專利名稱：一種大分子量t載體及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種大分子量T載體及其制備方法。
背景技術(shù)：
PCR(polymerase chain reaction)是分子生物學(xué)中的常規(guī)實驗技術(shù)。絕大多數(shù)情況下需要將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物克隆到質(zhì)粒載體上，以便對PCR產(chǎn)物進(jìn)行測序、體外轉(zhuǎn)錄、體外翻譯等操作?？寺CR產(chǎn)物的方法有很多種，但最直接的、最方便的方法是TA克隆。所謂TA 克隆就是將3’端具有單個A尾巴的PCR產(chǎn)物克隆到3’端具有單個T尾巴的T載體上。TA 克隆的理論依據(jù)是在PCR擴(kuò)增過程中，由于Taq聚合酶具有不依賴于模板的末端轉(zhuǎn)移酶活性而在PCR產(chǎn)物的3’末端添加單個脫氧核苷酸，并且偏好添加四種脫氧核苷酸中的脫氧腺苷酸，使得50%以上的PCR產(chǎn)物的3’末端具有單個脫氧腺苷酸，即3’端A尾巴。目前，T載體的制備方法有2種。第一種方法是利用產(chǎn)生平末端的內(nèi)切酶將環(huán)狀質(zhì)粒酶切成線狀質(zhì)粒，然后利用末端轉(zhuǎn)移酶將單個雙脫氧胸腺核苷酸(ddTTP)添加到線狀載體的3’端。第二種方法是在質(zhì)粒載體的多克隆位點中引入特定的酶切位點，用相應(yīng)的內(nèi)切酶酶切產(chǎn)生3’端具有單個T突出的線性T載體。前一種方法在制備T載體過程中存在加尾效率較低以及線性質(zhì)粒在加尾過程中其兩端的序列有時會被部分刪除等問題。與前兩種方法相比，第二種方法更快捷、更高效以及更穩(wěn)定。理論上，可以用來制備T載體的內(nèi)切酶包括)(CmI，Eamll05I，其中kml在制備T載體中得到廣泛應(yīng)用。其它內(nèi)切酶要么因為太昂貴，要么因為在普通的克隆載體上有太多的識別位點，因而在制備T載體中的應(yīng)用受到限制。在普通含Amp抗性的克隆載體中，例如pUC18、pBlueSCript SK載體等，都不具有kml 酶切位點，但在Amp抗性基因中含有一個Eamll05I及其同裂酶的酶切位點，因而在這些載體的多克隆位點引入)(cml位點更方便一些，這就是為什么更多人采用kml制備T載體(美國專利文獻(xiàn) US005487993A ；中國專利文獻(xiàn) CN1142279C, CN1344795A 以及 CN1362521A)。使用)(cml構(gòu)建T載體均存在一個潛在的問題部分酶切的前T載體混雜在T載體中會導(dǎo)致非重組轉(zhuǎn)化子的本底過高。目前，解決這一問題最有效的方法是在前T載體的兩個kml或兩個kml酶切位點之間引入足夠長的間隔DNA，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后將完全酶切的質(zhì)粒和部分酶切的質(zhì)粒分開。然而，引入間隔DNA后帶來的一個新問題是由于環(huán)形質(zhì)粒在瓊脂糖凝膠電泳中比起分子量相當(dāng)?shù)木€型質(zhì)粒移動得快，因而，未被酶切的環(huán)型質(zhì)粒 (前T載體，帶有間隔DNA)往往與分子量小于自身的T載體(不帶有間隔DNA)混雜，最終造成非重組轉(zhuǎn)化子的本底過高。pBlueScript II SK(+/-)載體(GenBank Accession No. X52330)是由 pUC載體派生而來的噬菌粒載體(phagemid或phasmid)，除了含有一個Amp抗性基因及一個IacZ基因作為篩選標(biāo)記外，在多克隆位點的兩側(cè)存在T3和T7噬菌體的啟動子，同時具有一個單鏈?zhǔn)删wfl的復(fù)制起點(pBlu必cript II SK(+)和pBlueScript II SK(-)的唯一區(qū)別是兩者 Π的方向相反)。