的2. 4-2. 5中的方法轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21 (DE3)，如此獲得了重組菌株BL0E-3 ;通過正交實驗獲得了種子最佳培養(yǎng)條件，即30°C，12小時；以及獲得了發(fā)酵培養(yǎng)時最佳誘導(dǎo)溫度和誘導(dǎo)時間，即38. 2°C誘導(dǎo)12小時。以下列舉一種工程菌株BL0E-3的發(fā)酵培養(yǎng)的方法種子培養(yǎng)基為LB培養(yǎng)基。發(fā)酵培養(yǎng)基配方如下(g/L) 酵母抽提物20g/L，蛋白胨，20g/L，氯化鈉lg/L，無水硫酸鎂lg/L，氯化銨2g/L，硫酸銨 2g/L，磷酸二氫鈉· 3H20 O. 4125g/L，磷酸氫二鈉· 12H200. 675g/L，氯化鈣 O. 02g/L,I %維生素BIO. 2ml/L,葡萄糖10g/L。補(bǔ)料配方葡萄糖650g/L，水解酪蛋白100g/L。以5N氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH在7. O。取100 μ I工程菌株BL0E-3甘油菌，接入30ml LB培養(yǎng)基中(氨芐青霉素的濃度為10(^8/!111)，于301、250印111培養(yǎng)12小時，再以3% (v/v)的接種量轉(zhuǎn)接到800ml LB培養(yǎng)基中(氨芐青霉素的濃度為100 μ g/ml)，同樣條件下培養(yǎng)12小時，然后按4%的接種量接入到裝有20升發(fā)酵培養(yǎng)基的40升發(fā)酵罐中進(jìn)行發(fā)酵。初始培養(yǎng)條件設(shè)置為培養(yǎng)溫度30°C，通氣量為5slpm(標(biāo)準(zhǔn)公升每分鐘流量值；stard liter per minute) ,pH 7· 0,攪拌轉(zhuǎn)速200rpm,溶氧30%。隨著菌濃度不斷增加，逐增大通氣量至30slpm，攪拌轉(zhuǎn)速控制為200-500rpm。接種7小時后開始補(bǔ)料，第I小時補(bǔ)料50ml，第2小時補(bǔ)料70ml，第3小時補(bǔ)料100ml，第4小時補(bǔ)料150ml，第5小時補(bǔ)料220ml。接種后12小時(菌體OD660值超過30)，開始升溫誘導(dǎo)表達(dá)，將溫度設(shè)定至38. 2°C，同時開始恒速補(bǔ)料，補(bǔ)料速度控制在240ml/小時。誘導(dǎo)開始后，在不同的時間點(diǎn)取樣測定hEGF的表達(dá)量,每2小時取樣一次。培養(yǎng)24小時后放罐，按常規(guī)方法從發(fā)酵液中純化hEGF。整個培養(yǎng)過程中菌株的OD值以及hEGF的表達(dá)量如圖3所示，培養(yǎng)基中的rhEGF最高表達(dá)量可以達(dá)到452mg/L。在本發(fā)明提及的所有文獻(xiàn)都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻(xiàn)被單獨(dú)引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權(quán)利要求書所限定的范圍。
權(quán)利要求
1.一種用于重組表達(dá)人表皮生長因子的構(gòu)建物，其從5’至3’端依次包括以下操作性連接的元件 噬菌體啟動子，OmpA信號肽基因，人表皮生長因子基因。
2.如權(quán)利要求I所述的，其特征在于，所述的噬菌體啟動子來源于pBLGlu2;和/或 所述的OmpA信號肽基因和人表皮生長因子基因的序列如SEQ ID NO :1所示。
3.如權(quán)利要求I或2所述的方法，其特征在于，所述的構(gòu)建物是表達(dá)載體。
4.一種基因工程菌，其特征在于，其包含權(quán)利要求1-3任一所述的構(gòu)建物。
5.一種重組表達(dá)人表皮生長因子的方法，包括培養(yǎng)權(quán)利要求4所述的基因工程菌，從·而表達(dá)人表皮生長因子。
6.如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，先在30°C±2°C繁殖基因工程菌至菌體OD66tl值超過30 ;之后升高培養(yǎng)溫度至38.0±0. 5°C，使基因工程菌中所含噬菌體啟動子啟動，誘導(dǎo)分泌表達(dá)人表皮生長因子。
7.如權(quán)利要求6所述的方法,其特征在于,誘導(dǎo)表達(dá)12±2小時。
8.如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，發(fā)酵培養(yǎng)基配方為 酵母抽提物20±5g/L，蛋白胨，20±5g/L，氯化鈉1 + 0. 2g/L，無水硫酸鎂1 + 0. 2g/L,氯化銨 2±0. 4g/L，硫酸銨 2±0. 4g/L，磷酸二氫鈉· 3H20 O. 4125±0. lg/L，磷酸氫二鈉· 12H20 O. 675 ±O. 2g/L，氯化鈣 O. 02 ±O. 005g/L，I %維生素 ΒΙΟ. 2±0· 05ml/L，葡萄糖10±2g/L;或 補(bǔ)料培養(yǎng)基配方為葡萄糖650±50g/L，水解酪蛋白100±10g/L。
9.如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，在發(fā)酵前，進(jìn)行種子培養(yǎng)，種子培養(yǎng)的條件是30°C ±2°C培養(yǎng)12±2小時。
10.如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，培養(yǎng)7±1小時后開始補(bǔ)料，第I小時補(bǔ)料50ml，第2小時補(bǔ)料70ml，第3小時補(bǔ)料100ml，第4小時補(bǔ)料150ml，第5小時補(bǔ)料220ml ；之后開始誘導(dǎo)表達(dá)，同時恒速補(bǔ)料，補(bǔ)料速度240ml/小時。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種采用溫度誘導(dǎo)生產(chǎn)重組人表皮生長因子(hEGF)的方法。本發(fā)明將PL啟動子、OmpA信號肽、hEGF基因串聯(lián)構(gòu)建分泌表達(dá)質(zhì)粒，將所述分泌表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化原核生產(chǎn)菌株，利用該生產(chǎn)菌株進(jìn)行hEGF生產(chǎn)。該方法表達(dá)效率高、表達(dá)周期短。
文檔編號C12N1/21GK102952817SQ201110235048
公開日2013年3月6日 申請日期2011年8月16日 優(yōu)先權(quán)日2011年8月16日
發(fā)明者錢悅, 甘人寶, 侯永泰, 吳劍英, 張倩, 周慶瑋, 馮寶山, 丁紅珍, 杜鵬 申請人:上海昊海生物科技股份有限公司