ccdB 基因(GenBank Accession No. AP001918)位于 F 質(zhì)粒上，它和 ccdA 基因一起構(gòu)成F質(zhì)粒的ccd (control or cell death)位點。Ccd位點通過殺死不含F(xiàn)質(zhì)粒的大腸桿菌細(xì)胞達(dá)到穩(wěn)定F質(zhì)粒的作用。CcdB蛋白干擾大腸桿菌的DNA促旋酶，因而抵制大多數(shù)大腸桿菌菌株。但是大腸桿菌DB3. 1菌株中促旋酶的A亞基基因發(fā)生了一處突變，突變后的促旋酶可以抵抗CcdB蛋白的毒性效應(yīng)，因而含有ccdB基因的質(zhì)粒要以在DB3. 1菌株中增殖。目前，市場上常用的T載體長度都在^OObp到3100bp之間，對于長度在2500bp 至3500bp之間的片段而言，通過酶切得到的片段，很難和該類載體在電泳時長度上做出明顯的區(qū)分，不利于后續(xù)更換載體等的后續(xù)操作，很容易和載體一起回收，最終造成非重組轉(zhuǎn)化子的本底過高。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是，針對目前常用的T載體長度都在^OObp到3100bp 之間，對于長度在2500bp至3500bp之間的外源片段的克隆，存在非重組轉(zhuǎn)化子的本底過高，克隆效率較低的不足，而提供一種克隆2500bp至3500bp片段具有較高TA克隆效率的 T載體及其制備方法。本發(fā)明解決上述技術(shù)問題的技術(shù)方案如下本發(fā)明的第一方面是提供一種前T載體，是以已知載體為出發(fā)載體進(jìn)行改良后的載體，出發(fā)載體是 pBlu必cript II SK(-)，pUC18，pUC19，pUC118，pUC119，pUC19，或 pGEM 系列載體，它們的多克隆位點被替換為)(cml盒，所述的kml盒包括ccdB基因序列以及緊密連接于所述ccdB基因序列兩側(cè)的各一個kml酶切位點序列，并且出發(fā)載體中的抗性基因前和/或后插入了長度為1000 2000bp的無義序列而被延長。較佳的，所述的kml盒還包括連接于所述各一個kml酶切位點序列的除kml酶切位點序列外的酶切位點序列。更佳的，所述的)CcmI盒的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO 4, SEQ ID NO :5，或 SEQ ID NO 6 所示。出發(fā)載體中的抗性基因前和/或后插入了長度為1000 2000bp，優(yōu)選1500bp的無義序列而被延長。所謂的無義序列是指不影響載體復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、翻譯等功能的序列，例如可以是某些載體的骨架結(jié)構(gòu)，如包含AMP抗性基因的載體pJETl. 2中AMP抗性基因前后的載體骨架結(jié)構(gòu)優(yōu)選BpiI和HindIII雙酶切的結(jié)構(gòu)。更佳的，在Amp抗性基因和在其前和/ 或后插入了長度為1000 2000bp，優(yōu)選1500bp的無義序列后的DNA片段的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO 3所示。本發(fā)明的第二方面是提供一種T載體，由如上所述的前T載體經(jīng)kml或kml同裂酶酶切而得。其中，所述T載體較佳的為圖4所示的pXL-T，圖5所示的pXL01_T或圖6所示的 PXL02-T。本發(fā)明的第三方面是提供一種制備所述的前T載體的方法，包括以下步驟1) WpBlueScript II SK (-), pUC18, pUC19, pUC118, pUC119, pUC19，或 pGEM 系列載體為出發(fā)載體，在其多克隆位點引入引入)(cml盒，得到前T載體；所述的)(CmI盒包括 ccdB基因序列以及緊密連接于所述ccdB基因序列兩側(cè)的各一個kml酶切位點序列；2)將所述出發(fā)載體中的Amp抗性基因延長。
其中，步驟幻中較佳的在載體的Amp抗性基因前和/或后插入無義序列，從而延長。例如將pBlueScript II SK(-)中的Amp抗性基因用來自載體pJETl. 2的AMP抗性基因及其前后的載體骨架(如載體PJET1. 2的BpiI和HindIII雙酶切片段)替換，即得。所述的Amp抗性基因延長后優(yōu)選如序列表中SEQ ID NO 3所示的核苷酸序列。本發(fā)明的第四方面是提供所述的前T載體和T載體在基因克隆中的應(yīng)用。本發(fā)明所用的原料或試劑除特別說明之外，均市售可得。采用本發(fā)明的T載體進(jìn)行TA克隆時由于徹底解決了非重組轉(zhuǎn)化子本底過高的問題，因此大大提高了 T載體的質(zhì)量和穩(wěn)定性?？寺∑蔚倪x擇范圍更為廣泛。實驗證明本發(fā)明的T載體分別克隆2. Skb和3. 2kb的PCR產(chǎn)物的TA克隆效率在95%以上。本發(fā)明的 T載體及其制備方法將在基因工程領(lǐng)域中發(fā)揮重要的作用。


以下結(jié)合

本發(fā)明的特征和有益效果。圖1顯示用于構(gòu)建上述前T載體(pXL，pXLOl，pXL02，)的引物序列。其中左邊方框中的序列為酶切位點。圖2是實施例1的質(zhì)粒構(gòu)建示意圖。圖3是實施例2的質(zhì)粒構(gòu)建示意圖。圖4是為pXL-T的物理圖譜。圖5是pXLOl-T的物理圖譜。圖6是pXL02-T的物理圖譜。
具體實施例方式本發(fā)明的目的是提供具有較高TA克隆效率的尤其是克隆2500bp至3500bp之間的常規(guī)商業(yè)克隆載體不易于區(qū)分的片段的T載體。本發(fā)明提供一種具有較高TA克隆效率尤其是克隆2500bp至3500bp之間常規(guī)商業(yè)克隆載體不易于區(qū)分的片段的T載體及其制備方法。本發(fā)明的一T載體包括pBlueScript II SK(-)的ColEI ori序列，pBlue Script II SK(-)的 Π ori 序列，pBlue Script II SK(-)的 IacZ 基因序列，pBlue Script II SK(-)的T3噬菌體啟動子序列，pBlue Script II SK(-)的T7噬菌體啟動子序列以及分別位于兩個末端的改造過的各一個多克隆位點序列，還包括一段含有amp+基因的外源片段。 其中，所述兩個多克隆位點均具有3’突出T末端。所述含有amp+基因的外源片段除amp+ 基因外還增加了其他序列，被人為延長，從而增加整個載體的總長度，便于區(qū)分2500bp至 3500bp之間常規(guī)商業(yè)克隆載體不易于區(qū)分的片段。所述分別位于兩個末端的改造過的各一個多克隆位點序列經(jīng)過改造。其特征在于所述3’突出T末端的序列為5，· · · CCCGGGATT 3’5’ ATCTTGGG. · · 3’3，· · · GGGCCCTA 5，，3，TTAGAACCC. · · 5，改造過的多克隆位點(MCS)序列(見序列表SEQ ID NO :1所示)為GAATTC GAGCTC GGTACCC GG GGATCC* AAGATt ATCTTGG GGATCC TCTAGAGTCGAC CTGCAG* GCATGC AAGCTT
*表示單一酶切位點。所述T載體優(yōu)選為pXL-T (圖4)，pXLOl-T (圖幻或pXL02_T (圖6)。本發(fā)明的第二個目的是提供一種制備上述T載體的方法。本發(fā)明提供一種制備上述一 T載體的方法，包括以下步驟1)將pBlueScript II SK(-)中的Amp抗性基因延長，從而增加整個載體的長度。2)在步驟1)得到的載體的多克隆位點中引入kml盒，所述的kml盒包括ccdB 基因序列以及緊密連接于所述ccdB基因序列兩側(cè)的各一個kml酶切位點序列。3)用kml或其同裂酶酶切步驟2、所得的前T載體，得到T載體。所述的kml盒較佳的還包括連接于所述各一個kml酶切位點序列的除kml酶切位點序列外的酶切位點序列。所述的)(cml盒優(yōu)選如序列表中SEQ ID N0:4，SEQ ID NO: 5，或SEQ ID NO 6所示的核苷酸序列。SEQ ID NO 4由718個堿基組成；SEQ ID NO 5由 726個堿基組成；SEQ ID NO 6由712個堿基組成。所述的ccdB基因序列較佳的是序列表中SEQ ID NO 2所示的核苷酸序列。所述前T載體優(yōu)選pXL，pXLO 1或pXL02 ；所述T載體優(yōu)選pXL_T (圖4)，pXL01-T (圖 5)或 pXL02-T (圖 6)。本發(fā)明構(gòu)建的pXLxx系列前T載體以及由這些前T載體制備而來的pXLxx-T系列 T載體是基于pBlueScript II SK(-)構(gòu)建而成。具有pBlueScript II SK(-)載體的全部特性。除了含有一個IacZ基因作為篩選標(biāo)記外，在多克隆位點的兩側(cè)存在T3和T7噬菌體的啟動子，同時具有一個單鏈?zhǔn)删荭暗膹?fù)制起點。本發(fā)明中，XcmI盒中的ccdB基因具有間隔DNA和負(fù)選標(biāo)記的雙重作用。ccdB作為間隔DNA是指ccdB基因序列將兩個kml酶切位點間隔開，ccdB基因作為負(fù)選標(biāo)記基因是指含有ccdB基因的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到普通大腸桿菌菌株細(xì)胞后將殺死大腸桿菌細(xì)胞。)(CmI盒中的ccdB基因可以有三種形式第一種形式是ccdB基因與其前面的IacZ讀碼框融合，在 IacZ啟動子驅(qū)動下表達(dá)產(chǎn)生融合ccdB蛋白；第二種形式是ccdB基因的前面帶有核糖體結(jié)合位點(RBQ序列，在IacZ啟動子驅(qū)動下表達(dá)產(chǎn)生ccdB蛋白；第三種形式是ccdB基因的前面帶有自身啟動子及RBS序列，在IacZ啟動子和其自身啟動子的雙重驅(qū)動下表達(dá)產(chǎn)生ccdB 蛋白。序列表中SEQ ID NO 4, SEQ ID NO :5，或SEQ ID NO :6所示分別是這三種形式。以ccdB基因作為間隔DNA的前T載體可以在DB3. 1菌株中增殖，當(dāng)將T載體與 PCR產(chǎn)物等組成的連接體系轉(zhuǎn)化普通大腸桿菌菌株(例如DH5a，JM109，DH10B，T0P10)時， 混雜到T載體中的前T載體(包括未酶切的環(huán)型質(zhì)粒及部分酶切的線型質(zhì)粒經(jīng)連接而成的環(huán)型質(zhì)粒)會殺死大腸桿菌細(xì)胞。這樣，TA克隆過程中由前T載體造成的非重組轉(zhuǎn)化子本底過高的問題得到徹底解決。此外，一小部分T載體的T尾巴由于種種原因(例如kml及其同裂酶以及連接酶等殘存的核酸外切酶活性、反復(fù)凍融等)會被去除，去除T尾巴的T載體經(jīng)自身連接產(chǎn)生的轉(zhuǎn)化子是組成非重組轉(zhuǎn)化子本底的另一個來源。本發(fā)明的方法通過精確設(shè)計kml盒使得上述來源的非重組轉(zhuǎn)化子具有完整的IacZ讀碼框，從而可以經(jīng)藍(lán)白斑篩選去除這種非重組轉(zhuǎn)化子。本發(fā)明的載體中，人為延長了 Amp+的區(qū)域，有效增加了整個載體的總長度，從而對常見商業(yè)載體的長度缺陷做一個有利的補充。和常規(guī)商業(yè)載體的組合后，可以克隆任何長度的外援片段，達(dá)到優(yōu)勢互補。
本發(fā)明的制備T載體的方法可最大限度的降低T載體中混雜的未酶切的環(huán)型質(zhì)粒和部分酶切的線型質(zhì)粒。pXLxx-T系列前T載體是把pSK的多克隆位點進(jìn)行改造，引入2個常規(guī)篩選用位點 (BamHI或HindIII或EcoRI)以及XcmI盒。XcmI盒的核心序列如下(框中部分代表ccdB 基因序列，表示酶切割的具體位點)-ccaagatt"cctttggctcgagttcc--ccdB--ccatggca"atcttgg-3'-ggttcta"aggaaaccgagctcaagg ；--ccdB--ggtaccg"ttagaacc 5，使用)(cml內(nèi)切酶酶切pXLxx系列前T載體，酶切體系經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分離，切膠回收的大片段即是相應(yīng)的T載體。3種T載體的區(qū)別在于多克隆位點中酶切位點的種類及數(shù)量不同。其中，PXLOl-T和pXL02-T具有最少的酶切位點，可以減少高GC含量及回文結(jié)構(gòu)對體外轉(zhuǎn)錄的影響，因此這兩種載體尤其適合于對插入片段進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄。pXL-T酶切位點最多，因此可以選擇更多的內(nèi)切酶從T載體上釋放插入片段。此外，由于這3種載體上分別額外引入了一個BamHI或HindIII或EcoR I酶切位點，因此可以用BamHI或HindIII 或EcoR I單酶切從T載體上釋放插入片段，使用者可以有更多的選擇。當(dāng)制備的pXLxx-T (包括pXL-T，pXL01-T，pXL02-T)系列T載體中的一小部分由于種種原因(例如)(cml及其同裂酶以及連接酶等殘存的核酸外切酶活性、反復(fù)凍融等)其T 尾巴被去除時，這些失去T尾巴的質(zhì)粒經(jīng)自身連接后可以形成完整的IacZ讀碼框，因而可以通過藍(lán)白斑篩選的方法排除這些非重組轉(zhuǎn)化子。下面用實施例來進(jìn)一步說明本發(fā)明，但本發(fā)明并不受其限制。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件，或按照制造廠商所建議的條件。實施例1pBluescriptll SK(_)載體多克隆位點的改造和)(cml盒的引入本質(zhì)粒構(gòu)建示意圖見圖2。合成MCS_01_MCS_18，共18條引物，通過PCR將18條引物(序列如圖1所示)連接成約400bp的目的片段即MCS。以載體pENTR3C-dual (Invitrogen)為模版，擴(kuò)增得到ccdb 基因(引物如圖1所示的CCdb_F/CCdb_R)。然后通過重疊PCR，與上述400bp片段融合，得到改造后的)(cml盒。獲得MCS的PCR反應(yīng)體系為50μ L反應(yīng)體系中含5U Pfu, 0. 2mmol/LdNTPs U XPfu bufferU號和18號引物各lOymol/L、模板(1-18號引物的混合物)5ng左右；PCR擴(kuò)增的循環(huán)程序為94°C預(yù)變性 5min，(94°C，30s ；56°C, 30s ；72°C，1. 5min) X30 個循環(huán)，72°C最后延伸5min ；重疊PCR法獲得)(cml盒，模板為上述獲得的400bp MCS以及擴(kuò)增得到的ccdb 基因，擴(kuò)增引物為(MCSCCdb_F/MCSCCdb_R)(序列如圖1所示)；PCR反應(yīng)體系和程序與上述一致，在此不便贅述。瓊脂糖凝膠電泳回收約700bp的目的條帶OCcmI盒)。將回收的 PCR 產(chǎn)物和 pBluescript SK(-)載體(GenBank Accession No. X52330)分別用 PvuII單酶切，酶切產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后切膠回收。將酶切后的PCR產(chǎn)物與酶切后的pBluescript SK(-)載體建立如下連接反應(yīng)體系10 μ L連接體系中含3U連接酶 (Promega)，IX連接緩沖液，約50ng質(zhì)粒，約50ng PCR產(chǎn)物。4°C連接16小時以上。連接產(chǎn)物按照常規(guī)方法轉(zhuǎn)化到DB3.1菌株(Invitrogen)。經(jīng)酶切鑒定得到陽性菌落。陽性菌落經(jīng)測序驗證之后得到PSKMC。插入片段的測序的結(jié)果，就是kml盒，其核苷酸序列如序列表中SEQ ID N0:4所示。第1位到第145位是第一個MCS的核苷酸序列，其酶切位點分別對應(yīng)EcoRl-SacI-KpnI-SmaI-BamHI。第146位到第451位是ccdb基因的核苷酸序列。第452位到第718位是第二個MCS的核苷酸序列，其酶切位點分別對應(yīng) BamHI-XbaI-SaII-SphI-HindIII。實施例2構(gòu)建前T載體，用包含AMP+基因的pJETl. 2 (Fermentas)載體來人為延長 pBluescriptll SK(-)的amp+基因部分，從而整體延長整個載體的長度本質(zhì)粒構(gòu)建示意圖見圖3。以實施例1構(gòu)建得到的質(zhì)粒pSKMC為模板，用XL_F和XL_R引物(序列見圖1)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系為50μ L反應(yīng)體系中含5U Pfu,0. 2mmol/L dNTPs,lXPfu buffer,引物各1(^11101/1，模板51^左右；PCR擴(kuò)增的循環(huán)程序為94 °C預(yù)變性5min， (94°C，30S ；60°C，30S ；72°C，1. 5min) X 30 個循環(huán)，72°C最后延伸 5min。PCR 產(chǎn)物經(jīng)瓊 脂糖凝膠電泳后切膠回收，將回收的PCR產(chǎn)物用BsaI酶切。將pJETl. 2質(zhì)粒O^rmentas) 用BpiI和HindIII雙酶切。酶切產(chǎn)物經(jīng)1 %瓊脂糖凝膠電泳后切膠回收2. 3kb的大片段。 將酶切后的PCR產(chǎn)物與酶切后的pJETl. 2載體建立如下連接反應(yīng)體系10 μ L連接體系中含3U連接酶(Promega)，1 X連接Buffer，約50ng質(zhì)粒，約50ng PCR產(chǎn)物。4°C連接16小時以上。連接產(chǎn)物按照常規(guī)方法轉(zhuǎn)化DB3. 1菌株(Invitrogen)。經(jīng)酶切鑒定篩選得到陽性菌落，陽性菌落經(jīng)測序鑒定得到前T載體pXL。前T載體pXLOl的構(gòu)建過程除所用的PCR擴(kuò)增引物是XL01_F和XL01_R(序列見圖1)以及所使用的模板是PGH載體(生產(chǎn)商上海捷瑞生物工程有限公司Generay)外，其它步驟與PXL-T相同。前T載體pXL02的構(gòu)建過程除所用的PCR擴(kuò)增引物是XL01_F和XL01_R(序列見圖1)以及所使用的模板是PGE載體(生產(chǎn)商上海捷瑞生物工程有限公司Generay)外，其它步驟與PXL構(gòu)建相同。T 載體 pXL-T、pLXOl-T、pLX02_T 結(jié)構(gòu)如圖 4，5，6 所示，其中 pXL_T(圖 4)設(shè)計了一對用于鑒定的酶切位點BamHI，MCS上包括的酶切位點為=EcoRl-SacI-KpnI-SmaI-BamHI -ccdbBox-BamHI-Xbal-SalI-SphI-HindIII。pXLOl-T (圖 5)設(shè)計了一對鑒定酶切位點 HindiII，MCS 為 HindiII-SmaI-HindI11。pXL02-T (圖 6)設(shè)計了一對鑒定酶切位點 EcoRI，MCS 為 EcoRI-Smal-EcoRI。實施例3pXL-T系列T載體的制備及TA克隆效率分析1、制備T載體用)(cml酶切前 T 載體 pXL 或 pXLOl 或 pXL02 制備 pXL-Τ 或 pXLOl-T 或 pXL02_T。 酶切反應(yīng)體系如下20 μ L酶切體系中含3U XcmI內(nèi)酶切(購自NEB公司)，lXNEBuffer4, 大約Iyg質(zhì)粒。37°C酶切3小時后，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后切分別切膠回收大片段。切膠回收純化的大片段即是相應(yīng)的PXL-T或pXLOl-T或pXL02-T載體。2.測試TA克隆效率
權(quán)利要求
1.一種前T載體，其特征在于，是以已知載體為出發(fā)載體進(jìn)行改良后的載體，出發(fā)載體是 pBlueScript II SK (-)，pUC18, pUC19, pUCl 18，pUCl 19，pUC19，或 pGEM 系列載體，它們的多克隆位點被替換為)(cml盒，所述的kml盒包括ccdB基因序列以及緊密連接于所述ccdB 基因序列兩側(cè)的各一個)(cml酶切位點序列，并且出發(fā)載體中的抗性基因前和/或后插入了長度為1000 2000bp的無義序列而被延長。
2.根椐權(quán)利要求1所述的前T載體，其特征在于，所述的kml盒還包括連接于所述各一個)(CmI酶切位點序列的除)(CmI酶切位點序列外的酶切位點序列。
3.根椐權(quán)利要求1或2任一項所述的前T載體，其特征在于，所述的kml盒的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO 4, SEQ ID NO :5，或SEQ ID NO 6所示。
4.根椐權(quán)利要求1 3任一項所述的前T載體，其特征在于，所述的出發(fā)載體是 pBlueScript II SK(-)。
5.根椐權(quán)利要求1 4任一項所述的前T載體，其特征在于，所述的抗性基因和在其前和/或后插入了無義序列后的DNA片段的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO 3所示。
6.一種T載體，其特征在于，由如權(quán)利要求1 5任一項所述的前T載體經(jīng))(CmI或 XcmI同裂酶酶切而得。
7.根椐權(quán)利要求6所述的T載體，其特征在于，所述T載體為圖4所示的pXL-T，圖5 所示的pXLOl-T或圖6所示的pXL02-T。
8.根椐權(quán)利要求6或7任一項所述的T載體，其特征在于，所述T載體是核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO :7所示的pXL-T，核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO :8所示的pXL01_T， 或核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO 9所示的pXL02-T。
9.一種制備權(quán)利要求1 5任一項所述的前T載體的方法，包括以下步驟1)以pBlueScript II SK(-)，pUC18，pUC19，pUC118，pUC119，pUC19，或 pGEM 系列載體為出發(fā)載體，在其多克隆位點引入引入)(cml盒，得到前T載體；所述的kml盒包括ccdB基因序列以及緊密連接于所述ccdB基因序列兩側(cè)的各一個)(CmI酶切位點序列；2)將所述出發(fā)載體中的Amp抗性基因延長。
10.如權(quán)利要求1 5任一項所述的前T載體和如權(quán)利要求6 8所述的T載體在基因克隆中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種T載體及其制備方法。是以已知載體為出發(fā)載體進(jìn)行改良后的載體，出發(fā)載體是pBlueScript II SK(-)，pUC18，pUC19，pUC118，pUC119，pUC19，或pGEM系列載體，它們的多克隆位點被替換為XcmI盒，所述的XcmI盒包括ccdB基因序列以及緊密連接于所述ccdB基因序列兩側(cè)的各一個XcmI酶切位點序列，并且出發(fā)載體中的抗性基因前和/或后插入了長度為1000～2000bp的無義序列而被延長。本發(fā)明的T載體具有較高TA克隆效率，尤其對于克隆2500bp至3500bp之間的常規(guī)商業(yè)克隆載體不易于區(qū)分的片段，TA克隆效率可達(dá)100％，將在基因工程領(lǐng)域中發(fā)揮重要作用。
文檔編號C12N15/66GK102304537SQ20111021417
公開日2012年1月4日 申請日期2011年7月28日 優(yōu)先權(quán)日2011年7月28日
發(fā)明者周磊, 肖愛軍, 赫英俊 申請人:上海捷瑞生物工程有限公司